马铃薯StNAC6基因克隆及干旱胁迫表达分析

摘要：NAC对植物种子发育、细胞分裂分化、侧根形成等都有直接影响，它与DNA元件相结合发挥作用，能够有效提高植物的抗逆性。通过PCR方法从马铃薯冀张薯8号中克隆获得了1个StNAC6基因，并对StNAC6基因进行生物信息学分析，包含序列比对、理化性质预测、进化分析等。使用冀张薯8号组培苗作为试验材料，用浓度为10%、15%和20%的聚乙二醇6000（PEG-6000）处理0、6、12、24 h后，分析干旱胁迫下的表达模式，并在马铃薯开花期，采取不同的组织（花、根、茎、叶、块茎、葡匐茎）进行组织表达分析。结果表明，马铃薯NAC6基因全长为876 bp，共编码291个氨基酸，包含1个NAM结构域；等电点为7.04，相对分子量为33.619 15 ku；StNAC6蛋白均含有丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸3种氨基酸磷酸化位点，属于不稳定亲水性蛋白；StNAC6第74、262位氨基酸存在N-糖基化位点；预测StNAC6定位于细胞核。荧光定性PCR结果显示，在不同含量PEG胁迫处理下，马铃薯StNAC6基因的相对表达量不相同，存在明显差异，说明该基因参与干旱应答响应；StNAC6基因在马铃薯茎、花中的相对表达量最高，说明其可能参与马铃薯生长调控。研究结果可为今后深入探究马铃薯NAC6转录因子的功能和调控机制奠定基础。

关键词：马铃薯；NAC6；基因克隆；干旱胁迫；NAC转录因子

中图分类号：S532.034文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2024）11-0051-10

马铃薯是茄科茄属草本植物，在国内外广泛种植，目前己成为世界上仅次于玉米、水稻和小麦的第四大粮食作物。目前，由于马铃薯在农业生产发展中具有重要地位，我国正在大力推进马铃薯主食化［1］。但马铃薯在种植和生产过程中经常遭受干旱等逆境胁迫，造成大面积减产，带来严重的经济损失。因此，培育抗逆马铃薯新品种成为农业生产和农业研究的重要方向［2-4］。NAC转录因子是植物中独特的调节蛋白，NAC来源于矮牵牛的NAM基因、拟南芥中克隆出来的ATAF1/ATAF2、CUC1/CUC2基因，名称来自三者的首字母［5-6］。

NAC家族共有的显著特点是在N端存在1段高度保守的序列（约150个氨基酸），可以划分为5个亚结构域（A～E亚结构域），主要参与DNA与其他蛋白相结合，取名为NAM结构域［7］，所有包含该结构域的区域均可以命名为NAC转录因子。同时，A、C、D亚结构域高度保守，C端呈现高度变异的转录激活区，这可能是NAC基因功能多样化的原因［8-13］。NAC是高等植物中具有多种特性的转录因子家族，对植物的种子发育、细胞分裂分化、侧根形成等都有直接影响，它通过和DNA元件的融合控制下游一系列基因的表达，是提高植物抗逆性的高效途径之一［7，14-16］。通过转基因技术可以调控NAC在植物中的表达，并培育出具有抗旱性的优质新品种，从而提高农作物的耐旱性。近年来，随着研究人员对NAC转录因子研究的不断深入，发现NAC在各种植物生长发育过程中参与了重要的调控作用，并且在植物应对一系列非生物侵害（如干旱胁迫、高盐、低温等）及植物对致病菌入侵等生物胁迫的抗逆反应中也具有非常重要的调控作用［8］。通过RNAi、过量表达等相关技术对NAC基因的功能进行研究发现，不同植物的NAC转录因子可以通过直接参与或者经正向、负向调控干旱、盐碱等一系列非生物胁迫应答基因的表达而发挥重要作用［17］。对水稻NAC家族基因进行分析，发现了35个上调表达基因、15个下调表达基因响应干旱胁迫，在水稻中过量表达抗旱耐盐基因SNAC1后，转基因植株抗旱性与结实性均提高［18］。在水稻中过表达ONAC106、ONAC022基因，均能在一定程度上表现出对冷、干旱和高盐耐受性的单一表型或者综合表型。在拟南芥中，超表达异源NAC成员，也可以表现出相同的规律［8，19-28］。研究发现，在拟南芥中采用酵母单杂交技术过表达ANAC055、ANAC019、ANAC072/RD26基因后，下游多个胁迫应答基因被诱导，正向调控了植株的抗旱能力［29］。转ANAC072/RD26基因植株响应脱落酸（ABA），参与ABA的信号途径，提高了植株对干旱的耐受性［30］。在大豆中鉴定出31个GmNAC基因，其中9个可以响应干旱胁迫，且已有研究发现GmNAC20和GmNAC11受到干旱、盐、冷胁迫的诱导而上调表达［31］。在小麦中过表达SNAC1后，同样正向调控了小麦的抗旱性、耐盐性［32］。在拟南芥、烟草中过表达TaNAC2基因后，能够明显提高植株对干旱的抵抗力［13］。通过研究发现，SlNAC4基因在番茄中过量表达后，转基因植株更容易受到干旱和盐胁迫抑制［33］。过量表达小麦TaNAC69基因后，提高了其在逆境胁迫下的存活率［34］。

