基于双重信号放大策略的生物传感器用于汞离子的灵敏可视化检测

摘要 重金属汞对人类的生活环境和身体健康构成了严重威胁，因此，构建简单灵敏的汞离子（Hg2+）检测方法尤为重要。本研究结合催化发夹自组装（CHA）和滚环扩增（RCA）两种高效信号放大技术，构建了具有双重信号放大功能的生物传感器，用于Hg2+的高灵敏和高选择性定量检测。当目标物Hg2+存在时， DNA 辅助探针通过T-Hg2+-T 碱基错配杂交引发CHA 反应（第一重信号放大），生成的DNA 双链产物进一步引发RCA 反应，生成大量的G-四链体重复序列（第二重信号放大）。这种特殊的序列与氯化血红素（Hemin）孵育后形成具有类辣根过氧化物酶活性的Hemin/G-四链体DNA 酶，可催化底物3，3′，5，5′-四甲基联苯胺（TMB）发生氧化反应，使TMB 由无色变成蓝色。由于结合了两种高效的信号放大策略，采用紫外-可见吸收光谱法可实现Hg2+的高灵敏定量检测，检出限（LOD， 3σ）低至0.21 nmol/L。同时，通过裸眼观测溶液的颜色变化，可实现浓度为1 nmol/L 的Hg2+的可视化检测。此传感器具有优异的选择性，可用于复杂水样中Hg2+的检测，为重金属污染物的检测提供了简单灵敏的分析平台，在环境监测领域具有潜在的应用价值。

关键词 催化发夹自组装；滚环扩增；生物传感器；可视化检测；汞离子

随着工业和经济的高速发展，重金属污染的问题变得日益严重[1]。常见的强毒性重金属污染物有铅、镉、砷和汞等。这些重金属主要通过食物链及生活用品等广泛存在于人类生活中，对生态环境和人体健康构成了严重的威胁[2-3]。其中，汞离子（Hg2+）具有持久性、易迁移性、高生物毒性、强生物富集性及不可自然降解等性质，进入人体后与蛋白质或酶结合，在重要的组织和器官中积累，导致细胞功能异常，引发脑损伤、肾功能衰竭和消化系统损伤等多种疾病[4-6]。

根据世界卫生组织（WHO）的规定，饮用水中Hg2+的最高允许浓度为30 nmol/L[7]。目前，用于检测Hg2+的方法有气相色谱法、原子吸收光谱法、荧光光谱法和电感耦合等离子体质谱法等[8-10]。这些方法虽然大多能检测nmol/L 级的Hg2+，满足对饮用水中Hg2+的检测需求，但所需的仪器设备昂贵、样品预处理繁琐耗时、操作要求高[11-14]，限制了这些方法在偏远和不发达地区的应用。因此，开发一种简单且灵敏度高的Hg2+检测方法尤为重要。

研究表明， Hg2+可与胸腺嘧啶（T）通过N-Hg共价键特异性结合，形成稳定的T-Hg2+-T配位化合物[15-16]。T-Hg2+-T 错配杂交结构的结合常数大于天然的A-T 碱基对，因此具有很强的稳定性和特异性[17]。基于该原理并结合生物传感技术，研究者已构建了许多检测Hg2+的生物传感器，如电化学生物传感器、荧光生物传感器、比色生物传感器及表面等离子体共振生物传感器等[18-20]。其中，比色传感器所需检测仪器价格低、构建简单、检测方便，并且可实现可视化检测，因此备受关注[21-23]。但是，比色传感器的检测灵敏度一般都较低，因此常需引入高效的信号放大策略，以实现对Hg2+的灵敏检测。

2008 年， Pierce 课题组[24]基于Toehold-介导的链置换反应提出了催化发夹自组装（Catalyzed hairpinassembly， CHA）反应原理。在该反应中， DNA 或RNA 引发链可催化两个亚稳态的DNA 发夹探针自组装形成双链体，并将引发链置换出来参与循环催化反应。该反应过程均在等温条件下进行，一条引发链可多次催化发夹探针发生自组装，得到大量的由两个发夹型探针自组装形成的双链结构，从而达到信号放大的目的。CHA 反应已被广泛应用于痕量生物分子的检测。滚环扩增（Rolling circle amplification，RCA）反应是将环状DNA 作为模板，通过一个与环状DNA 互补的单链DNA 或RNA 作为引物，在聚合酶的作用下，加入脱氧核糖核酸混合物（dNTPs）可产生长单链DNA，此DNA 链可拥有无数多个重复的且可与模板DNA 互补的核酸片段[25]。RCA 可有效放大痕量靶标物的信号，在多种生物分子的检测过程中显示出巨大的应用潜力。若结合以上两种高效的信号放大策略，构建具有双重信号放大能力的传感器，可望实现对痕量重金属污染物Hg2+的高灵敏检测。

