三种微生物离体氨基酸脱羧酶催化活性的研究

摘要：氨基酸脱羧酶（AAD）是生物胺合成的关键酶。微生物AAD一般为胞内酶，但性质稳定，在脱离细胞体系中仍可保持催化活性。文章以具有产生物胺能力的3种微生物细胞超声破碎后的粗酶液为对象，探究了前体氨基酸浓度、pH和盐浓度对离体AAD催化活性的影响。结果显示，多数情况下前体氨基酸未充分转化为生物胺，但低浓度前体氨基酸显著降低了离体AAD的催化活性；Lactobacillus plantarum 1-8和Escherichia coli BA-1的AAD在pH为6时催化活性最强，Debaryomyces hansenii MB-1Y的AAD在pH为5时催化活性最强；盐浓度提升导致AAD的催化活性降低。该研究可为探讨食品发酵中AAD的催化特性及其控制提供参考。

关键词：生物胺；氨基酸脱羧酶；离体酶；催化活性；环境因素

中图分类号：TS201.2""""" 文献标志码：A"""" 文章编号：1000-9973（2024）10-0065-05

Study on Catalytic Activity of in Vitro Amino Acid Decarboxylase

from Three Microorganisms

LI Shu-ting1，2， LIN Ze2， YIN Li-guo1， ZHANG Wen-xue2， WU Zheng-yun2*

（1.Key Laboratory of Solid-state Fermentation Resource Utilization in Sichuan Province， Yibin

University， Yibin 644005， China; 2.College of Biomass Science and Engineering，

Sichuan University， Chengdu 610065， China）

Abstract： Amino acid decarboxylase （AAD） is a key enzyme in biogenic amine synthesis. Microbial AAD is generally an intracellular enzyme， but its properties are stable and it can still maintain catalytic activity in extracellular systems. In this paper， with crude enzyme solution obtained from three microbial cells with the ability to produce biogenic amines after ultrasonic disruption as the object， the effects of precursor amino acid concentration， pH and salt concentration on the catalytic activity of in vitro AAD are investigated. The results show that in most cases， the precursor amino acids are not fully converted into biogenic amines， but low concentrations of precursor amino acids significantly reduce the catalytic activity of in vitro AAD. The catalytic activity of AAD of Lactobacillus plantarum 1-8 and Escherichia coli BA-1 is the strongest when pH is 6， while the catalytic activity of AAD of Debaryomyces hansenii MB-1Y is the strongest when pH is 5. The increase of salt concentration leads to the decrease of the catalytic activity of AAD. This study can provide references for exploring the catalytic characteristics and controlling of AAD in food fermentation.

Key words： biogenic amine; amino acid decarboxylase; in vitro enzyme; catalytic activity; environmental factors

生物胺是发酵食品中普遍存在的健康风险因子之一[1]。发酵食品中的生物胺主要由具有产生物胺能力的微生物生成[2]。食品发酵中具有产生物胺能力的微生物种类很多，包括乳酸杆菌属（Lactobacillus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、芽孢杆菌属（Bacillus）、魏斯氏菌属（Weissella）等[3-5]。氨基酸脱羧酶（amino acid decarboxylase，AAD）是转化前体氨基酸生成生物胺的关键酶，微生物AAD一般为胞内酶，但具有较强的稳定性，在脱离细胞体系后仍可保持其催化活性[6]，这意味着发酵食品生产中微生物细胞因衰亡或非热杀菌等原因裂解后，AAD仍可在一定程度上将前体氨基酸转化为生物胺。

目前关于发酵食品中生物胺控制的研究多集中在具有产生物胺能力的微生物上，对AAD本身以及脱离细胞体系的AAD的催化特性及其影响因素的研究相对较少。研究显示，不同微生物来源的AAD在氨基酸序列、蛋白质三级结构和理化特性上有一定的差异[7]。乳酸菌和酵母菌是常用的发酵微生物，此外，食品发酵中也可能存在一些杂菌（如大肠菌群）。本文以本实验室前期从泡菜等发酵食品中分离的三类产生物胺菌株为基础，探讨了来自不同微生物的离体AAD的催化特性，为发酵食品中生物胺的控制提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 试剂

