外源褪黑素对高粱苗期冷害的缓解作用研究

关键词：高粱；褪黑素；低温胁迫；生理机制；内源激素

中图分类号：S514 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2025）02-0055-09

低温是限制植物生长的最主要原因之一，对作物生产极具破坏力。作物遭受冷害时光合作用机制损伤严重，导致根系生长和养分、水分吸收显著减少，植株生物膜的膜相和渗透性发生变化，从而造成原生质停滞和细胞内溶液渗漏，扰乱离子平衡，破坏植物酶系统，影响酶活性。植物激素是调控植物生长发育的重要物质，受到低温胁迫后植物内源激素含量也会有明显变化，从而影响植株的抗寒能力。

高粱[Sorghum bicolor（L.） Moench]是世界第五大粮食作物，也是我国最早栽培的禾谷类作物之一，具有光能利用效率高、易栽培、适应性强等特点。但是，高粱苗期对低温敏感，早春寡照低温多雨天气（倒春寒）的出现会对幼苗造成低温损伤，引起植株长势弱且易感病，进而影响成熟期籽粒产量和质量。

褪黑素（melatonin，MT）是一种生长调节剂，1995年首次在植物中被发现，它的生理作用和生物学效应与天然植物激素类似，有用量小、效率高、低毒性等优势。大量研究证明，褪黑素除了可以缓解植物在生物胁迫以及非生物胁迫下的不良影响，还影响着植物的多种生理代谢过程，包括种子萌发、细胞气孔闭合、叶片光合速率等。低温情况下，植物通常会诱导内源褪黑素的合成以用于抵抗低温对植物的致命伤害，褪黑素通过增加根和地上部的物质交流来提高植株的抗寒性。由于内源褪黑素合成的局限性，外源褪黑素预处理已逐渐成为提高作物抗逆性的主要手段，施加外源褪黑素可显著增加冷胁迫下拟南芥的根长、株高和干重。Han等发现，水稻在低温胁迫下，其光合作用和光系统Ⅱ受到严重损伤，外源褪黑素预处理可以通过提高抗氧化酶活性来降低活性氧以及渗透物质的积累量，从而降低细胞损伤程度。外源褪黑素还可以通过调节植物内源激素含量来缓解生物和非生物胁迫的各种不良影响。此外，外源褪黑素还可通过改变生物钟基因的表达模式和调节冷胁迫下关键生理指标的积累模式来缓解对植物营养生长的抑制。但是，褪黑素使用浓度并非越高越好，且已报道的植物使用褪黑素的最适浓度也各有差异：Turk等使用1mmol/L褪黑素处理低温胁迫下的小麦幼苗效果最佳；Wang等通过基因敲除方式培育出缺乏内源褪黑素的番茄植株并对其进行了低温胁迫试验，表明100μmol/L外源褪黑素处理与对照组相比，可显著缓解低温损伤：Li等使用200μmol/L褪黑素处理茶树，表明褪黑素预处理可通过增强其抗氧化能力和氧化还原稳态来减少氧化损伤，从而缓解低温对茶树的不良影响。可见，褪黑素浓度会直接影响到作物在各种胁迫下的缓解效果，浓度太低达不到理想效果，浓度过高则会抑制植株生长，所以确定最适的作用浓度是外源褪黑素使用的前提。

目前使用褪黑素缓解高粱苗期干旱、盐胁迫等方面的研究已有报道，但是外源褪黑素是否能缓解低温胁迫对高粱幼苗生长的影响尚不清楚。为此，本试验通过研究外源褪黑素预处理对低温胁迫下高粱幼苗形态、光合、生理以及内源激素含量的影响，来探明外源褪黑素对低温胁迫下高粱幼苗的缓解作用机制，以有助于减轻高粱幼苗在早春低温天气下受到的不良影响。

1材料与方法

1.1供试材料

供试两个高粱品种R18（冷敏感材料）和红缨子（耐冷材料）均由贵州大学酒用原料产业研究院提供。褪黑素（C₁₃H₁₆N₂O₂）购自北京索莱宝科技有限公司，相对分子质量为232.28，分析纯。

