烟草NtHSP70-2基因生物信息学及温度胁迫下的组织表达分析

关键词：烟草；HSP70热激蛋白：生物信息学；温度胁迫；基因表达

中图分类号：S572：Q786 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2025）02-0022-07

烟草（Nicotiana tabacum）是我国重要的经济作物。从大田中收获的新鲜烟叶要成为可利用的具有优良品质的商品烟叶，必须经过合理的烘烤，而烘烤特性的好坏直接决定其经济价值的高低。烤烟上部叶组织结构致密，水分含量少，导致色素降解较慢且降解不完全。生产上一般通过延长烘烤时间或者升高烘烤温度来使色素降解完全，但延长烘烤时间和提高温度会导致烟叶细胞破裂，内含物流出并附着在烟叶上面，造成热挂灰现象，给烤后产量、品质带来极为不利的影响。因此，如何提高烟叶细胞在烘烤过程中的稳定性至关重要。HSP70是热休克蛋白（heat shock protein，HSP）家族的重要成员，广泛存在于植物细胞膜、细胞质、叶绿体、线粒体等组织中，其表达水平在温度或其他胁迫条件刺激下会迅速增强，以使细胞免受胁迫和修复胁迫造成的伤害。HSP能够提高植物耐热性，一方面是通过增强HSP在生物膜上的富集防止膜脂受热变性，从而增强细胞膜结构的稳定性；另一方面是通过对变性蛋白的重组装或折叠减少蛋白变性或修复已受损的蛋白，从而维持细胞的稳定性。

HSP70-2是HSP70家族的成员之一，在辣椒、马铃薯上的研究表明其有响应温度胁迫的功能，但在烟草上还未见相关研究报道。为明确HSP70-2在烟草上是否有响应温度胁迫的功能，以及与温度胁迫的关系，本研究通过生物信息学分析对NtHSP70-2基因的生物学功能进行预测，同时进行高温和低温胁迫处理，分析其表达量变化，明确温度胁迫与NtHSP70-2表达的关系，以期为后续应用于提高烟叶细胞在烘烤过程中的稳定性奠定理论基础。

1材料与方法

1.1供试材料种植与胁迫处理

供试烟草品种为K326。选取籽粒饱满的种子，于2023年3月28日在育苗盘中播种，5月22日烟苗长至六叶一心时移栽入人工气候培养箱进行适应性培养。培养条件为光照12h、昼夜温度28/15℃。移栽4d后进行温度胁迫处理，设置高温38℃、低温4℃，并于胁迫2、12、24h时对其根、茎、叶进行取样保存，以不胁迫（0h）样品为对照（CK）。本实验所需材料及场地均由贵州省烟草品质研究重点实验室提供。

1.2实验方法

1.2.1 NtHSP70-2基因的克隆 对K326烟叶进行RNA提取，反转录得到cDNA，并以该cDNA为模板。利用SnapGene软件设计引物5’-ATGGC-CGGGAAAGGAGAAGG-3’、5’-TTAGTCCACCTC-CTCAATCTTAGGACC-3’，引物合成委托擎科生物公司进行。参照文献[17]的方法克隆NtHSP70-2基因的CDS序列。

1.2.2 NtHSP70-2基因生物信息学分析 NtH-SP70-2基因编码蛋白的理化性质、结构域、二级结构、三级结构、亚细胞定位、跨膜预测、启动子作用元件分析利用在线网站进行，具体信息见表1。

1.2.3 NtHSP70-2基因表达量测定 采用TriZol法对采集的烟苗各部位样品进行RNA提取，参照RNAprep Pure Plant Kit（TIANGEN）的操作步骤进行。使用FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix（TIANGEN）反转录试剂盒合成cDNA，所有操作步骤均在冰上完成，以防止RNA降解。利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）测定NtHSP70-2的表达量，每个样品3次重复。使用的引物以及PCR反应体系分别见表2、表3。PCR反应程序为：94℃3min;95℃5s，56.9℃10s，72℃15s，40个循环。以L25基因作为内参基因，计算Ct值，然后采用2-^ΔΔCt法计算基因相对表达量。每个样品进行3次技术重复。