腐胺、尸胺、组胺、酪胺、色胺、精胺、亚精胺标准品：德国Dr.Ehrenstorfer公司；色氨酸、酪氨酸、精氨酸、鸟氨酸盐酸盐、赖氨酸、组氨酸、脯氨酸（均为分析纯）：上海麦克林生化科技股份有限公司；5′-磷酸吡哆醛：上海阿达玛斯试剂有限公司；氯化钠、氢氧化钠、碳酸氢钠（均为分析纯）：成都金山化学试剂有限公司；乙腈（色谱纯）：美国Sigma公司；PBS缓冲液：安徽白鲨生物科技有限公司。

1.1.2 菌种

L.plantarum 1-8、E.coli BA-1、D.hansenii MB-1Y，其中，L.plantarum 1-8具有酪氨酸脱羧酶活性，E.coli BA-1具有鸟氨酸脱羧酶活性和赖氨酸脱羧酶活性，D.hansenii MB-1Y具有鸟氨酸脱羧酶活性。

1.1.3 培养基

MRS-AAD培养基：蛋白胨10.0 g/L，牛肉浸粉5.0 g/L，吐温80 1 mL，磷酸氢二钾2.0 g/L，酵母浸粉4.0 g/L，硫酸镁0.2 g/L，柠檬酸三铵2.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，硫酸锰0.05 g/L，乙酸钠5.0 g/L，酪氨酸 2.0 g/L，5′-磷酸吡哆醛0.05 g/L，于115 ℃灭菌30 min。

LB-AAD培养基：胰蛋白胨10.0 g/L，酵母浸粉5.0 g/L，氯化钠10.0 g/L，鸟氨酸盐酸盐2.0 g/L，精氨酸2.0 g/L，赖氨酸2.0 g/L，5′-磷酸吡哆醛0.05 g/L，于115 ℃灭菌30 min。

YPD-AAD培养基：蛋白胨20.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，酵母浸粉10.0 g/L，鸟氨酸盐酸盐2.0 g/L，精氨酸2.0 g/L，5′-磷酸吡哆醛0.05 g/L，于115 ℃灭菌30 min。

1.2 仪器与设备

TGL-1650台式高速冷冻离心机 四川蜀科仪器有限公司；JY96-ⅡN超声波细胞破碎仪 上海沪析实业有限公司；1260 Infinity Ⅱ高效液相色谱仪 安捷伦科技（中国）有限公司；SCI-VS涡旋振动器 美国赛洛捷克公司；PHS-3C pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司；HWS-26恒温水浴锅 上海齐欣科学仪器有限公司；FA2004电子天平 上海良平仪器仪表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种培养

将L.plantarum 1-8、E.coli BA-1和D.hansenii MB-1Y分别以1%接种于MRS、LB、YPD液体培养基中，在37 ℃恒温培养箱中活化培养24 h。将1 mL（约107 CFU/mL）L.plantarum 1-8、E.coli BA-1和D. hansenii MB-1Y的活化菌液分别接入100 mL MRS-AAD培养基、LB-AAD培养基和YPD-AAD培养基中，在37 ℃培养24 h。

1.3.2 AAD粗酶液的制备

参照文献[8]的方法制备AAD粗酶液。将前述培养所得菌液在4 ℃下以8 000 r/min离心10 min，收集菌体，菌体沉淀使用生理盐水重复洗涤3次，去除上清液。向收集到的菌体沉淀中加入100 mL 0.01 mol/L磷酸盐缓冲液涡旋使菌体重悬于缓冲液中，使用超声波细胞破碎仪在低温条件下冰浴破碎菌体细胞。超声波细胞破碎仪工作条件为工作时间3 s，间隔时间3 s，功率200 W，工作15 min。将超声后的菌液在4 ℃、8 000 r/min的条件下离心10 min，收集上清液，并用孔径为0.22 μm的水系滤膜过滤，获得AAD粗酶液。

