高压均质联合酶法破除条斑紫菜细胞壁工艺研究

摘要：为建立一种有效的条斑紫菜细胞破壁工艺，释放出细胞中更多的营养物质，从而更好地促进人体的消化吸收，以连云港地区的条斑紫菜为原料，以蛋白质和多糖的总得率为评价指标，利用高压均质法和酶法相结合的方法对条斑紫菜细胞进行破壁处理，在单因素试验的基础上采用正交试验进行优化，进一步得出条斑紫菜细胞破壁的最优工艺条件，并通过光学显微镜观察破壁前后条斑紫菜细胞的破坏效果。结果表明，在最优的辅助处理方式组合条件下，先经过高压均质再用纤维素酶酶解处理后的紫菜细胞破壁效果良好，最佳的工艺条件为均质压力100 MPa、均质次数8次、料液比1∶20、纤维素酶的添加比例2%、酶解时间3 h、酶解温度50 ℃、酶解pH 5，在此最优工艺条件下，条斑紫菜的蛋白质和多糖总得率为40.12%，在光学显微镜下观察到大部分条斑紫菜细胞破损严重，有细胞内容物析出。试验数据证明了高压均质联合酶法破除条斑紫菜细胞壁可以显著提高条斑紫菜的蛋白质和多糖得率，对条斑紫菜细胞壁具有明显的破坏效果。

关键词：条斑紫菜；破壁；酶解；高压均质

中图分类号：TS201.1""""" 文献标志码：A"""" 文章编号：1000-9973（2024）10-0074-07

Study on Technology of Breaking Cell Wall of Porphyra yezoensis by

High-Pressure Homogenization Combined with Enzymatic Method

GAO Zi-xin， MA Yong， YANG Jin-yu， YANG Liu-ying， WANG Ze-cheng，

CHEN Ze-xu， PAN Sai-kun*

（School of Ocean Food and Biological Engineering， Jiangsu Ocean University， Lianyungang 222005， China）

Abstract： In order to establish an effective technology for breaking the cell wall of Porphyra yezoensis， release more nutrients from the cells， and promote digestion and absorption in the human body better， with Porphyra yezoensis from Lianyungang area as the raw material， the total yield of protein and polysaccharide as the evaluation indexes， high-pressure homogenization method combined with enzymatic method is used to break the cell wall of Porphyra yezoensis. On the basis of single factor test， orthogonal test is used for optimization， and the optimal technological conditions for breaking the cell wall of Porphyra yezoensis are further obtained， and the destructive effect of Porphyra yezoensis cells before and after breaking the cell wall is observed by optical microscope. The results show that under the optimal combination of auxiliary treatment methods， the wall-breaking effect of Porphyra yezoensis cells treated with high-pressure homogenization firstly and then cellulase hydrolysis is good. The optimal process conditions are homogenization pressure of 100 MPa， homogenization frequency of 8 times， solid-liquid ratio of 1∶20， cellulase addition proportion of 2%， enzymatic hydrolysis time of 3 h， enzymolysis temperature of 50 ℃ and enzymatic hydrolysis pH of 5.Under the optimal technological conditions， the total yield of protein and polysaccharide of Porphyra yezoensis is 40.12%. In the optical microscope， it is observed that most of Porphyra yezoensis cells are badly

damaged and the content of cells is separated out. Through the test data， it is proven that" breaking the cell wall of Porphyra yezoensis by high-pressure homogenization combined enzymatic method could significantly improve the yield of protein and polysaccharide of Porphyra yezoensis， and has obvious destractive effect on the cell wall of Porphyra yezoensis.