目前在拟南芥、木薯、杨树、烟草、大豆、水稻、黄瓜、藜麦等多个物种中均已相继发现NAC家族，并进行了相关研究［13，34-42］。但在马铃薯中有关NAC的研究鲜有报道。在马铃薯中NAC功能的研究，最初源于NAC基因，该基因能够感应马铃薯晚疫病的侵染［43］。张丽等将HaNAC1基因转化马铃薯，最终显著提高了马铃薯转基因植株的抗逆性［44］。蒙露露等发现，StNAC2基因参与Cd胁迫响应［45］。通过比较马铃薯干旱表达量分析及干旱复水后表达量分析的方法，巩檑等发现StNAC72基因可以参与干旱及水分刺激信号的传递过程［46］。也有研究发现，通过Y2H酵母双杂交系统筛选互作蛋白，初步确定有23个候选基因可能与马铃薯StNAC262互作［47］。以上研究结果表明，NAC是提高作物抗逆性的候选基因，然而目前对马铃薯NAC家族的研究正处于起步阶段，需要通过大量基因克隆和功能验证来分析所有参与逆境胁迫应答的NAC基因的调控模式与分子作用机制。

本研究拟通过美国国家生物技术信息中心（NCBI）网站进行序列查找和分析，从抗旱品种冀张薯8号中克隆马铃薯StNAC6基因，并进一步对目的基因进行生物信息学分析和干旱诱导表达分析，从而初步明确StNAC6基因的生物学功能及在提高植物抗逆性中的作用，为马铃薯新品种选育创制抗逆材料提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验时间及地点

选取马铃薯冀张薯8号为研究材料，于2023年4月种植于河北省张家口市张北喜顺沟基地，采用正常田间管理，选取开花时期，花、根、茎、叶、块茎、葡匐茎6个组织用液氮速冻后备用。聚乙二醇（PEG）胁迫处理于河北北方学院旱作农业研究中心组培中心实验室完成。

1.2 试验材料与试验处理

使用冀张薯8号组培苗，用浓度为10%、15%、20%的PEG处理0、6、12、24 h后，将5株植物混合后取样，试验重复3次，在液氮中速冻后存放于 -80 ℃，提取RNA，将RNA反转录为cDNA，用于分析干旱胁迫下的表达模式。在马铃薯开花期，采取不同的组织（花、根、茎、叶、块茎、葡匐茎）进行表达模式分析。

1.3 马铃薯NAC6基因的扩增

用Primer Premier 6.0对马铃薯NAC6基因进行引物设计，得到如下引物序列：StNAC-F，5′-ATGACTCAAGATGTGCAAT-3′，StNAC-R，5′-TAATTCCAGGAACATAGECCAA-3′。25 μL PCR反应体系：1 μL StNAC-F，1 μL StNAC-R，1 μL cDNA，2.5 μL 10×LA Buffer，4 μL 10 mmol/L dNTP Mix，0.25 μL LA Taq，15.25 μL ddH2O。PCR反应程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35次循环；72 ℃ 10 min。

1.4 生物信息学分析

将获得的测序结果使用表1中的数据库进行生物信息学分析；用DNAMAN、MEGA 7对马铃薯NAC6和其他生物的NAC进行比较及同源进化分析。

1.5 StNAC6基因的实时定量PCR

用Primer Premier 6.0对马铃薯NAC6基因进行查找并设计引物（StNAC-F：5′-ACTAGACAAGGCCAAATGCAA-3′，StNAC-R：5′-ACCCCATAGCTATACCTTGGA-3′），以elongation factor 1-α为内参基因（Ef1a F：5′-GATGTTGTGCCAAAGGATGT-3′，Ef1a R：5′-AACTTGTGGTCAATGCGAGA-3′），20 μL qPCR反应体系如下：1 μL cDNA、7 μL ddH2O、各 1 μL上下引物、10 μL SYBRPremix MIX。反应条件：94 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环。检测基因在各个组织中的相对表达量时，将茎中的相对表达量设为1，在干旱胁迫下进行表达分析时，以未处理的材料（0 h）作为对照，相对表达量设为1，用2-ΔΔCT方法进行计算和分析，用GraphPad Prism 9软件绘图。