1.2试验设计

试验于2023年7月在贵州大学农学院的人工气候室和实验室完成。选取均匀饱满的高粱种子用10%NaClO溶液浸泡消毒10min，再用蒸馏水多次冲洗后播种至育苗盆（8cm×8cm）。每盆均匀摆放20粒种子，置于培养室中常温培养（温度设定为25℃，光／暗周期为16h/8h），待幼苗长至一叶一心期开始叶片预处理，每天早晚（上午9：00;下午18：00）向地上部各喷施一次褪黑素溶液，浓度分别为0、50、100、200、300μmol/L和500μmol/L，分别用CK、MT₅₀、MT₁₀₀、MT₂₀₀、MT₃₀₀、MT₅₀₀表示，连续预处理3d。第4天将低温组幼苗放人提前预冷的人工气候箱中。低温条件：温度为（4±0.5）℃，相对湿度为75%，光／暗周期为16 h/8 h，光强为15000lx。

确定最适褪黑素浓度后，用供试2个品种设置4个处理进行后续试验，即常温对照（CK）、常温+褪黑素（CK+MT）、低温对照（LT）、低温+褪黑素（LT+MT）处理。低温或常温处理5d后取样进行相关指标测定，重复5次。

1.3测定指标及方法

1.3.1生长指标测定 每处理随机选取高粱幼苗10株，用直尺测量株高。之后，冲洗干净并擦干幼苗表面水分，使用分析天平称其鲜重，之后在80℃下烘干至恒重后称其干重。

1.3.2生理指标测定 参照李贺的方法，采用比色法测定光合色素含量，即在紫外分光光度计（安捷伦Cary3500）470、649、665nm处比色读数。叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量计算公式如下：

叶绿素a（Chl a）=13.95（OD₆₆₅）-6.88（OD₆₄₉）；

叶绿素b（Chl b）=24.96（OD₆₄₉）-7.32（OD₆₆₅）；

类胡萝卜素含量（Car）=[1000（OD₄₇₀）-2.05 Chl a-111.48 Chl b]/245。

1.3.3内源激素含量测定 委托江苏三黍生物科技有限公司运用超高效液相色谱一电喷雾串联四极杆质谱仪（UPLC-ESI-MS/MS）内标法对生长素、脱落酸、赤霉素等多种植物内源激素进行定量分析，每处理重复3次。

1.4数据处理与分析

利用SPSS 22软件对数据进行统计学分析，采用单因素方差分析（ANOVA）法对数据进行方差分析和多重比较（α=0.05），使用Origin 2022软件制图。图表中的数据为平均值±标准差。

2结果与分析

2.1不同浓度褪黑素对低温胁迫下高粱幼苗形态指标的影响

如图1所示，低温胁迫下两个高粱品种的株高、地上部干重均随着褪黑素浓度升高呈现先上升后下降的变化趋势。与常温对照（CK）相比，低温胁迫对高粱幼苗有极大的负面影响，低温处理下R18和红缨子的株高仅有CK的44.4%和49.0%，地上部干重只有CK的40.9%和43.2%。与低温对照（LT）相比，喷施不同浓度的褪黑素对低温胁迫下的高粱幼苗都具有一定的缓解作用，褪黑素浓度为200μmol/L时缓解效果最好，即R18和红缨子的株高分别增加33.5%和32.0%，地上部干重分别增加45.6%和31.5%，且其对冷敏感材料R18的缓解效果更加明显。

2.2不同浓度褪黑素对低温胁迫下高粱幼苗生理指标的影响

为进一步确定后续试验的褪黑素浓度，对不同浓度褪黑素处理下的高粱幼苗相关酶活性以及MDA含量进行测定，结果如图2所示。低温胁迫下，两个高粱品种的SOD、CAT、POD活性均随褪黑素处理浓度的增加呈先上升后下降趋势，均在褪黑素浓度为200μmol/L时达到最大值，说明200μmol/L浓度下高粱幼苗会产生大量的抗氧化酶以抵抗低温损伤。低温胁迫下，植物细胞往往会发生膜脂过氧化，造成MDA大量积累，最终造成细胞凋亡。低温胁迫下，R18和红缨子的MDA含量达到常温对照的3.5倍和2.3倍，说明冷敏感品种往往比耐冷品种受到的低温损伤更严重。外源褪黑素预处理会有效减缓MDA的积累速度，并随褪黑素处理浓度升高，其MDA含量呈先下降后上升趋势，均在200μmol/L浓度时降到最小值。以上结果证明200μmol/L褪黑素预处理是缓解高粱幼苗低温胁迫的最适浓度，故以此作为后续试验的褪黑素浓度。