基于此，结合CHA 和RCA 这两种高效的信号放大技术，本研究构建了具有双重信号放大功能的生物传感器，实现了对重金属污染物Hg2+的高灵敏定量检测。当Hg2+存在时，辅助探针通过T-Hg2+-T 错配杂交触发CHA 反应，使Hg2+被不断释放出来并参与循环反应，实现第一重信号放大，得到大量可引发下一步RCA 反应的DNA 双链结构；生成的DNA 双链结构与环状DNA 模板杂交，并引发RCA 反应，产生大量的G-四链体重复序列，实现第二重信号放大。大量的G-四链体可与氯化血红素（Hemin）结合，形成Hemin/G-四链体复合物，该复合物具有类辣根过氧化物酶（HRP）活性[26]。Hemin/G-四链体DNA 酶可催化H2O2 氧化3，3′，5，5′-四甲基联苯胺（TMB）生成氧化态的TMB，使得无色TMB 溶液变成蓝色。加入H2SO4 终止反应后，溶液变成黄色。通过紫外-可见吸收光谱法可实现Hg2+的灵敏定量分析；此外，通过裸眼观测溶液的颜色，可实现Hg2+的可视化检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

UV-1800 型紫外-可见分光光度计（日本岛津公司）；AKRY-UP-1824 型艾柯超纯水机（成都康宁实验专用纯水设备厂）；ME104E 型电子天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）；pH-2602 型酸度计（杭州陆恒生物科技有限公司）。

T4 DNA 连接酶、Phi29 DNA 聚合酶（phi29）、脱氧核糖核酸混合物（dNTP）、核酸外切酶Ⅰ（Exo-Ⅰ）、核酸外切酶Ⅲ（Exo-Ⅲ）由上海碧云天生物技术公司提供；3，3′，5，5′-四甲基联苯胺盐酸盐（TMB·2HCl）、Hemin、H2O2、二硫苏糖醇（DTT）、H2SO4、三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）、N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸（HEPES）、曲拉通X-100（Triton X-100）、二甲基亚砜（DMSO）和HgNO3 购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。所用试剂均为分析纯，核酸序列均由上海生物工程股份有限公司合成，其DNA 序列见表1。汞离子储备液由HgNO3 配制。Tris-HCl 缓冲溶液（50 mmol/L Tris-HCl， 1 mmol/L DTT，20 mmol/L MgCl2， pH 7.5）；HEPES 缓冲溶液（50 mmol/L HEPES， 40 mmol/L KCl， 400 mmol/L NaCl， 0.1%Triton X-100， 2% DMSO， PH 7.4）；10×T4 DNA 酶缓冲溶液（500 mmol/L Tris-HCl， 100 mmol/L MgCl2，50 mmol/L DTT， 10 mmol/L ATP， pH 7.5），将10×T4 DNA 酶缓冲溶液稀释10 倍获得1×T4 DNA 酶缓冲溶液。实验用水为超纯水（电阻≥18.2 MΩ∙cm）。

1.2 环状DNA 模板的制备

将cDNA（10 μL， 100 μmol/L）和LP（50 μL， 100 μmol/L）于95 ℃加热5 min，缓慢降至室温；加入T4连接酶（10 μL， 2 U/μL）和1×T4 DNA 酶缓冲溶液（10 μL），孵育过夜，使DNA 末端连接在一起，形成环状DNA 模板。将上述反应液在65 ℃下加热10 min，使T4 连接酶失活；加入Exo-Ⅰ（10 μL， 10 U/μL）和Exo-Ⅲ（10 μL， 10 U/μL），使反应溶液的最终体积为100 μL，于37 ℃孵育2 h，以降解LP 链。将上述混合溶液在80 ℃下加热15 min，使加入的酶失活。将得到的环状DNA 模板在4 ℃下保存，备用。

1.3 Hg2+ 的检测

采用Tris-HCl 缓冲溶液稀释核酸探针。首先将HP1（100 μL， 5 μmol/L）和HP2（100 μL， 5 μmol/L）探针分别退火，即在95 ℃下加热5 min 后缓慢降至室温以保证发夹结构的形成。将AP（ 1 μL，5 μmol/L）、HP1（1 μL， 5 μmol/L）、HP2（1 μL， 5 μmol/L）、cDNA（1 μL， 5 μmol/L）、phi29 聚合酶（5μL， 2 U/μL）和dNTP（1 μL， 50 mmol/L）与5 μL 不同浓度的Hg2+反应2 h，再加入5 μL Hemin（10 μmol/L）共同孵育30 min，得到Hemin/G-四链体DNA 酶。加入20 μL TMB 显色液，室温下反应30 min，加入10 μL H2SO4 溶液（10 mol/L）终止反应。反应结束后，先拍摄实验所需的照片，再用HEPES 缓冲溶液将上述溶液稀释至200 μL，采用UV-1800 型紫外-可见分光光度计测定溶液的紫外-可见吸收光谱。