2 结果与分析

2.1 马铃薯StNAC6基因的克隆

以未作处理的植株cDNA为模板，用特异引物对StNAC-F、StNAC-R从马铃薯中克隆获得全长为876 bp的基因序列，它们编码291个氨基酸，详见图1、图2。NCBI-CDD检索结果表明，在N端具有高度保守的NAM（第9～130位氨基酸）结构域（图3），为NAC类转录因子所特有，表明该基因属于NAC家族成员。

2.2 StNAC6蛋白的序列比对和进化树的构建

对不同物种（拟南芥、紫花苜蓿、番茄、杨梅、油菜、鹰嘴豆、茶、木豆）的NAC进行蛋白质序列比对，图4结果表明，N端均含有NAC保守结构域，A～E代表NAC中5个保守的亚结构域，为NAC家族基因的典型特征，而在C端存在较大差异。通过MEGA 7.0软件的Neighbor-Joining法构建StNAC6与其他9种植物的同源蛋白系统进化树。如图5所示，其中StNAC6与MrNAC5（AFY26893.11）、BnNAC（AIA57507.1）、CaNAC5（ACS94038.1）、CSNAC2（XP_004161162.1）、CcNAC1（AHJ38168.1）的分子进化距离最近，关系最密切，之后分别与MSNAC2（AER45737.1）、SINAC（AAR88435.1）处在另一分支上，分别与AtNAC1（NP_188170.1）、SNAC1（ABD52007.1）在另一个分支中。

利用在线MEME程序，预测10个物种NAC蛋白的10个保守基序。结果表明，motif的长度为 11～50 aa。10个物种的NAC蛋白中均含有相同的motif（motif 1～motif 4），结构域存在多种组成形式，有4～10个数量不等的motif。每个分支成员的motif组成相对保守，基因结构较为相似。

2.3 StNAC6蛋白理化性质分析

对StNAC6蛋白的理化性质预测结果显示， 该蛋白的氨基酸数量为291个，相对分子质量为33619 15 ku，理论等电点为7.04；StNAC6不稳定系数为56.8，平均亲水性系数为-0.680，属于不稳定亲水性蛋白（图6）。StNAC6蛋白含有3种氨基酸磷酸化位点（21个丝氨酸、9个苏氨酸和7个酪氨酸），其中第284位氨基酸的分值（0.986）最高（图 7-a）。用NetNGlyc 1.0 Services预测StNAC6蛋白的糖基化位点，结果显示，第 74、262位氨基酸存在N-糖基化位点（图7-b）。亚细胞定位预测结果表明，马铃薯StNAC6定位于细胞核中（表2）。

2.4 StNAC蛋白质二级结构、三级结构的预测

StNAC6主要由4种构象组成（α-螺旋、β-转角、延伸链和无规则卷曲），详见表3、图8。其蛋白二级构造以无规则卷曲为主，氨基酸数量为204个，占比为70.10%。其次是α-螺旋，有40个，占比为13.75%，延伸链有37个，占比为12.71%，α-螺旋、延伸链的占比相当。仅有3.44%的序列表现为β-转角结构，数量有10个。将二级结构预测结果与三维结构模型（图9）进行对比，发现该三级结构主要由无规则曲线组成，结果表现统一。

2.5 马铃薯StNAC6基因在干旱胁迫下的诱导表达

用qRT-PCR方法分析马铃薯StNAC6基因在干旱胁迫下的表达模式，由图10可以看出，与0 h相比，在10%、15%、20% PEG-6000处理下，StNAC6基因均能被诱导表达。用10% PEG-6000处理后，茎叶中StNAC6的相对表达量出现升高趋势，在12 h时达到峰值，为未处理时的27.6倍，且具有显著差异；用15% PEG-6000处理后，茎叶中StNAC6的相对表达量呈上调趋势， 而根中StNAC6的相对表达量受到抑制。用20% PEG-6000处理后，与对照相比，茎叶中StNAC6的相对表达量呈上调趋势，在24 h时达到峰值，为对照组的323倍，具有显著差异。上述结果表明，不同程度的干旱胁迫均能够在不同程度上诱导StNAC6基因的表达。

