基于代谢组学分析LED光质对山丹组培苗的生长代谢调控

摘要：以山丹（Lilium pumilum Redouté）组培苗为试验材料，使用5种不同光质LED灯（R、B、R1B1、R1B2、R2B1）处理，以白炽灯为对照（CK），探究光质影响下山丹组培苗生长发育差异，并采用超高效液相色谱与质谱（UHPLC-MS/MS）联用技术对其进行代谢组学分析，明确差异代谢物质种类含量和相关通路变化，为山丹组培产业化生产中的光质选择提供重要的科学参考依据。结果表明，不同光质处理对山丹组培苗增殖及生长发育情况有显著影响，其中以R1B2处理综合指标较好，增殖系数为3.14、叶片为4.96张、叶片长度为1.81 cm、鳞茎直径达0.37 cm，叶色嫩绿，叶片粗厚，并有少量粗壮根生成。基于UHPLC-MS/MS非靶向代谢组学，山丹组培苗正负离子模式下共鉴定出1 406种代谢物质；比较组间共33种差异代谢物，包括8种脂类及类脂分子、9种苯丙素和聚酮类化合物、2种有机酸及其衍生物等；KEGG富集分析，比较组间共显著富集到类黄酮生物合成、新陈代谢途径2条通路。本试验阐明了光质不仅影响山丹组培苗的生长发育情况，还调控其代谢物的积累，其中R1B2处理下，山丹组培苗增殖效率更高、生长更为健壮；黄酮类物质为山丹组培苗光质胁迫下的主要差异代谢物，且R2B1处理下影响较为显著。

关键词：山丹；组培苗；光质；生长发育；代谢组学分析

中图分类号：S682.2+65.01文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2024）11-0150-10

山丹（Lilium pumilum Redouté），别称细叶百合，为百合科百合属多年生球根花卉，广泛分布于我国秦岭淮河以北地区［1］。山丹食用和药用价值丰富，其不仅含有丰富的淀粉、蛋白质、脂肪和膳食纤维［2］，亦富含生物碱、多糖、甾体皂苷及多酚类等［3］多种对人体有益的活性成分，具有止咳祛痰［4］、抗炎抗氧化［5-6］、抗癌抗抑郁［7］等功效。

发光二极管（LED）较普通光源有着耗能低、光质光强可调节、使用寿命长等优点，能更好地调控植物生长［8］。光在植物高效再生体系构建过程中，主要影响植物形态结构建立［9-10］和代谢产物积累［11-12］等2个方面。通过LED光质处理，可以影响山丹组培苗内部代谢物质含量变化，获取更多人体所需的代谢物质。

近年来，代谢组学技术在植物环境胁迫研究方面应用广泛，其主要通过测定分析生物在特定环境刺激前后代谢物组分变化，进而表现出生物体系的整体代谢特征［13］。目前在组织培养中，光质调控在影响内源激素［14］、色素［15］、皂苷［16］、酚酸类物质［17］含量等方面均有研究，从代谢组学角度系统研究山丹组培苗代谢物差异的报道较少。

本研究利用不同光质调控山丹组培苗生长代谢发育，探究比较其增殖生长情况；运用UHPLC-MS/MS技术对其进行代谢组学分析，筛选光质影响下代谢物质与代谢途径的差异，明确代谢物质含量和代谢的通路变化，为山丹组培产业化生产中光质的选择提供充分的科学参考依据。

1 材料与方法

1.1 植物材料

2022年10月，取内蒙古农业大学萨拉齐校区科技园区组培繁育实训室内健壮无污染的山丹组培苗作为试验材料。

1.2 培养条件及光质设计

将山丹组培苗切分成单株，叶片修剪至1 cm内，进行不定芽增殖生长培养，培养基配方选择 MS+KT（激动素） 2.00 mg/L+2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸） 0.10 mg/L+IAA（吲哚-3-乙酸） 050 mg/L，试验在内蒙古农业大学萨拉齐校区科技园区组培繁育实训室内进行。

培养期间，以白炽灯为对照（CK），对山丹组培苗进行不同光质的LED灯照射，试验共设计6个处理，每个处理3次重复。LED光质配比及主要参数如表1所示，控制各处理光通量密度保持一致，光照时间为15 h/d、培养温度为（25±2） ℃。

1.3 不同光质对山丹组培苗生长发育的影响

培养30 d左右，观察记录组培苗的增殖生长情况，统计比较各处理增殖芽数及增殖系数；记录其生根情况及叶片数量，并用螺旋测微尺测量其叶片长度、鳞茎直径，并对其进行质量性状描述。