2 结果与讨论

2.1 传感器的检测原理

借助于T-Hg2+-T 错配杂交结构以及目标物诱发的CHA 和RCA 双重信号放大策略，构建了灵敏检测Hg2+的生物传感器，其原理如图1 所示。传感器包含了2 个DNA 发夹探针（HP1 和HP2）、1 个辅助探针（AP）以及1 个环状DNA 模板探针（cDNA）。为防止无目标物Hg2+存在时RCA 反应自发发生，将引发RCA 反应的引物序列分成两段，分别设计在HP1 和HP2 的末端，并在HP1 和AP 链的末端（绿色部分）设计了4 个胸腺嘧啶（T）。Hg2+不存在时， AP 探针无法与HP1 稳定结合，并由于动力学阻碍， HP1 和HP2无法发生自组装，因此不能与cDNA 杂交， RCA 反应无法发生。加入Hg2+后， Hg2+与AP 和HP1 上的胸腺嘧啶（T）特异性结合，形成稳定的T-Hg2+-T 配位化合物，触发链置换反应，将HP1 打开，暴露出HP1 发夹型DNA 探针中黄色区域的DNA 片段。暴露出的黄色序列可与HP2 中的黄色序列杂交，引发第二个链置换反应，使得HP1 和HP2 组装在一起，并释放出AP 链和Hg2+。其中，释放出的Hg2+又可在AP 链的协助下引发HP1 和HP2 之间的另一个新的CHA 循环反应，再次释放出AP 链和Hg2+。如此循环反应，最终产生大量的HP1/HP2 的双链DNA 结构，达到第一重信号放大的目的。并且，此时分离在HP1 和HP2 末端的RCA 反应的引发链被拉近了距离，紧密靠近在一起。随后， HP1/HP2 双链的末端与cDNA 杂交，在phi29 聚合酶及dNTP 存在下，引发RCA 放大反应，产生大量的G-四链体重复序列。在Hemin 存在下，G-四链体与Hemin 结合形成Hemin/G-四链体DNA 酶。Hemin/G-四链体DNA 酶具有类HRP 活性，可催化H2O2 将底物TMB 氧化成氧化态的TMB，使底物颜色由无色变成蓝色，加入H2SO4 溶液终止反应后，溶液颜色变为黄色。通过紫外-可见吸收光谱法可实现Hg2+的灵敏检测。此外，通过裸眼观测溶液的颜色，实现Hg2+的可视化检测。

2.2 传感器的可行性分析

通过一系列的对照实验探究此传感器的可行性。如图2 所示， HP1 和cDNA 的混合液在450 nm 处出现了一个微弱的吸收峰（曲线a），这是由于Hemin 微弱的催化能力所致。将HP1、HP2 与cDNA 混合，不加入其它探针时，出现了微弱增强的信号（曲线b），这可能是由于HP1 和HP2 探针之间非特异性的自组装所致。在上述溶液中加入AP 探针后， 450 nm 处吸收值没有明显变化（曲线c），说明目标物Hg2+不存在时， AP 探针不会与HP1 结合，因此不会引发HP1 和HP2 之间的自组装，后续的一系列反应也不会发生。以上结果表明，在目标物Hg2+不存在时，所有的DNA 探针是可以稳定共存的。将Hg2+（1 或5 nmol/L）与AP、HP1、HP2 和cDNA 一起孵育时，可观察到450 nm 处吸收值显著增加（曲线d 和曲线e），表明加入Hg2+后， Hg2+可触发CHA 反应，进而引发RCA 放大反应，产生大量的Hemin/G-四链体DNA 酶， DNA 酶可催化H2O2 将TMB 氧化成氧化态的TMB，加入H2SO4 终止反应后，在450 nm 处的吸收值增加。由图2A 可见，随Hg2+浓度增加，在450 nm 处的吸收值也随之增大。与对照实验组相比，加入目标物后，溶液的颜色明显加深，并且随着目标物浓度增加，溶液的颜色也随之加深（图2B），此结果与紫外-可见吸收光谱法测定结果一致，表明本方法可以实现Hg2+的可视化检测。

