冠菌素提高番茄对番茄黄化曲叶病毒抗性的分析

摘要：番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）在生产上是一种毁灭性病害，而目前针对该病害尚无有效的防治措施。冠菌素可在植物抗逆反应中发挥一定作用，然而冠菌素提高番茄对TYLCV抗性的研究还鲜有报道。为探究冠菌素提高番茄抗番茄黄化曲叶病的机制，以番茄感病品种浦粉一号为试验材料，在盆栽试验中，通过qPCR的方法来检测叶片中TYLCV病毒含量，分别采用氮蓝四唑还原法、愈创木酚比色法和紫外吸收法测定超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）的活性，通过实时荧光定量PCR测定抗性相关基因表达量。在田间试验中，利用卷尺、游标卡尺等测定番茄植株叶片数、茎粗、开展度，并统计病情指数和植株发病率。结果表明，冠菌素处理显著降低TYLCV含量约83.5%（Plt;0.000 1），显著增加了POD、SOD的活性（Plt;0.0001、Plt;0.05），上调编码叶绿素a/b结合蛋白基因Cab-1A和Cab-1D，诱导番茄抗病信号通路上FLS2和PR-1a1上调表达。田间试验结果表明，冠菌素处理降低了植株平均病情指数和发病率，并显著增加了番茄植株的开展度（Plt;0.000 1）。综上所述，冠菌素可以降低番茄植株叶片中TYLCV含量，影响番茄抗氧化酶活性并增加抗性相关基因的表达量。研究结果可为冠菌素在番茄抗TYLCV过程中的应用提供理论依据。

关键词：冠菌素；番茄；番茄黄化曲叶病毒；基因表达；抗性反应

中图分类号：S436.412.1+1文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2024）11-0116-06

番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）属双生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus），该病毒侵染植物初期可以引起植株叶片变黄、变小、变脆并向上卷曲，感病后期植株整体变形、焦枯，果实成熟慢且多畸形果，严重影响番茄果实的产量和品质。该病毒在自然界由烟粉虱传播，在生产上是一种毁灭性病害，因此受到广泛研究和关注［1-2］。目前，生产中采用多种农业措施防治TYLCV，但是防治效果较差，且化学防治容易造成农药滥用和环境污染。

冠菌素（COR）是丁香假单胞菌分泌的次生代谢物，分子式为C18H25NO4，相对分子质量为319，具有与茉莉酸相似的结构和生理功能［3］。一方面，病原菌分泌的冠菌素可以通过激活植物体NAC转录因子，抑制与水杨酸代谢相关的基因，并进一步降低水杨酸的积累，增强病原体的致病性［4-5］。另一方面，冠菌素可以提高植物在非生物逆境下的抗性，缓解高温、干旱和低温等环境胁迫对植物造成的不利影响。例如，冠菌素通过调控氮代谢和叶绿体中的光合蛋白，维持小麦植株在热胁迫下的光合作用，降低热胁迫对小麦产量的影响［6］；浓度为 1 μmol/L 的冠菌素处理玉米植株可以提高植株的根干质量和根面积，从而提高玉米植株应对干旱胁迫的能力［7］。冠菌素还可以调控棉花幼苗的抗坏血酸-谷胱甘肽循环系统，增加棉花幼苗营养器官中抗坏血酸含量并清除过多的过氧化氢，以提高棉花幼苗抗低温的能力［8］。上述研究表明，冠菌素在植物抗逆反应中发挥一定作用，然而冠菌素提高番茄对TYLCV抗性的影响还鲜有报道。

本试验以番茄感病品种浦粉一号作为试验材料，以去离子水处理的感病品种作为对照组，通过盆栽试验检测冠菌素处理后接种TYLCV的各种抗性指标，通过田间试验统计冠菌素处理番茄后各组植株的叶片数、茎粗、开展度和病级，并计算病情指数和发病率，以期为冠菌素在番茄抗TYLCV中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试番茄感病品种为浦粉一号，由上海富农种业有限公司提供。