2结果与分析

2.1 NtHSP70-2基因的克隆

NtHSP70-2基因的CDS开放阅读框长度为1947bp，编码648个氨基酸。运用NCBI设计引物，以烟草品种K326 cDNA为模板扩增CDS目标片段，进行胶回收后连接感受态，涂板筛选阳性克隆，测序发现扩增的目标片段与NCBI数据库下载的目标序列一致（图1）。

2.2 NtHSP70-2基因生物信息学分析

2.2.1NtHSP70-2编码蛋白的理化性质及亚细胞定位分析利用ProtParam在线网站分析Nt HSP70-2基因编码蛋白的理化性质，结果（表4）显示，NtH-SP70-2蛋白的分子式为C₃₁₁₅H₅₀₁₂N₈₆₀O₉₉₁S₂₃，分子量为71.10 kDa，理论等电点（pI）为5.13，脂肪系数为83.13，为稳定性蛋白。氨基酸成分分析结果（表5）表明，其富含酸性氨基酸（ Asp+Glu，100个）和强碱性氨基酸（Arg+Lys，82个）；丙氨酸（Ala）、谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）、赖氨酸（Lys）含量较高，分别为8.9%、8.3%、8.2%、8.2%，色氨酸（Trp）、组氨酸（His）含量较低，分别为0.5%和0.8%。蛋白亲疏水性预测表明，平均亲水性指数为-0.403，且在氨基酸组成上也是亲水性氨基酸的数量多于疏水性氨基酸，因此该蛋白为亲水性蛋白。

亚细胞定位分析结果显示，NtHSP70-2蛋白定位于线粒体中（表4），属于线粒体sHSP。线粒体sHSP在非生物胁迫下通常可以重组装受损蛋白，以此对细胞发挥保护作用。

2.2.2 NtHSP70-2蛋白结构分析 采用HMME数据库对NtHSP70-2保守结构域和跨膜结构进行分析，结果显示：NtHSP70-2不存在跨膜结构域；只有一个保守结构域（图2A），位于第9位至第618位氨基酸，而且在第521位到第541位氨基酸间存在卷曲螺旋结构，属于HSP70超家族。

利用PRABI对NtHSP70-2蛋白的二级结构进行在线预测，结果（图2B）发现该蛋白二级结构包含α-螺旋（alpha helix）、无规卷曲（random coil）、延伸链（extended strand）和β-转角（betaturn），分别占42.59%、31.64%、18.21和7.56%。利用UNIPROT对NtHSP70-2三级结构进行分析，结果如图2C所示，表明该蛋白与辣椒CaHSP70-2蛋白结构相似，推测其与CaHSP70-2有相似的功能。

2.2.3 NtHSP70-2基因启动子顺式作用元件分析 启动子元件是影响基因表达的重要因素之一，对启动子元件进行分析有助于挖掘基因的功能和表达调控机制。通过PlantCARE数据库，对NtHSP70-2基因起始密码子上游2000bp启动子序列进行分析，结果（表6）表明，Nt HSP70-2基因启动子序列除含有TATA-Box、CCAAT基本元件外，还存在非生物胁迫响应元件和激素响应元件，包括赤霉素响应元件（P-box）、茉莉酸响应元件（CGTCA-motif）、脱落酸反应性作用元件（ABRE）、应激响应元件（STER）、干旱响应相关元件（MYB），以及响应低温、高盐、干旱胁迫的顺式作用元件（DRE core）和响应逆境胁迫的元件（MYB-like sequence）。其中STER、ABRE、DREcore、MYB-like sequence、CGTCA-motif等顺式作用元件都可以响应温度胁迫，因此推测NtHSP70-2基因可以响应温度胁迫。

2.2.4 NtHSP70-2蛋白同源序列比对 烟草是茄科作物，因此我们从茄科作物数据库下载了辣椒、番茄、茄子、马铃薯的HSP70-2蛋白序列，利用DNAMAN将烟草NtHSP70-2与这些作物的HSP70-2蛋白进行同源序列比对，结果（图3）表明，NtHSP70-2序列与辣椒、马铃薯、番茄、茄子的HSP70-2序列相似度分别为94.70%、94.70%、93.75%、94.40%，相似性较高，推测它们可能有着相似的功能。