2.3 实验条件的优化

为了获得最佳的检测性能，对Hemin 浓度及目标物诱发CHA 和RCA 双重信号放大反应的时间进行了优化。如图3A 所示，当Hemin 的浓度从0.5 μmol/L 增至1.0 μmol/L 时， 450 nm 处的吸光度增加值（A‒A0）逐渐增大；当Hemin 浓度为1.0 μmol/L 时， A‒A0 最大；当Hemin 浓度超过1.0 μmol/L 后， A‒A0逐渐降低。这是由于过高浓度的Hemin 会产生较大的背景信号，使A‒A0 减小。因此，本研究选择Hemin浓度为1.0 μmol/L。如图3B 所示，随着目标物诱发CHA 和RCA 双重信号放大反应时间的延长， A‒A0 逐渐增大，直至120 min 后达到了一个平台，表明此时反应达到平衡状态。因此，选择本研究的最佳反应时间为120 min。

2.4 传感器的检测性能

在最优实验条件下，进一步探究了基于CHA 和RCA 双重信号放大的传感器的检测性能。如图4A所示，随着Hg2+浓度由0.5 nmol/L 增大至10.0 nmol/L，在450 nm 处的吸光度逐渐增大，并且吸光度与目标物Hg2+的浓度呈良好的线性关系（图4B），线性方程为A=0.0943C+0.1653（R2=0.9949， A 为吸光度， C 为Hg2+的浓度）。本方法的检出限（LOD， 3σ， n=11）低至0.21 nmol/L。根据世界卫生组织（WHO）的规定，饮用水中Hg2+的最高允许浓度为30 nmol/L[7]。因此，本研究构建的生物传感器可满足饮用水中Hg2+的检测需求。此外，通过裸眼观察不同浓度Hg2+所对应溶液颜色的变化可以发现，随着Hg2+浓度增加，反应溶液的颜色逐渐加深（图4C），此结果与紫外-可见吸收光谱法的测定结果一致。由于检测样品和空白对照组之间存在明显色差，通过裸眼观察即可将1 nmol/L Hg2+和空白对照组区别开来，表明所构建的方法可实现对Hg2+的可视化检测。与之前文献报道的Hg2+检测方法相比（表2），本研究构建的Hg2+检测方法的检测性能与之相当或更优，并且不需要昂贵的仪器，可实现对Hg2+的可视化检测。此外，采用此生物传感器对5 nmol/L Hg2+进行6 次重复测定，相对标准偏差（RSD）为4.2%，表明此传感器具有良好的重现性。

2.5 传感器的选择性

采用此传感器对其它环境相关的干扰金属离子（Ag+、Fe2+、Cu2+、Ni2+、Zn2+、Mn2+、Pb2+和Cd2+）进行检测，结果如图5 所示， 5 nmol/L Hg2+产生了较大的响应信号，而10 倍浓度的其它非靶标金属离子在450 nm 处所产生的吸收值与背景信号相似， 表明此传感器对Hg2+具有较好的选择性，受其它离子的干扰较小。其原因可能是Hg2+可插入双胸腺嘧啶碱基对中间，形成的T-Hg2+-T 结构触发CHA 反应，从而进一步引发RCA 放大反应，产生较大的响应信号，而其它离子不能形成类似T-Hg2+-T 的结构，因此不能触发CHA 反应，抑制了后续一系列反应的发生，产生的信号较小。

2.6 实际样品的检测

利用此传感器自来水样品进行检测，以验证方法的实用性。实验结果如表3 所示，在自来水样品中未检出Hg2+， 3 个不同加标浓度（1、5 和10 nmol/L）下的Hg2+的回收率为99.8%～107.0%， RSDlt;0.2%，表明此传感器可用于实际水样中Hg2+的检测。

3 结论

本研究基于CHA 和RCA 双重信号放大策略构建了高灵敏检测Hg2+的生物传感器。Hg2+可触发CHA 反应，并进一步引发RCA 放大反应，得到大量具有类HRP 活性的Hemin/G-四链体DNA 酶，催化底物反应产生放大的响应信号。由于采用了双重信号放大策略，此传感器具有较高的灵敏度和较好的选择性，采用紫外-可见吸收光谱法测定Hg2+， LOD 低至0.21 nmol/L。同时，通过反应过程中溶液颜色的变化可实现对浓度为1 nmol/L 的Hg2+的可视化检测，这有利于在偏远地区水样中Hg2+的现场可视化检测。本传感器操作方便、灵敏度高、选择性好，可以实现可视化检测，在环境检测领域具有潜在的应用价值。

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