番茄黄化曲叶病毒毒株侵染性克隆TYLCV-SH2，由浙江大学周雪平教授所在实验室提供。

1.2 盆栽试验和田间试验设计

盆栽试验：将种子置于25 ℃的环境中催芽，经过大约48 h后，将出芽种子播种到基质体积比为草炭 ∶蛭石 ∶珍珠岩=3 ∶1 ∶1的穴盘中。待番茄长大到2张真叶时，把番茄幼苗移栽到花盆中继续生长。生长大约3周后，番茄植株的地上部长到3～4张真叶，然后随机分成2组，分别用混合有助剂（004%Silwet L-77）的0.1 μmol/L冠菌素［西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司］和去离子水对番茄叶片进行外源喷施处理。处理24 h后，使用 1.0 mL 的医用注射器将农杆菌浓度为5 000万CFU/mL（D600 nm=0.5）的GV3101（TYLCV-SH2）接种于供试番茄幼苗地上部子叶以下1～2 cm茎杆处，进行韧皮部注射接种，每株接种0.5 mL农杆菌菌液。对照植株接种农杆菌空载体GV3101。病毒侵染后7 d，从处理的番茄植株顶部向下数第3张真叶上采集幼嫩叶片，用于本试验中病毒含量、抗氧化酶活性和基因表达量的测定。盆栽试验均进行3次生物学重复。

田间试验：试验于2022年6—10月进行。试验棚室位于上海市浦东新区上海富农种业有限公司（121.54°E，31.22°N）的塑料大棚，试验棚室长50 m，矢高4.2 m，跨度12 m。灌溉方式为滴灌。试验采用单因素完全随机区组设计，以去离子水处理的植株作为对照（CK），以冠菌素喷施的植株作为处理组。利用喷壶喷施混合有助剂（0.04%Silwet L-77）的0.1 μmol/L冠菌素到植株叶片表面，直至叶片表面出现凝珠。处理后18 d进行病情指数和性状指标采集。处理组番茄在生长期间不施杀虫剂和病毒防控药剂，其他田间管理按照当地常规栽培措施进行。

1.3 抗性指标测定与分析

1.3.1 番茄叶片中病毒含量的测定

通过qPCR的方法来检测叶片中TYLCV病毒的含量。将采集到的叶片样本迅速放入液氮速冻保存。使用DNA提取试剂盒［生工生物工程（上海）股份有限公司］对采集的叶片进行DNA提取。qPCR检测使用SYBR荧光染料（TaKaRa公司）在实时荧光PCR系统（Bio-Rad公司，美国）上完成。选用Actin基因（LOC101260631）作为内参基因，qPCR仪的设定程序如下：94 ℃预变性30 s；94 ℃变性10 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，设置40个循环。采用CFX ManagerTM软件（version 3.0，Bio-Rad，CA，United States）分析溶解曲线数据。SlACTIN基因的引物序列见表1中Actin的引物序列。将CK中TYLCV含量设定为1。检测TYLCV所用的引物序列正向引物为：5′-CACTCAATTCAGGCAGTAAATCC-3′，反向引物为：5′-GACCCACTCTTCAAGTTCATCTG-3′。

1.3.2 番茄叶片中抗氧化酶活性的测定

称取03 g液氮研磨后的叶片样品，分别置于10 mL离心管中，加入50 mmol/L pH值为7.8的磷酸缓冲液 6 mL，摇匀后冰浴30 min。然后将离心管置于 4 ℃、10 000 r/min 的离心机中离心10 min，上清液即为提取的粗酶液，置于4 ℃冰箱中保存备用，用于超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）的活性测定［9］。