1.3.3 环境因素对AAD催化活性的影响

前体氨基酸浓度对AAD催化活性的影响：在L.plantarum 1-8的AAD粗酶液中分别加入0.1，0.5，1.0，2.0 g/L酪氨酸、0.05 g/L 5′-磷酸吡多醛；在E.coli BA-1的AAD粗酶液中分别加入 0.1，0.5，1.0，2.0 g/L 4个浓度梯度的鸟氨酸盐酸盐、精氨酸、赖氨酸以及0.05 g/L的5′-磷酸吡哆醛，在D.hansenii MB-1Y的AAD粗酶液中分别加入 0.1，0.5，1.0，2.0 g/L 4个浓度梯度的鸟氨酸盐酸盐、精氨酸以及0.05 g/L的5′-磷酸吡哆醛。在37 ℃下培养48 h，过程中取样测定其生物胺含量。

pH对AAD催化活性的影响：各前体氨基酸浓度为2.0 g/L，通过加盐酸分别调整pH至4.0，5.0，6.0，7.0；其他条件同上。

盐浓度对AAD催化活性的影响：各前体氨基酸浓度为2.0 g/L，添加NaCl进行调整使其盐浓度分别为2%、4%、6%；其他条件同上。

1.3.4 生物胺的测定

生物胺的测定参照唐小曼等[9]的方法，取1.0 mL标准溶液于10 mL离心管中，依次加入200 μL 2 mol/L NaOH溶液、300 μL饱和NaHCO3溶液缓冲，再加入2.0 mL 10 g/L丹酰氯衍生剂（溶剂为丙酮），振荡混匀后于40 ℃避光水浴60 min，每15 min 振荡一次。加入 200 μL 100 g/L脯氨酸溶液，涡旋1 min后于室温下避光放置15 min终止衍生反应，再加入0.4 g NaCl涡旋振荡1 min 后加入1 mL乙醚，涡旋振荡30 s，静置分层后，吸出上层有机相，再次萃取，合并有机相，45 ℃水浴挥干。用1.0 mL乙腈溶解残留物，用0.22 μm有机膜过滤，于4 ℃避光保存，用于高效液相色谱测定。样品溶液衍生的条件及方法与标准溶液相同。

色谱柱为 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），紫外检测波长254 nm，进样量 20 μL，流速0.8 mL/min，柱温35 ℃，流动相 A 为乙腈，流动相 B 为去离子水，梯度洗脱条件参考GB 5009.208—2016，洗脱程序共37 min，设置0 min时乙腈体积分数为60%，去离子水体积分数为40%；22 min时乙腈体积分数为85%，去离子水体积分数为15%；25 min时乙腈体积分数为100%，去离子水体积分数为0%；32.01 min时乙腈体积分数为60%，去离子水体积分数为40%。