2.3外源褪黑素对低温胁迫下高粱幼苗形态指标的影响

由图3和表1可知，外源褪黑素预处理对常温和低温胁迫下高粱幼苗都有一定的促进作用，但低温下的效果更明显。与CK相比，CK+MT处理对株高、根长（R18除外）和地上部地下部干重（R18除外）都有所促进，但均未达到显著差异，低温胁迫（LT）导致株高、根长和地上部地下部干重都显著降低：与LT相比，LT+MT处理高粱株高、根长和地上部地下部干重都显著增加。这说明褪黑素处理对两个高粱品种的低温损伤都有明显的缓解作用。

2.4外源褪黑素对低温胁迫下高粱幼苗光合色素含量的影响

如图4所示，R18和红缨子两个品种在低温胁迫下，其叶绿素a、叶绿素b含量和类胡萝卜素含量较CK均显著降低，褪黑素预处理下两个品种幼苗色素含量较LT处理都显著增加（红缨子类胡萝卜素含量除外）。尤其是叶绿素a含量变化最明显，与CK相比，LT处理R18和红缨子的叶绿素a含量分别下降21.8%和33.6%，喷施褪黑素处理叶绿素a含量分别回升23.7%和24.5%。常温下，褪黑素处理对两个品种的光合色素含量无显著影响。

2.5外源褪黑素对低温胁迫下高粱幼苗相关生理指标的影响

与CK相比，LT处理R18的游离脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量分别增加2.8倍、1.8倍和30%，红缨子分别增加1.8倍、1.9倍和50%。施加外源褪黑素幼苗游离脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量继续增加，与LT相比，R18的三者含量分别增加11.8%、8.9%和11.2%，红缨子的分别增加16.4%、42.7%和16.5%。说明外源褪黑素预处理可以诱导低温下高粱幼苗积累大量渗透调节物质，继而维持细胞内部环境稳态。

抗坏血酸-谷胱甘肽（ASA-GSH）循环可以维持蛋白质的稳定性，对生物膜系统结构的完整性及防御膜膜脂过氧化起重要作用。其中，谷胱甘肽是一种重要的非酶抗氧化剂，其含量多少可以有效地反映植株的抗寒能力。如图5所示，褪黑素预处理诱导低温胁迫下ASA-GSH循环相关物质的积累，与LT相比，褪黑素预处理幼苗的AsA、GSH含量显著增加，R18分别增加3.9%和8.9%，红缨子分别增加12.1%和10.5%；GR活性也显著上升，R18和红缨子分别上升28.3%和68.1%。

2.6外源褪黑素对低温胁迫下高粱幼苗内源激素含量的影响

植物内源激素是重要的生长调节因子，并在诱导植物抗寒性方面起着重要作用。当植物受到低温胁迫时，内源激素便诱导耐寒基因的表达，从而提高植物的抗寒性，此过程中通常生长素与脱落酸协同起作用，调控植物的生长发育。Zhang等研究表明，低温胁迫下小麦中的脱落酸含量增加，生长素和赤霉素含量下降，启动下游脱落酸反应中低温相关基因的表达，从而增强小麦的抗寒性，而本研究中低温胁迫下高粱幼苗内源激素含量的变化趋势与其有相同点也有不同点。本研究中，低温胁迫下褪黑素处理高粱幼苗生长素和吲哚类物质含量显著升高，脱落酸含量显著下降，并通过其他植物激素协同调控低温下的生长发育过程，这与前人的研究结果一致。本研究中赤霉素A₁、赤霉素A₃、赤霉素A₇含量的变化趋势结果不一致的原因也有待进一步探讨。

综上所述，200μmol/L褪黑素外源施加可以作为缓解低温胁迫对高粱幼苗不利影响的有效方法。此措施通过促进高粱幼苗光合色素的合成、提高抗氧化酶活性、加强细胞膜的稳定性、增加渗透调节物质含量、提高AsA-GSH循环效率以及调控多种内源激素含量来增强高粱幼苗的抗寒能力，缓解低温胁迫下的幼苗损伤。