1.3.2.1 SOD活性测定

测定方法采用氮蓝四唑（NBT）还原法。反应体系为50 mmol/L pH值7.8磷酸缓冲液、130 mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液、750 μmol/L 氮蓝四唑（NBT）溶液，20 μmol/L核黄素和100 μmol/L EDTA-Na2溶液［10］。其中一支管作对照管，将其加入核黄素后立即用双层锡箔纸包裹放置于黑暗处。然后，把其他各管置于光照处 30 min，黑暗终止反应。以空白管调零，测定反应液在560 nm处的吸光度（D560 nm）。

1.3.2.2 POD活性测定

POD活性测定采用愈创木酚比色法。酶反应体系：50 mmol/L磷酸缓冲液（pH值为5.5）50 mL，加入28 μL愈创木酚加热搅拌均匀，待到冷却后加入19 μL 30%过氧化氢制成愈创木酚反应液，混匀后倒入棕色瓶（现配现用）。取0.1 mL磷酸缓冲液和3 mL反应液混合调零，0.1 mL 酶液和3 mL反应液于470 nm处测定 3 min 内吸光度的变化［10］。以3 min内平均每分钟D470 nm变化值表示酶活性大小，并换算成U/（g·min）。

1.3.2.3 CAT活性测定

CAT活性测定采用紫外吸收法。反应体系：1.5 mL 50 mmol/L pH值为7.8的磷酸缓冲液、20 μL酶液或沸水浴煮死的酶液、1 mL 蒸馏水，最后加入0.3 mL 0.1 mol/L H2O2启动液混合均匀，用石英比色皿于240 nm处，每隔 10 s 读数1次，测定3 min内吸光度的变化［10］。酶活力以1 min内D240 nm减少0.1的酶量为1个酶活单位，并换算成U/（g·min）。

1.3.3 实时荧光定量PCR（Real-Time qPCR）基因差异表达分析

将采集到各组样本叶片至于液氮中研磨，然后取100 mg混合均匀的样品，采用Trizol法提取总RNA。利用反转录试剂盒将总RNA反转录得到cDNA。利用Primer 5设计5对引物（表1），测定不同样本中基因包括Cab-1D、Cab-1A、FLS2和PR-1a1的表达量，选用Actin（LOC101260631）作为内参基因。在CFX96实时荧光定量分析仪（Bio-Rad上海有限公司）上进行 RT-qPCR反应。反应程序：95 ℃预变性30 s；95 ℃ 变性5 s，60℃退火延伸30 s，共设置40个循环。对得到的数据采用2-ΔΔCT法计算基因相对表达量，试验设置3次生物学重复。

1.4 田间试验调查方法

利用卷尺、游标卡尺等测定番茄植株叶片数、茎粗和开展度，在处理后18 d记录不同处理组的各项性状指标，调查5株后取平均值。

病情调查分级：0级，无病毒症状，全株无病；1级，1%～25%的植株出现病毒症状（矮小、叶片畸形等），心叶出现花叶症状；3级，26%～50%的植株出现病毒症状（矮小、叶片畸形等），植株有1/3左右的叶片呈现花叶等症状；5级，51%～75%的植株出现病毒症状（矮小、叶片畸形等），全株叶片出现花叶症状，全株株型是健株的1/3～1/2；7级，76%～100%的植株出现病毒症状（矮小、叶片畸形等；全株叶片萎缩，畸形）。计算病情指数。

番茄黄化曲叶病发病率=发病株数/总株数×100%。

1.5 数据统计与分析

测得的数据通过GraphPad Prism version 9.0.0 for Windows（www.graphpad.com）分析，在单因素方差分析后执行Tukey多项比较检验，并通过该软件制图。

2 结果与分析

2.1 COR处理抑制叶片中TYLCV的含量

前人的研究表明，茉莉酸可以诱导植物的系统性抗性［11］，而冠菌素（COR）结构与茉莉酸结构类似，有必要检测冠菌素是否也具有诱导番茄增强抗性达到抑制病毒积累的功能。由图1可知，冠菌素处理后接种TYLCV，7 d后检测病毒相对含量比对照病毒含量显著减少（Plt;0.000 1），冠菌素处理后的番茄植株叶片中TYLCV相对含量相比对照（CK）下降83.5%。说明冠菌素处理可以诱导提高番茄植株的抗性，显著降低番茄叶片中TYLCV的含量。