1.4 代谢组学分析

培养40 d左右，将各处理样品液氮冷冻后送至深圳微科盟科技集团有限公司进行UHPLC-MS/MS代谢组学分析，每个处理设置3个生物学重复。

1.4.1 代谢物提取

将冷冻干燥的样品经液氮研磨成粉末，称取100 mg置于EP管中，加入500 μL的80%甲醇水溶液；涡旋振荡提取液后，将其静置于冰浴中5 min，后在4 ℃离心机离心20 min，最高转速为15 000 r/min；取一定量的上清液加质谱级水稀释至甲醇含量为53%，置于4 ℃离心机离心 20 min，收集上清液，转移进样，进行LC-MS分析。

1.4.2 分析仪器条件

本试验液质联用系统由德国赛默飞Vanquish UHPLC超高效液相色谱仪和德国赛默飞Orbitrap Q ExactiveTM HF-X质谱仪组成。

色谱柱：Hypesil Gold column（100×2.1 mm，19 μm）；注温：40 ℃；正模式流动相：A-0.1%甲酸、B-甲醇，负模式流动相：A-5 mmol/L醋酸铵（pH值9.0）、B-甲醇；流速：0.2 mL/min；色谱梯度洗脱程序如表2所示。

质谱离子源：ESI；样本质谱信号采集分别采用正负离子扫描模式；质荷比扫描范围：100～1 500 m/z；喷雾电压：3.5 kV；鞘气流速：35 psi；辅助气流速：10 L/min；离子传输管温度：320 ℃；辅助气加热器温度：350 ℃；极性：positive，negative；MS/MS二级扫描为数据依赖性扫描。

1.4.3 数据处理及代谢物鉴定

将下机的原始数据文件导入Compound Discoverer 3.1（CD3.1）搜库软件中进行处理。筛选保留时间、质荷比等简单参数；设置保留时间偏差、质量偏差、信号强度偏差及信噪比等信息对样品进行峰对齐、峰提取和峰面积定量。

整合目标离子，对分子离子峰和碎片离子进行分子式预测；通过比对高分辨二级谱图数据库mzCloud和mzVault以及MassList一级数据库检索（搜库），得到各代谢物的鉴定结果。

用blank样本去除背景离子，并对原始定量结果进行标准化处理，得到代谢物的相对定量结果，用于后续分析。

1.5 数据分析

将5种光质处理分别与对照组进行两两比较，分别记为R.VS.CK、B.VS.CK、R1B1.VS.CK、R1B2.VS.CK和R2B1.VS.CK。通过多元统计分析法初步分析比较组间代谢物表达差异；根据OPLS-DA模型，结合多种筛选条件，筛选出差异代谢物。根据KEGG数据库对相应差异代谢物进行相关通路富集分析。

使用Excel 2021对相关数据进行整理；相关分析通过微科盟生科云（https：//www.bioincloud.tech）和Origin 2023软件进行。

2 结果与分析

2.1 不同光质对山丹组培苗生长发育的影响

由图1、表3可知，30 d时，不同光质处理下，山丹组培苗的增殖和生长情况有显著差异。增殖方面，各处理增殖系数为R1B2＞CK＞R2B1＞R1B1＞R＞B；R1B2处理与CK、R1B1、R2B1差异不显著，但较CK增加21.71%；R、B处理下的增殖系数较CK处理明显降低。

在生长情况方面，不同指标在不同光质下表现有所差异。叶片数量上，R处理显著多于B处理，为5.91个，且较CK增加19.88%；叶片长度上，B处理显著长于R2B1处理，为2.10 cm，且较CK增加11.11%；叶片颜色和厚度上，CK处理叶色嫩绿且叶片粗厚，表现最好，相反R处理表现最差。各处理鳞茎长势情况也不尽相同，R处理显著优于CK、R1B1、R2B1处理，较CK增加20.00%，但与B、R1B2处理无显著性差异。R2B1处理在根系生长方面表现最为突出，有大量粗壮根生成；B处理则无明显根，反而产生大量愈伤组织。

2.2 不同光质处理山丹组培苗代谢组成分分析

在不同光质下的山丹组培苗中共鉴定出1 406个代谢物，其中正离子有914个，负离子有492个。所有代谢物共分成15类，包括315种脂质及类脂分子、158种苯丙烷和聚酮类化合物、142种有机酸及其衍生物、108种有机杂环化合物、91种有机氧化合物、83种苯环类化合物、52种核苷及核苷酸类似物、18种生物碱及其衍生物、18种木脂素及相关化合物、9种有机氮化合物、1种有机金属化合物、1种均质非金属化合物、1种有机硫化合物、1种混合金属/非金属化合物、1种烃类化合物、407种未分类物质。其中脂类及类脂分子数量最多，占比22.40%；苯丙烷和聚酮类化合物、有机酸及其衍生物次之，分别占11.24%、10.10%（图2）。