2 结果与讨论

2.1 前体氨基酸浓度对离体AAD催化活性的影响

不同浓度前体氨基酸下AAD催化形成生物胺的动态过程见图1。

随着前体氨基酸浓度的升高，生物胺的生成速率和总量均呈上升趋势，与王鹏[10]研究精氨酸脱羧酶催化反应与底物浓度关系的结果相近。前体氨基酸添加量为1.0 g /L和2.0 g/L时，生物胺合成最终量较接近。相对而言，来自L.plantarum 1-8和E.coli BA-1的离体AAD的催化反应进程快于来自D.hansenii MB-1Y的鸟氨酸脱羧酶；来自E.coli BA-1的赖氨酸脱羧酶的催化反应速率受前体氨基酸浓度的影响更大。在前体氨基酸浓度为0.1，0.5，1.0，2.0 g/L时，L.plantarum 1-8酪氨酸脱羧酶催化前体氨基酸的转化率分别约为18%、9%、5.7%、3.1%，D.hansenii MB-1Y鸟氨酸脱羧酶催化前体氨基酸的转化率分别约为55%、15%、10.5%、6.5%，表明大部分前体氨基酸并未转化为生物胺。总体上看，E.coli BA-1鸟氨酸脱羧酶和赖氨酸脱羧酶的酶活性较高，在前体氨基酸浓度为0.1 g/L时，鸟氨酸脱羧酶和赖氨酸脱羧酶转化率分别约为150%和130%（转化率大于100%的原因是来自LB培养基的胰蛋白胨和酵母浸粉中的部分氨基酸也被转化）。由以上结果可知，一方面，多数情况下前体氨基酸并未充分转化为生物胺（甚至只有一小部分被转化），但前体氨基酸的浓度（尤其是低浓度）对于AAD酶催化活性的影响显然存在。 另一方面，在本研究中还观察到当前体氨基酸浓度达到某一特定阈值后，进一步提高其浓度并未显著促进其对应生物胺的合成，由此推测生物胺浓度可能对AAD存在反馈抑制作用。韩忠安[11]研究显示添加0.1～0.5 mmol/L（0.018～0.091 g/L）的酪氨酸使Bacillus subtilis BJ3-2酪氨酸脱羧酶活性呈上升趋势，但添加量超过0.5 mmol/L后，相对酶活（将测定的最高酶活设为100，得到不同浓度酪氨酸下的相对酶活）出现下降趋势，与本研究结果相近。

泡菜发酵过程中游离氨基酸的总浓度一般呈上升趋势，范围大致为0.4～2.0 g/L，其中，酪氨酸、精氨酸、赖氨酸的浓度随着发酵时间的增加而增多，浓度范围分别为0.01～0.05 g/L、0.02～0.05 g/L和0.02～0.15 g/L[12-13]；酒发酵过程中游离氨基酸的总浓度一般也呈上升趋势，范围大致为1.0～3.5 g/L，其中，酪氨酸、精氨酸、赖氨酸的浓度随着发酵时间的增加而增多，大致浓度范围分别为0.04～0.20 g/L、0.04～0.40 g/L和0.05～0.15 g/L[14-15]，这与本研究中0.1 g/L的前体氨基酸浓度水平接近，在此条件下前体氨基酸对离体AAD活性存在一定的限制作用。

2.2 pH对离体AAD催化活性的影响

由图2可知，除来自D.hansenii MB-1Y的AAD在pH为7时的催化活性较低外，在pH为5～7之间3株微生物的离体AAD均可催化形成生物胺且催化活性相近；pH为4时仅来自L.plantarum 1-8的离体AAD显示催化活性，表明其有更强的耐酸特性。Zou等[16]研究表明Enterobacter aerogenes DL-1的组氨酸脱羧酶能够在pH为4～8之间保持稳定，在pH为4时放置5 d仍能保持约70%的相对酶活，与本文结果略有差别，可能与AAD的种类不同有关。本文中3株微生物离体AAD催化反应的最适pH也有所不同，来自L.plantarum 1-8和E.coli BA-1的AAD在pH为6时活性最高；来自D.hansenii MB-1Y的AAD在pH为5时生物胺合成量最高。 Furutani等[17]报道的Staphylococcus epidermidis中组氨酸脱羧酶的最适pH为5.0；Arribas等[18]对Lactobacillus brevis中酪氨酸脱羧酶的研究显示其在pH为5时活性最高，与本研究结果接近。AAD在不同pH下的构象可能发生变化。Jessop等[19]研究表明E.coli中的赖氨酸脱羧酶在pH＜5时多为寡聚体，在pH＞6.5时二聚体比例大幅提高，且赖氨酸脱羧酶二聚体活性相对较低；寇凤雨[20]的研究显示赖氨酸脱羧酶在最适pH下十聚体比例最大，推测十聚体形式可能是赖氨酸脱羧酶活性最高的聚合形式。由此可见，pH可能通过调节AAD的多聚体状态，进而影响AAD的活性。