Key words： Porphyra yezoensis; cell wall breaking; enzymatic hydrolysis; high-pressure homogenization

条斑紫菜（Porphyra yezoensis）是我国沿海地区一类具有重要经济价值的海洋藻类，其味道鲜美、风味独特，并且含有大量的蛋白质、维生素、膳食纤维等营养元素和多糖、藻胆蛋白、多肽等生物活性成分[1]。另外，条斑紫菜还具有降血压[2]、降血脂[3]、抗氧化[4]、抗肿瘤[5]、提高人体免疫力等功效[6]，是一种具有较高食用和药用价值的海洋藻类植物。

尽管条斑紫菜有很多优势，但是在进行高值化、大规模利用方面仍然存在着很多问题。和其他藻类一样，条斑紫菜中的营养物质和活性成分大多存在于细胞内，条斑紫菜细胞结构紧密，破壁难度大，在破壁的过程中还要保证其主要的营养物质和生物活性不被破坏，因此，藻类细胞破壁成为细胞内容物提取的关键环节[7]。郭锁莲等[8]利用响应面分析法优化纤维素酶对螺旋藻细胞的酶解破壁工艺，在最优的条件下螺旋藻细胞的破壁率达到85.2%。刘春延等[9]使用高压均质技术破除灵芝孢子细胞壁，破壁率平均值为94.35%。Olmstead等[10]研究表明，高压均质法适用于高浓度（质量分数20%～25%）的微藻料液。在压力800 MPa下均质10次，小球藻的油脂提取率约达到90%。

综上所述，经破壁处理能有效提高内容物的溶出及利用效率，高压均质法和酶法都对海洋藻类细胞壁的破坏有一定的效果，为了使蛋白质和多糖的总得率最高，本文采用高压均质联合酶法的技术对条斑紫菜细胞进行破壁处理，在单因素试验的基础上进行正交试验优化，并用光学显微镜观察其破壁情况。

1 试验材料与方法

1.1 材料与试剂

原料：脱腥条斑紫菜，实验室自制。

主要试剂：纤维素酶（1.0×104 U/g），购于山东隆科特酶制剂有限公司；考马斯亮蓝G-250、乙醇（95%）、磷酸（98%）、牛血清蛋白（BSA，纯度≥99.0%）、硫酸（ρ=1.84 g/mL）、苯酚（5%）、葡萄糖等，均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

1.3 条斑紫菜细胞破壁工艺流程

脱腥条斑紫菜片→超微粉碎→过筛→加水调浆→高压均质→酶解→灭酶→冷冻干燥→粉碎。

1.4 操作要点

将脱腥后的条斑紫菜粉过100目筛，准确称取10 g，按照一定的比例与水混合制成一定浓度的紫菜悬浊液，用0.1 mol/L的盐酸或0.1 mol/L的NaOH溶液调节pH值。

将制成的紫菜悬浊液搅拌均匀后，倒入高压均质机内以不同的均质机压力和次数进行均质。

均质结束后加入不同质量的纤维素酶，放入恒温水浴锅中，调整酶解温度和时间，酶解结束后98 ℃水浴灭酶10 min，待冷却后，以4 000 r/min离心10 min，提取上清液，测定蛋白质和多糖的含量。

参考邬应龙等[11]的方法，将紫菜悬浊液进行冷冻干燥，并进行粉碎备用。

1.5 条斑紫菜蛋白含量的测定方法

参考柳荫等[12]的方法，即考马斯亮蓝法进行测定，吸取100 μg/mL的牛血清标准蛋白液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL于具塞试管中，加入蒸馏水至1.0 mL，分别加入5.0 mL考马斯亮蓝试剂。盖住试管后振荡混匀，静置2 min后采用1 cm光径的比色皿在595 nm波长处测定吸光值，以牛血清标准蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到线性回归方程：y=0.007x+0.015，R2=0.993 9，见图1。蛋白质得率按式（1）计算：