2.3 多元统计分析

2.3.1 主成分分析

对不同处理下山丹组培苗代谢物进行主成分分析，所得PCA散点图如图3所示，CK、R1B1、R1B2处理组内样本基本重合，R、B、R2B1处理组内样本距离稍远，但均集中在95%的置信区间中，说明各处理组内聚集较好，数据重复性高，可进行后续分析。5种光质处理均与CK处理界限明显，表明光质处理对代谢物结构差异影响较大，其中R处理与CK处理在主成分1（29.3%）上分离最大，R1B1处理与CK处理在主成分2（189%）上分离最大。

2.3.2 正交偏最小二乘法判别分析

正交偏最小二乘法判别分析是一种有监督的判别分析统计法。OPLS-DA模型验证发现，R.VS.CK比较组中"R2Y=1、Q2=0.99；B.VS.CK比较组中R2Y=1、Q2=0.97；R1B1.VS.CK比较组中R2Y=1、Q2=099；R1B2.VS.CK比较组中R2Y=1、Q2=0.99；R2B1.VS.CK比较组中R2Y=1、Q2=0.82。各比较组中R2Y、Q2这2个参数均接近于1，表明模型稳定可靠，预测有效。由图4可知，CK和光质处理明显分开且均匀分布于PC1左右两侧，说明山丹组培苗受到光质影响后，代谢产物存在显著差异。

以Q2作为检验统计量，用置换的方法求得Q2的随机分布，得到OPLS-DA模型置换检验结果（图5），各比较组的实际观测Q2值明显大于随机值，说明模型预测可信，有意义，比较组样品间代谢物存在显著差异，后续可根据VIP值来进行差异代谢物的筛选。

2.4 不同光质处理山丹组培苗差异代谢物筛选

由图6火山图可知，黄色区域为结合t检验（P＜0.05）和差异倍数（FC＞2.0或＜0.5）分析的全部差异代谢物，其中左侧下调表达，右侧上调表达。

在此基础上，依据OPLS-DA 模型，以模型变量权重值（VIPgt;1）为标准进行差异代谢物的筛选。R.VS.CK共筛选出497种差异代谢物，且上调278种，下调219种；B.VS.CK共筛选出235种差异代谢物，且上调113种，下调122种；R1B1.VS.CK共筛选出538种差异代谢物，且上调277种，下调261种；R1B2.VS.CK共筛选出481种差异代谢物，且上调256种，下调225种；R2B1.VS.CK共筛选出254种差异代谢物，且上调102种，下调152种。

2.5 不同光质处理山丹组培苗差异代谢物分析

根据韦恩图（图7）分析，R.VS.CK、B.VS.CK、R1B1.VS.CK、R1B2.VS.CK 和 R2B1.VS.CK间存在33种共有差异代谢物，包括 8种脂类及类脂分子、9种苯丙烷和聚酮类化合物、2种有机酸及其衍生物、1种有机杂环化合物、2种苯环类化合物、5种有机氧化合物、1种木脂素及相关化合物、1种有机氮化合物和4种未分类化合物（表4）。

由组间共有差异代谢物热图（图8）可知，细叶远志苷 A等18种代谢物受光质影响呈现下调趋势；儿茶素等15种代谢物则在光质调控下表现出上调趋势。

2.6 不同光质处理山丹组培苗代谢通路分析

对于分组间的差异代谢物（t检验，P＜0.05），基于KEGG数据库进行代谢通路富集分析，其中代谢通路的 ORA，P＜0.05，则差异代谢物显著富集。

由图9可知，R与CK处理组间差异代谢物富集到了83条代谢通路，有18条显著富集；其中核苷酸代谢、氨基酸的生物合成、黄酮和黄酮醇的生物合成3条最为显著，分别参与了6、8、4种差异代谢物。B.VS.CK差异代谢物富集到了49条代谢通路，有11条显著富集；其中β-丙氨酸代谢、嘧啶代谢、黄酮和黄酮醇生物合成3条最为显著，分别参与了3、4、3种差异代谢物。R1B1.VS.CK 差异代谢物富集到了110条代谢通路，有39条显著富集；其中代谢途径、氨基酸生物合成、黄酮和黄酮醇生物合成3条最为显著，分别参与了96、15、6种差异代谢物。R1B2.VS.CK差异代谢物富集到了108条代谢通路，有26条显著富集；其中氨基酸的生物合成、代谢途径、苯丙素生物合成3条最为显著，分别参与了13、84、8种差异代谢物。R2B1.VS.CK差异代谢物富集到了38条代谢通路，有9条显著富集。其中不饱和脂肪酸的生物合成、壁酸生物合成、类黄酮生物合成3条最为显著，分别参与了3、3、3种差异代谢物。