2.3不同温度胁迫下NtHSP70-2基因的组织表达分析

对高温和低温胁迫下烟苗根、茎、叶中Nt H-SP70-2的相对表达量进行测定，结果（图4）表明：NtHSP70-2基因在烟苗根、茎、叶中均有表达，叶中的表达量最高，其次是茎，根中的表达量最低：38℃高温和4℃低温胁迫均能诱导NtH-SP70-2上调表达，且在根、茎、叶中的变化趋势一致，均在处理12h时达到最高，且高温胁迫下的上调幅度高于低温胁迫。推测NtHSP70-2基因可能在提高烟草耐热性和抗寒性方面发挥重要作用。

3讨论与结论

烟草是我国重要的经济作物，烟草产业在我国国民经济中占据重要地位。在实际生产中，由于上部烟叶组织结构致密，烘烤过程中常常出现色素降解不完全的现象，而采用传统延长烘烤时间或者升高温度的方法又会导致细胞破裂而形成挂灰烟。因此，提高烟叶对温度的耐受性对其烤后品质与产量的提高有着重要的意义。

HSP70广泛存在于植物中，现已在拟南芥中鉴定出19个HSP70家族成员，在玉米中鉴定出32个HSP70家族成员，在烟草中鉴定出61个HSP70家族成员。通过对这些物种HSP70成员的鉴定发现，它们大多属于酸性蛋白质，定位于细胞质、内质网、叶绿体、线粒体中，启动子区都有响应温度胁迫的顺势作用元件STER、ABRE、DRE core、MYB-like等。本研究也发现NtHSP70-2是酸性蛋白，定位于线粒体中，启动子区包含STER、ABRE、DRE core、MYB-like sequence等顺式作用元件，说明NtHSP70-2可能也具有响应温度胁迫的功能；同源序列比对结果表明，NtHSP70-2与同属茄科的辣椒、马铃薯、番茄、茄子HSP70-2序列相似性较高，相似度在93.75%～94.70%之间。前人对番茄、茄子的研究已发现HSP70具有响应温度胁迫的功能，因此推测NtHSP70可能也在提高烟草对温度胁迫的耐受性上发挥重要作用。

前人研究发现，高温胁迫下，百合LIHSP70表达量迅速增加，可以提高植株对高温的耐受性；对莴苣幼苗进行高温胁迫，其Hsp70表达量迅速增加；低温胁迫下，小桐子JcHsp70s基因表达量显著上升，胁迫48h后JcHsp70-8、JcH-sp70-15基因表达量相较于24h时有所下降；蜡梅花E-CpHSP70-1基因过表达可提高蜡梅植株的耐热性；热和冷胁迫均可以提高玉米HSP70基因表达量。本研究结果表明，38℃高温和4℃低温胁迫下，烟草根、茎、叶中的NtH-SP70-2基因表达量迅速增加，在处理12h时达到最高，之后有所降低，总体趋势与前人研究一致，但表达量达到最高的时间点与前人研究不一致，这可能是不同作物HSP基因间的差异造成的。

综合来看，NtHSP70-2蛋白是酸性稳定蛋白，定位于线粒体，不存在跨膜结构；NtHSP70-2启动子区含有多种温度响应顺式元件，而且在烟苗根、茎、叶中的表达均受高、低温胁迫诱导上调，推测其可以响应温度胁迫，有助于提高烟草对温度胁迫的耐受性。另外，田间收获的烟叶需要烘烤才能发挥商品属性，而烘烤特性反映的是烘烤过程中烟叶水分和色素的变化。HSP70在其他作物上有调控水分和色素的功能，NtH-SP70-2基因能够响应温度胁迫，其是否也具有调控烟叶烘烤过程中色素与水分变化的功能，后续可通过创制该基因过表达和敲除突变体来进一步验证。