蛋白质得率（%）=提取液蛋白质质量（μg）原料质量（μg）×100%。

（1）

1.6 条斑紫菜提取液多糖含量的测定

参照林靖莹等[13]的方法，即苯酚-硫酸法并加以改进，分别吸取100 mg/L标准葡萄糖溶液0，0.1，0.3，0.5，0.7，0.9 mL于具塞试管中，用蒸馏水补至1.0 mL，然后向每个试管中加入1.0 mL浓度为5.0%的苯酚溶液，迅速加入5.0 mL浓硫酸，静置8 min左右后，将试管放入30 ℃水浴锅中反应20 min，待反应完全后利用紫外可见分光光度计在490 nm处测吸光度，以葡萄糖标准溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得到线性回归方程：y=8.747 1x+0.008 6，R2=0.999 1，见图2。多糖得率按式（2）计算：

多糖得率（%）=提取液多糖质量（mg）原料质量（mg）×100%。

（2）

1.7 条斑紫菜提取液总得率的计算

条斑紫菜提取液的总得率按式（3）计算：

总得率（%）=蛋白质得率（%）+多糖得率（%）。（3）

1.8 不同辅助处理方式组合对蛋白质和多糖得率的影响

建立5组对比试验，固定料液比1∶25、均质压力80 MPa、高压均质次数6次、纤维素酶添加量2%、酶解时间3 h、酶解温度40 ℃、酶解pH 6，考察不同辅助处理方式组合对蛋白质和多糖得率的影响。第一组作为对照组，不均质、不酶解，第二组只进行高压均质，第三组只进行酶解，第四组先均质后酶解，第五组先酶解后均质。

1.9 高压均质联合酶法对条斑紫菜细胞破壁的单因素试验设计

1.9.1 均质压力对蛋白质、多糖得率的影响

固定紫菜细胞悬浊液的料液比1∶25、高压均质次数6次、纤维素酶添加量2%、酶解时间3 h、酶解温度40 ℃、酶解pH 6，研究不同均质压力（0，20，40，60，80，100，120 MPa）对条斑紫菜细胞破壁效果的影响。

1.9.2 料液比对蛋白质、多糖得率的影响

固定高压均质机的均质压力80 MPa、均质次数6次、纤维素酶添加量2%、酶解时间3 h、酶解温度40 ℃、酶解pH 6，研究不同料液比1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35对条斑紫菜细胞破壁效果的影响。

1.9.3 高压均质次数对蛋白质、多糖得率的影响

固定高压均质机的均质压力80 MPa、料液比1∶25、纤维素酶添加量2%、酶解时间3 h、酶解温度40 ℃、酶解pH 6，研究不同高压均质次数2，4，6，8，10，12，14次对条斑紫菜细胞破壁效果的影响。

1.9.4 酶添加量对蛋白质、多糖得率的影响

固定高压均质机的均质压力80 MPa、料液比1∶25、均质次数6次、酶解时间3 h、酶解温度40 ℃、酶解pH 6、研究不同纤维素酶添加量1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%对条斑紫菜细胞破壁效果的影响。

1.9.5 酶解温度对蛋白质、多糖得率的影响

固定高压均质机的均质压力80 MPa、料液比1∶25、均质次数6次、纤维素酶添加量2%、酶解时间3 h、酶解pH 6，研究不同酶解温度30，35，40，45，50，55，60 ℃对条斑紫菜细胞破壁效果的影响。

1.9.6 酶解时间对蛋白质、多糖得率的影响

固定高压均质机的均质压力80 MPa、料液比1∶25、均质次数6次、纤维素酶添加量2%、酶解pH 6、酶解温度40 ℃，研究不同酶解时间0.0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 h对条斑紫菜细胞破壁效果的影响。

1.9.7 酶解pH对蛋白质、多糖得率的影响

固定高压均质机的均质压力80 MPa、料液比1∶25、均质次数6次、纤维素酶添加量2%、酶解时间3 h、酶解温度40 ℃，研究不同酶解pH 4，5，6，7，8对条斑紫菜细胞破壁效果的影响。