泡菜发酵过程的pH值通常从6.5逐渐下降至3.5左右[12，18]，酒类发酵过程中的pH值通常从4.5逐渐下降至3.5左右[21-22]，而生物胺总量呈增加趋势，大部分生物胺在发酵前期和中期形成[23-24]。结合本研究结果来看，在发酵后期较低的pH值下，除乳酸菌外，其他微生物的离体AAD活性较微弱。

2.3 盐浓度对离体AAD催化活性的影响

氯化钠的存在会影响酶所在的环境及其基团，导致蛋白质二级结构各部分间的排斥力增加，无规则卷曲比例升高，蛋白质变性程度增强[25]。由图3可知，随着盐浓度的升高，3种微生物离体AAD催化形成的生物胺总量均明显降低。与2%盐浓度相比，6%盐浓度下各离体AAD生物胺合成量分别下降了51.19%（L.plantarum 1-8-酪胺）、39.92%（E.coli BA-1-腐胺）、6.02%（E.coli BA-1-尸胺）。D.hansenii 鸟氨酸脱羧酶在6%盐浓度下不能合成生物胺。盐浓度对L.plantarum 1-8中酪氨酸脱羧酶催化速率的影响相对较小；而E.coli BA-1的鸟氨酸脱羧酶和赖氨酸脱羧酶的催化速率随着盐浓度的升高而大幅降低。韩忠安[11]在对豆豉中细菌酪氨酸脱羧酶活性的研究中也观察到，盐浓度从5%升高到6%时酪氨酸脱羧酶活性下降了48.16%。徐文娟[26]的研究显示，当氯化钠浓度从0%升高至4.5%时，Enterococcus faecalis和Enterococcus faecium中酪氨酸脱羧酶体外生物胺合成量分别从179，469 mg/L下降至39，46 mg/L。而Tabanelli等[6]的研究却发现氯化钠添加量在0%～5%之间对Streptococcus thermophilus的组氨酸脱羧酶活性并没有显著影响，当氯化钠浓度升高至10%以上时才出现明显的抑制作用。出现这些情况的原因主要是生物胺的合成高度依赖于菌株而不是种属，不同实验菌种的AAD可能存在一定的差异。一般来说，实际泡菜的盐浓度范围在2%～8%[27-29]。陈露等[23]在实际泡菜发酵体系中探究了盐浓度对生物胺含量的影响，结果显示，2%、4%、6%、8%盐浓度的产生物胺水平分别为181.13，118.24，18.17，0 mg/kg，与本研究结果相似。

3 结论

本文探究了3种不同微生物的离体ADD催化活性及其影响因素。结果表明，多数情况下前体氨基酸并未充分转化为生物胺，但低浓度前体氨基酸显著降低了离体AAD酶的催化活性；偏酸性环境促进氨基酸脱羧酶合成生物胺，L.plantarum 1-8和E.coli BA-1的离体ADD在pH为6时活性最高；D.hansenii MB-1Y的离体ADD在pH为5时活性最高；在pH为4时，E.coli BA-1和D.hansenii MB-1Y的离体ADD失活；高盐浓度抑制了ADD活性。本研究可为食品发酵中氨基酸脱羧酶的催化特性及其控制的探讨提供参考。

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收稿日期：2024-04-02

基金项目：固态发酵资源利用四川省重点实验室开放基金项目（2022GTYY09）

作者简介：李书婷（1999—），女，硕士，研究方向：发酵工程。

*通信作者：吴正云（1970—），男，副教授，博士，研究方向：食品工程。