2.6 StNAC6基因的组织特异性分析

分别取花、根、茎、叶、块茎、葡匐茎用于检测StNAC6基因在不同组织中的表达情况，图11显示，StNAC6基因在马铃薯不同部位的相对表达量存在差异。将StNAC6基因在茎部的相对表达量设为1，StNAC6在马铃薯中相对表达量的排序为茎＞花＞块茎＞叶＞根＞葡匐茎。值得注意的是，StNAC6基因在茎中相对表达量最高，在花中的相对表达量次之。因此推测，StNAC6基因在马铃薯生长发育过程中可能参与调控马铃薯的生长发育，并在不同部位发挥不同作用。

3 讨论与结论

NAC转录因子已被广泛关注， 并取得诸多研究进展，根据已有报道，NAC不仅参与植物的生长发育和农作物品质改良等，而且在植物抗逆性等方面有重要作用［37-38］。前人研究发现，亲水性蛋白不仅在传递活性物质的过程中扮演着很重要的角色，同时亲水性蛋白在各个植物及各种环境中也起到了重要作用。例如，亲水性蛋白能够增强植株的抗逆性，当植株处于失水条件下时，亲水性蛋白能够在一定程度上对抗因缺水造成的伤害，但目前有关作用机制的研究尚不深入［39，48-49］。

本研究将克隆得到的马铃薯StNAC6与已报道的其他物种的相关基因进行进化树分析，发现其与MrNAC5（AFY26893.1）、BnNAC（AIA57507.1）、CaNAC5（ACS94038.1）、CsNAC2（XP_004161162.1）、CcNAC1（AHJ38168.1）在同一分支。已有研究证实，CcNAC1基因与植物的生长及抗逆性相关［50］；经过干旱胁迫、盐胁迫后，过表达CaNAC5的拟南芥种子中的丙二醛含量低于野生型拟南芥，脯氨酸含量明显提高，展现了较低的失水速率和更高的存活率［51］。BnNAC家族基因受温度、盐等胁迫及ABA诱导作用调控，而且可以促进侧根形成，因此推测马铃薯StNAC6基因与以上基因具有相似功能［52］。另外，在保守motif分析中发现，10个物种的NAC拥有相同的motif，说明NAC基因在进化中比较保守。

典型的NAC转录因子蛋白具有保守的、能与靶基因结合的N端区域，根据序列结构特征可以将基序分为A～E等5个保守度不同的亚结构域。本研究克隆的NAC6基因包含1个保守的NAM结构域，与已有研究结果相符，StNAC6也有5个鲜明的亚结构域，表明此基因属于NAC家族成员［46］。蛋白质主要是利用初级结构氨基酸序列来建立二级、三级结构，蛋白质的三级结构与二级结构相比要更加复杂，它用于表示蛋白质所有肽链的空间三维结构，最终二级结构、三级结构分析结果表明了其功能相同［53-54］。本研究结果和NAC043、NAC072基因的分析结果一致，推测其具有相似的抗性功能，具体需要进行更深入的研究。

在不同浓度的干旱胁迫下，均能不同程度地诱导StNAC6基因的表达，这与对沙东青AmNAC6、水稻OsNAC6、大豆GmNAC、小麦TaNAC基因等的研究结果［19，31-32，55］一致。与已报道的在其他物种中水稻OsNAC应答干旱和耐盐性［56-57］，水稻SNAC1响应干旱胁迫并增加了谷物产量，玉米ZmSNAC1在植物应答干旱胁迫中发挥重要作用等生物学功能验证一致，证明转录因子NAC可应答干旱胁迫，初步推断NAC6基因在马铃薯面对干旱胁迫时可能具有重要的调节作用［58-59］。荧光定量PCR在不同组织中的表达分析发现，马铃薯StNAC6基因在不同的组织部位均有表达，其中在茎、花中的相对表达量较高，证明马铃薯NAC6基因可能参与生长发育调控过程。总体而言，马铃薯NAC6基因的上调具有严格的时间依赖性，在不同浓度的PEG干旱处理下，马铃薯StNAC6基因的表达水平呈现出不同表现，分别在不同的处理时间点达到峰值，在应答快慢上有所差异，根据表达特性的反应分析结果可以推测，马铃薯NAC6基因参与对干旱胁迫的响应，其响应程度可能取决于响应部位及施加胁迫的时间和严重程度。

本研究获得的StNAC6基因为响应干旱胁迫和生长发育提供了新的证据，但是同样需要加深在抗逆性方面的研究，有助于在过量表达转基因、基因沉默和分子标记辅助育种等各个方面进行深入研究。

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