1.10 高压均质联合酶法对条斑紫菜细胞破壁的正交试验设计

根据单因素试验结果，分析对均质压力、料液比、均质次数、酶添加量、酶解温度、酶解时间、酶解pH的变化，用SPSS 22软件进行数据分析，选取均质压力、均质次数、酶添加量 3个影响显著的因素，以总得率为评价指标，设计三因素三水平正交试验优化破壁工艺参数。其余工艺条件选择单因素试验最优值。

1.11 数据处理

每组试验均重复3次，试验数据采用SPSS 22软件进行显著性分析，Plt;0.05表示差异显著；折线图和柱状图均采用OriginPro 2018软件绘制。

1.12 光学显微观察与分析

取3组样品利用显微镜在1 000倍油镜下观察细胞壁的破损情况，第一组样品是未经过粉碎的干条斑紫菜片，首先用镊子截取一小部分置于载玻片上，然后用滴管滴入适量蒸馏水，盖上盖玻片；第二组样品是经过超微粉碎的条斑紫菜粉，将样品与蒸馏水均匀混合，用吸管吸取一部分置于载玻片上，盖上盖玻片；第三组样品是经过高压均质联合酶法试验得出最佳破壁效果后的紫菜匀浆，用吸管吸取一部分置于载玻片上，为避免细胞之间重叠，滴入适量蒸馏水稀释。

2 结果与分析

2.1 辅助处理方式组合对蛋白质和多糖得率的影响

由图3可知，与对照组相比，选取的4种破壁处理方式对蛋白质和多糖的得率均有影响。由只进行酶解和只进行高压均质的预试验可以得出，在一定条件下，只进行高压均质的总得率约为只进行酶解总得率的1.07倍，条斑紫菜经过高压均质后蛋白质的得率高于酶解后蛋白质的得率，约为只进行酶解后蛋白质得率的1.57倍，而经过纤维素酶酶解后多糖的得率高于单纯经过高压均质后多糖的得率，约为后者的1.11倍，主要是由于高压均质通过物理挤压、冲撞的方式破坏了细胞壁的结构，使大量的细胞内容物包括大量蛋白质溶出，从而导致蛋白得率升高[14]。条斑紫菜的细胞壁主要由纤维素和果胶构成，通过纤维素酶酶解的方式可以有针对性地酶解细胞壁的结构，产生纤维素、肽聚糖等多糖类物质，同时细胞内的一些多糖类物质析出，使得多糖含量显著升高[15]。在后两组预试验中，作用条件相同但顺序不同，通过先进行高压均质再进行纤维素酶酶解的方式，蛋白质和多糖的得率均显著高于先进行纤维素酶酶解再进行高压均质的方式，根据蛋白质分子结构特征及高压均质处理的原理分析，以上结果可能是由于高压均质处理所引起的空穴效应、高速剪切力和湍流，使蛋白质分子的空间结构一定程度地展开，从而使更多原本位于蛋白分子内部易于被纤维素酶酶解的氨基酸残基暴露出来，从而使得总得率均大于后者[16]。

2.2 高压均质联合酶法提取蛋白质、多糖试验结果

2.2.1 均质压力对蛋白质得率、多糖得率及总得率的影响

由图4可知，蛋白质得率和多糖得率随着均质压力的增大先上升然后在均质压力超过100 MPa后逐渐趋于平缓，在100 MPa左右达到最高值（Plt;0.05），总得率为31.55%。蛋白质和多糖的得率在均质压力小于100 MPa时显著上升的原因可能是随着均质压力的增大，紫菜细胞经过高速碰撞、强力剪切和水力空化后紫菜细胞壁出现破损[17]，细胞中的蛋白质、多糖等物质溶出，均质压力大于100 MPa后，对于细胞壁的破坏进一步加强，细胞中的脂质、核酸等物质也被释放出来，导致蛋白质和多糖的纯度下降[18]，同时均质压力过大也会破坏蛋白质的结构，导致蛋白质变性。