2.2 COR处理后接种TYLCV影响番茄抗氧化酶活性

为进一步揭示冠菌素促进番茄提高对TYLCV抗性的机制，对冠菌素处理后番茄叶片中抗氧化酶的活性进行检测。SOD、POD和CAT是植物体内重要的清除活性氧的酶系。SOD能催化O-2·转化为H2O2和O2，清除细胞中多余的O-2·。CAT和POD可进一步将H2O2转化为O2和H2O。抗氧化酶活性测定结果（图2）表明，当番茄植株用冠菌素处理后接种TYLCV，植株叶片中POD、SOD的活性显著增加（Plt;0.000 1、Plt;0.05），而CAT的活性显著降低（Plt;0.000 1），表明冠菌素处理可以显著影响番茄植株叶片中的抗氧化酶活性。其中，冠菌素处理后番茄叶片的POD活性增幅最大，相较于CK增加168.22%，SOD活性增加8.15%，而CAT活性降低60.59%。上述结果表明，冠菌素处理可以显著影响番茄叶片中抗氧化酶活性，并对POD活性的影响最大。

2.3 施用COR后接种TYLCV对叶片光合作用相关基因表达的影响

植物光合作用是植物赖以生存的基础，植物光合色素是光合作用的重要参与者，在植物转化光能成为化学能的过程中发挥着重要作用。在光合作用中，捕光色素叶绿素a/b结合蛋白具有吸收光能和推动电子传递链的作用。通过检测编码叶绿素a/b结合蛋白的基因Cab-1A和Cab-1D的表达量，结果表明，在冠菌素处理后接种TYLCV组的Cab-1A和Cab-1D相对表达量分别上调约2.57倍和3.33倍（图3）。上述结果表明，冠菌素处理后接种TYLCV番茄植株可通过上调合成叶绿素a/b结合蛋白基因的表达来影响植物光合作用。

2.4 施用COR后接种TYLCV对番茄抗病信号通路相关基因表达的影响

植物抗病信号途径在植物抵御病原微生物侵染中起着非常重要的作用。本研究分别选取了植物中编码上游抗病信号途径中的模式识别受体FLS2（flagellin-sensing 2）的基因［12］和编码下游抗性植物病程相关蛋白PR1（pathogenesis-related protein 1）的基因［13-14］进行检测。研究结果（图4）显示，COR处理与CK相比，PR-1a1和FLS2的表达量均增加，其中PR-1a1的相对表达量增加7583倍。上述结果暗示COR可能通过诱导植物抗病信号通路相关基因的表达以促进对TYLCV的抗性。

2.5 不同处理的番茄病级指数统计分析

为进一步验证冠菌素是否在田间也具有提高番茄对TYLCV抗性的效果，本研究通过田间试验进行验证。通过施用浓度为0.5 mmol/L的冠菌素处理感病番茄品种，18 d后对田间番茄植株进行病级指数统计，结果（表2）表明，未经冠菌素处理的番茄植株平均病情指数为7.63，平均发病率为30.95%；冠菌素处理后番茄植株的平均病情指数为1.74，平均发病率为12.21%。上述结果表明，冠菌素对番茄黄化曲叶病具有一定防效，可以降低植株平均病情指数和平均发病率。

2.6 不同处理间性状指标统计分析

试验随机抽选各组处理的番茄植株，对开展度、茎粗和叶片数进行性状指标检测，结果（图5）显示，冠菌素处理后番茄植株的叶片数比未经冠菌素处理组显著增加（Plt;0.05）；2个处理的茎粗指标没有显著差异。在开展度指标方面，冠菌素处理番茄植株的开展度较CK显著增加（Plt;0.000 1），约为CK的2倍。