通过分析，5个比较组共有类黄酮生物合成、新陈代谢途径2条显著富集通路，其中槲皮素、儿茶素等11种差异代谢物（P＜0.05）显著富集到了类黄酮生物合成通路中，且R2B1处理下整体差异更大。结果表明，光质处理影响山丹组培苗代谢产物的积累，以黄酮类化合物为主。

3 讨论

光质在组织培养中具有重要的调控作用，相关研究发现，在植物生长发育阶段，相较于红光、蓝光，红蓝复合光更能促进植物生长及形态建立［18］。

本试验结果发现，单色光处理抑制山丹组培苗增殖情况，红蓝复合光处理则明显促进其增殖，与杨晓芬等的结论［19］不同，推测原因是品种不同导致对光质敏感度不同。生长发育方面，红色光质更能促进叶片数增加，蓝色光质则能提高组培苗叶片生长，整体而言蓝色光质处理组培苗生长效果最好，R1B2处理次之，结果与王玉英等的研究［20］一致。单色光质处理有利于山丹组培苗形成愈伤组织，红蓝复合光质处理则利于山丹组培苗生根壮根。B处理下组培苗形成愈伤组织量优于其他处理，与任跃英等对人参愈伤组织的研究结果［16］一致。R2B1处理下组培苗生根情况优于其他处理，与廖多思等探究黄杯杜鹃生根情况的结论［21］一致。

光质作为影响植物生长发育的重要环境因素，不单单表现在影响植物外部形态方面，更重要表现在调控内部代谢物质的积累。非靶向代谢组学技术可以较系统地检测出样本中所有能检测到的代谢物分子，进而通过生物信息学分析，寻找环境胁迫[CM（21]下植物体特异表达代谢物。田凯莉基于多种代谢组学手段，分析发现蓝色光质处理更有利于铁皮石斛组培苗初级代谢产物（糖类、脂类、有机酸等）的积累，而 R2B1 光质配比处理则对次级代谢产物（酚类物质为主）含量有显著促进作用［22］。李琪通过代谢组学分析LED光质对金线兰组培苗代谢物的影响，发现各处理间相对含量变化明显的物质主要包括氨基酸类、有机酸类、酚类等次生代谢物，红蓝复合光更利于代谢物积累，其中R1B1组最佳［23］。本研究发现复合光质处理下差异代谢物数更多、含量更高，和前者试验结果一致。

黄酮类化合物具有抗炎抗癌、抗氧化等功效，百合属植物中含量丰富。焦灏琳等对卷丹鳞茎进行酚类物质鉴定，发现表儿茶素、芸香苷和二氢槲皮素为主要成分［24］；靳磊等比较分析岷江百合与兰州百合酚类物质组成，分析儿茶素、芸香苷等在岷江百合中占比较大，兰州百合中则没食子酸含量相对较高，山丹组培苗中山柰酚、槲皮素等含量占比较大［25］。王珺儒等对苦荞芽在不同光质下的黄酮含量进行测定，发现芸香苷、槲皮苷、槲皮素在蓝光处理下含量较高［26］。郭佩瑶等以红花檵木愈伤组织为材料，发现蓝光更有利于黄酮总含量的增加［27］。本试验通过光质处理发现，大部分黄酮类物质较白炽灯处理呈现出明显上调趋势，且显著影响黄酮类合成途径，以R2B1处理最佳。

综上所述，光质调控山丹组培苗生长发育过程中，R1B2处理下，增殖系数最大，为3.14；R处理下，叶片数量最多，为5.91张；B处理下，叶片平均长度最大，为2.10 cm；鳞茎则无明显差异；R2B1处理下，组培苗生根情况最好。R1B2处理综合指标较好，增殖系数为3.14、叶片为4.96张、叶片长度为 1.81 cm、鳞茎直径达0.37 cm，叶色嫩绿，叶片粗厚，并有少量粗壮根生成。本试验利用非靶向代谢组学技术，对不同光质处理下山丹组培苗中的代谢产物进行差异变化分析，共鉴定出1 406种代谢物；其中山柰酚等33种为不同光质处理下山丹组培苗中稳定表达且有显著差异的代谢物质；差异代谢物则显著富集到类黄酮生物合成、新陈代谢途径2条代谢通路，以R2B1处理差异表达更显著。研究表明，R2B1光质处理会对山丹组培苗次生代谢产物（黄酮类物质为主）积累影响更显著，可为后续山丹工厂化生产提供理论基础。

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