2.2.2 料液比对蛋白质得率、多糖得率及总得率的影响

由图5可知，不同的底物浓度对蛋白质得率和多糖得率的影响效果十分显著（Plt;0.05），当料液比为1∶15时，紫菜匀浆较黏稠，降低了分子的扩散性，不易于利用高压均质机进行均质，且容易发生均质机堵塞的情况，底物浓度过低会导致酶的接触面变小，导致酶解效率降低，当料液比为1∶20时，蛋白质得率和多糖得率均达到最大值，总得率为37.13%，底物浓度越低，总得率越低，底物浓度在酶解过程中是影响酶解反应的最主要因素[19]。Olmstead等[10]通过对微藻料液进行均质，发现高压均质机对浓度范围为20%～25%的微藻料液具有适用性，结合本次试验，选择料液比为1∶20。

2.2.3 均质次数对蛋白质得率、多糖得率及总得率的影响

由图6可知，随着均质次数（0～10次）的增加，蛋白质得率和多糖得率均显著上升（Plt;0.05），对蛋白质得率的影响较明显，而对多糖的影响相对较小，在均质压力的作用下，随着均质次数的增加，紫菜细胞受到剪切和撞击的次数也相应增加，细胞壁变得非常脆弱，结构更加松散，从而使细胞内的蛋白质和多糖更易溶出，细胞变得越来越小[20]。细胞的颗粒大小不同，其作用效果也不同，颗粒较大的物质在高强度的能量下破碎程度更高，当颗粒小到一定程度时，高压均质机的能量已经不能破碎更小的颗粒，如果想要继续获得更小的颗粒，那么必须要输入更高的能量，因此在压力一定的条件下，仅增加次数对蛋白质和多糖的提取无明显的作用[21]，因此，本试验条件下最佳的均质次数为10次。

2.2.4 酶添加量对蛋白质得率、多糖得率及总得率的影响

由图7可知，当其他条件一定时，不同的纤维素酶添加量对紫菜悬浊液的酶解有着显著的影响，当纤维素酶添加量从1%增加到2%时，蛋白质得率和多糖得率均显著上升（Plt;0.05），总得率在酶添加量为2%时达到最大值，为31.33%，酶添加量大于2%时，总得率呈下降趋势。由于紫菜细胞壁主要是由纤维素和果胶组成的，通过添加一定量的纤维素酶可以对紫菜细胞壁起到很好的降解作用，利于细胞内蛋白质和多糖的溶出，使得蛋白质得率和多糖得率显著提高，当纤维素酶与底物反应达到饱和时，蛋白质和多糖的得率达到峰值。随后，由于底物浓度不变，酶添加量的增加导致酶的竞争性受到抑制，从而降低了酶反应的效率，并略微降低了蛋白质和多糖的得率[22]。因此，在此试验条件下，当纤维素酶添加量为2%时，总得率最高。

2.2.5 酶解温度对蛋白质得率、多糖得率及总得率的影响

由图8可知，酶解温度对蛋白质和多糖提取效果的影响较明显，当酶解温度为30～40 ℃时，多糖得率基本稳定在26%左右，当酶解温度为40～50 ℃时，多糖得率呈现上升趋势，且在50 ℃时达到最大值，蛋白质得率的变化受酶解温度的影响较大，当酶解温度为30～50 ℃时，变化不明显，当温度为35～50 ℃时，蛋白质得率显著升高，当温度为50 ℃时达到最大值，50 ℃后蛋白质得率和多糖得率均呈现下降趋势，纤维素酶的活性随着温度的升高而升高，但是温度过高（gt;50 ℃）会引起酶蛋白变性，导致得率下降。因此，经过均质后的紫菜匀浆纤维素酶的最适酶解温度为50 ℃。