3 讨论与结论

冠菌素是由丁香假单胞菌分泌的一种化合物，具有与茉莉酸相似的结构和生理功能。研究表明，冠菌素可以提高植株在非生物逆境下的抗性，而冠菌素对番茄抗TYLCV的影响还鲜有报道。本试验结果表明，冠菌素处理可以降低TYLCV在番茄叶片中的含量。在植物体中，活性氧不仅可以作为直接对抗胁迫的物质，同时也作为细胞信号物质在抗性反应中发挥重要作用［15］。前人对TYLCV的番茄抗性基因MAPK3功能的研究表明，在该基因过表达的植物体中，H2O2的积累下降，同时POD、SOD和CAT的活性增加［16］。本试验对活性氧测定的结果表明，相较于CK，冠菌素处理的POD、SOD活性呈显著上升趋势，CAT活性呈显著下降趋势。考虑到植物清除活性氧是一个动态变化过程，而在本研究中仅选取了一个时间点，结果显示为POD、SOD及CAT活性呈不同变化趋势，只能说明冠菌素处理影响了番茄体内的活性氧平衡，而具体机制还需要未来继续研究。

研究表明，番茄黄化曲叶病可抑制植株的光合作用，影响植株的生长和产量。在被TYLCV侵染的植株中，与光合作用相关的基因下调表达［17］。前人的研究表明，外源冠菌素处理可通过调控氮代谢和叶绿体中的光合蛋白，维持小麦植株在热胁迫下的光合作用，降低热胁迫对小麦产量的影响［6］。而另一项研究表明，冠菌素处理的番茄植株中，与光合作用中光系统Ⅰ（PSⅠ）和光系统Ⅱ（PSⅡ）相关的基因表达被抑制［18］。而在本研究中，冠菌素处理可以诱导编码叶绿素a/b结合蛋白的基因Cab-1A和Cab-1D上调表达（图3）。光捕获叶绿素a/b结合蛋白（LHCB）是光系统Ⅱ（PSⅡ）光捕获复合体的脱辅基蛋白，该蛋白具有吸收光能和推动电子传递链的作用［19］。光敏色素捕捉到光能后，可以促进LHCB基因的表达，而氧胁迫等环境胁迫可以降低该基因的表达［20］。试验结果表明，冠菌素处理接种TYLCV后，基因Cab-1D和Cab-1A上调表达，表明冠菌素可能在番茄与TYLCV互作过程中通过提高植株光合效率来减小TYLCV侵染对光合作用的影响。光合作用是非常复杂的生物化学过程，冠菌素处理可以影响与光合作用相关基因的不同表达，但是相关的机制还需要进一步探究。

PR1和FLS2是植物抗病信号途径中的2个重要蛋白。FLS2是植物中第1个被鉴定的植物模式识别受体，可以识别细菌鞭毛蛋白N端的保守多肽（flg22），产生模式触发的免疫（PAMP-triggered immunity，PTI）［21］。令人感兴趣的是，接种TYLCV的冠菌素处理FLS2基因上调表达，说明FLS2可能还在植物与病毒互作的过程中具有一定的功能，但是机制需要进一步阐明。本研究发现，PR-1a1基因在冠菌素处理后相较于CK表达量显著增加，在烟草花叶病毒侵染的植株中，PR-1b1基因被局部强烈激活［22］。在被黄瓜花叶病毒侵染的番茄植株中，PR-1a1、PR-1b1等抗性基因被激活表达［23］。这些结果说明冠菌素处理提高番茄对TYLCV的抗性与激活植物抗病信号途径相关。

最后，通过田间试验发现，冠菌素处理的植株病情指数降低，植株发病率降低，且植株开展度增加。再次验证了冠菌素可提高番茄对番茄黄化曲叶病的抗性，说明冠菌素对番茄黄化曲叶病具有一定的防效。本研究结果可为进一步研究冠菌素在农业生产中的应用奠定基础。

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