2.2.6 酶解时间对蛋白质得率、多糖得率及总得率的影响

由图9可知，在酶解时间小于3 h时，蛋白质和多糖的得率均随着酶解时间的增加而增加（Plt;0.05），3 h时总得率达到最大值，为30.17%，继续延长酶解时间至3.5，4.0 h，得率保持不变，说明纤维素酶酶促反应的最佳时间为3 h，酶促反应需要一定的时间，当时间较短时，酶分子与底物的结合程度较低，酶解效果不理想，随着酶解时间的延长，酶与底物充分结合，3 h时酶解效果最佳。如果继续延长酶解时间，蛋白质和多糖得率的增加会加速逆反应的进行，从而导致酶反应速度下降，蛋白质和多糖的得率降低[23]。

2.2.7 酶解pH对蛋白质得率、多糖得率及总得率的影响

由图10可知，pH对蛋白质得率和多糖得率的影响较明显，当pH为5时，蛋白质得率和多糖得率均达到最大值，总得率为33.81%，纤维素酶在偏酸性的条件活性较强[24]，且在pH为5时，纤维素酶的酶解效果最佳，当pH为5～8时，蛋白质得率和多糖得率下降，纤维素酶的催化水解能力减弱，因此，pH为5是紫菜匀浆纤维素酶酶解的最佳pH值。

2.3 高压均质联合酶法破除条斑紫菜细胞壁正交试验条件的确定

由于纤维素酶在酶解过程中最适酶解时间、温度、pH较恒定，因此根据单因素试验结果，选出最优值作为试验条件，紫菜匀浆浓度较高（料液比为1∶15）时不利于均质的进行，容易引发堵塞，浓度较低时（料液比为1∶25），总得率相对较低，故选择料液比为1∶20。因此，进一步以均质压力、均质次数、酶添加量为影响因素，以蛋白质和多糖的总得率为考察指标，进行L9（33）正交试验。

2.4 正交试验结果分析

由表3中极差分析可知，影响高压均质法联合酶法提取蛋白质和多糖效果的主次顺序为均质压力gt;酶添加量gt;均质次数。正交试验结果经分析验证，得出高压均质法联合酶法的最佳工艺条件为均质压力100 MPa、均质次数8次、酶添加量2%，在最优组合条件下，条斑紫菜蛋白质和多糖的总得率为40.12%。

2.5 光学显微镜观察结果分析

由图11～图13可知，没有经过任何处理的市售干紫菜细胞样品中，细胞呈不规则的椭圆形，细胞体态完整，细胞壁轮廓较清晰，细胞与细胞之间排列紧密，在经过超微粉碎后的紫菜细胞样品中，有少许细胞碎片存在，但是大部分细胞没有发生破裂。而经过高压均质和酶解后的条斑紫菜细胞样品中，细胞形状不规则，细胞大小各异，破碎情况比较明显，且有细胞内容物溶出，说明细胞结构遭到了一定的破坏。

3 结论

文章采用高压均质联合酶法的方式对条斑紫菜细胞进行破壁，通过单因素试验和正交试验优化了最佳工艺条件，并用光学显微镜在1 000倍油镜下进行了观察分析，研究表明：

第一，通过蛋白质和多糖总得率的数据分析可以得出，在一定条件下，高压均质法和酶法均对条斑紫菜细胞壁具有一定的破坏效果，只进行高压均质破壁的作用效果优于只进行酶解破壁的作用效果，先进行高压均质再进行酶解破壁的作用效果优于先进行酶解再进行高压均质的作用效果。

第二，通过光学显微镜观察分析可以得出，高压均质联合酶法对条斑紫菜细胞进行破壁效果明显，且优于超微粉碎法的破壁效果。

本文的研究结果为海洋藻类细胞的破壁提供了思路和相关的数据参考，提高了条斑紫菜的营养利用率，为条斑紫菜产品的进一步开发利用奠定了重要的基础。

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收稿日期：2024-04-16

基金项目：江苏省普通高校自然科学研究计划项目（21KJA240004）

作者简介：高子鑫（1995—），男，山东潍坊人，硕士研究生，研究方向：食品加工与功能性食品。

*通信作者：盘赛昆（1974—），男，瑶族，教授，博士，研究方向：食品加工与功能性食品。