堆肥对烟草黑胫病的防效及作用机理研究

摘要：为明确堆肥对烟草黑胫病的生防效果，进而揭示其抑菌防病机理，以蘑菇渣、浒苔粉、玉米秸秆、凹凸棒和生物炭按照不同组合制备的4种堆肥为研究对象，采用菌丝生长速率法分析堆肥浸提液对烟草黑胫病菌的抑制效果，并进一步通过扫描电镜观察菌体超微结构；采用盆栽试验，考察4种堆肥对烟草黑胫病的防治效果，并从烟草植物防御酶活性、土壤理化性质和土壤酶活性的角度揭示防治机理。结果表明，4种堆肥浸提液原液对病原菌菌丝生长均有明显的抑制作用，最高抑制率达85.54%，且电镜结果显示菌丝体受到严重破坏，而高温灭菌液几乎无抑制效果。盆栽试验结果表明，堆肥处理显著促进了烟株的生长发育，最大叶长、最大叶宽和最大叶面积显著增加；降低了烟草黑胫病的发生率和病情指数，其中堆肥A（蘑菇渣+浒苔粉+秸秆+凹凸棒）和AB（蘑菇渣+浒苔粉+秸秆+凹凸棒+生物炭）防效可达100%；改善了土壤理化性质和土壤酶活性，有效提高土壤pH值、速效磷含量、速效钾含量，提升土壤脲酶和酸性磷酸酶活性。综上所述，堆肥处理可通过抑制病原菌生长、改善土壤理化性质和调节土壤酶活性，有效控制烟草黑胫病的发生。

关键词：堆肥；烟草黑胫病；盆栽试验；生物防治；作用机理

中图分类号：S435.72 文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2024）15-0153-07

收稿日期：2023-09-01

基金项目：中国烟草总公司云南省公司重大项目（编号：2023530000241017）。

作者简介：陈淑童（2001—），女，山东潍坊人，硕士研究生，研究方向为植物病害检疫与防治研究。E-mail：stchen0531@163.com。

通信作者：沈广材，男，硕士，助理农艺师，主要从事烟叶生产研究。E-mail：sgczdy910@163.com。

烟草黑胫病是由土传卵菌寄生疫霉烟草致病变种（Phytophthora parasitica var. nicotianae）引起的维管束病害［1］。该病在众多烟区均有发生，不仅造成了严重的损失且防治难度较大。过去多年中，选育抗病品种、轮作和施用化学杀菌剂等已被广泛证明其防治的有效性，然而，随着现代化农业要求升级，这些措施的局限性逐渐显现，亟待寻求一种更加环保、高效的防治策略［2］。

土壤有机改良可以在目前集约化的耕作制度下，通过有效影响土壤微生物群落结构来提高土壤肥力，进而实现防治病害和改良土壤的双重功能［3］。作为土壤改良的主要策略之一，堆肥处理不仅可以绿色无害化处理有机废弃物，还可以防控土传病害，对于经济可持续健康发展具有重要意义［4-5］。已有大量研究表明，堆肥及其浸提液可以抑制多种病原真菌和细菌，尤其对土传病害具有显著的防治效果［6-9］。未来农业发展需要综合的策略来帮助防御植物病害，因而堆肥及其浸提液的抗菌防病研究已发展为废弃物资源化利用以及绿色生态植保等领域的研究热点。

鉴于此，本研究以蘑菇渣、浒苔粉、玉米秸秆、凹凸棒和生物炭按照不同组合制备的4种堆肥为研究对象，通过体内和体外2种试验方法揭示其对烟草黑胫病的生防效果，以期为堆肥在植物土传病害防治方面的研究和应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试堆肥经好氧堆制而成，由中国农业科学院烟草研究所提供。堆肥各处理及成分包括：CK0：蘑菇渣+浒苔粉+玉米秸秆，A：蘑菇渣+浒苔粉+玉米秸秆+凹凸棒，B：蘑菇渣+浒苔粉+玉米秸秆+生物炭，AB：蘑菇渣+浒苔粉+玉米秸秆+凹凸棒+生物炭。4种堆肥的主要理化性质见表1。以不添加堆肥处理为对照（CK）。供试土壤为取自中国农业科学院烟草研究所即墨试验基地的大田土与育苗基质（质量比为7 ∶3）混合后的土壤，基本理化性质为［10］：pH值 5.26，速效磷含量1.95 mg/kg，速效钾含量308.44 mg/kg，铵态氮含量239.63 mg/kg，硝态氮含量114.03 mg/kg，有机质含量107.79 g/kg。供试烟草品种为小黄金1025，供试菌株为烟草疫霉（P. nicotianae），均由中国农业科学院烟草研究所提供。供试培养基为燕麦琼脂（OA）培养基，1 000 mL 反渗透（RO）水加30 g燕麦煮沸20～30 min，双层纱布过滤得滤液，定容至 1 000 mL，加入18 g琼脂粉，搅拌均匀后121 ℃高温灭菌 20 min，转移至65 ℃烘箱备用。

1.2 试验设计

1.2.1 堆肥浸提液体外抑菌试验

取4 g堆肥按 1 ∶5（质量体积比）加入20 mL RO 水置于摇床于 28 ℃ 150 r/min 振荡12 h后用200目筛绢过滤，得到的滤液即为原液，放置于4 ℃冰箱备用。为同时考虑堆肥中微生物的作用，试验设计了灭菌处理液：将上述得到的原液取部分置于50 mL锥形瓶中，121 ℃ 灭菌20 min制得灭菌处理液。

抑菌试验采用菌丝生长速率法［11］。取预先制备好并在65 ℃烘箱中保存的OA培养基10 mL，精确吸取0.1 mL堆肥浸提液加到培养基中，轻轻摇晃混匀后倒入培养皿中。对照采用等量灭菌水代替堆肥浸提液。待培养基凝固后，将烟草黑胫病菌菌饼样品接入OA板中心，放入28 ℃培养箱中培养，待对照组菌丝长至4/5平板时，用十字交叉法测量菌落直径，根据以下公式计算抑制率。每个处理设置3个重复。

菌落直径=测量菌落直径-0.5 cm；

菌丝生长相对抑制率=对照菌落直径-处理菌落直径对照菌落直径×100%。

1.2.2 盆栽试验

将堆肥按照2%比例（质量比）与盆栽土混合后，再与菌谷混匀（3 g菌谷，160 g土壤）作为病土。选取生长一致的烟苗伤根处理后移栽至花盆中，每盆1株，置于人工气候箱中培养。每个处理12株烟苗，重复3次。

1.3 调查内容与方法

1.3.1 扫描电镜观察菌丝形态

为了直观地了解体外抑菌试验中烟草黑胫病菌的受抑制方式，通过扫描电镜做进一步观察。分别在对照组和原液组的菌落边缘切取若干个体积为0.5 cm3的样品，置于2.5%戊二醛溶液固定后，将样品送至青岛大学医学部，对样品进行镀膜处理，用于扫描电镜观察并获取照片。

1.3.2 发病情况调查

移栽后，每隔1 d统计发病率和病情指数，并计算防效。烟草黑胫病分级标准见表2。

发病率、病情指数和相对防效计算公式如下：

发病率=发病株数调查总株数×100%；

病情指数=∑（各级病株数×该病级值）调查总株数×最高级值×100；

防效=对照组病情指数-处理组病情指数对照组病情指数×100%。

1.3.3 农艺性状调查

每个处理选取3株代表性烟株，根据YC/T 142—2010《烟草农艺性状调查测量方法》标准测定株高、叶片数、最大叶长、最大叶宽及最大叶面积。

1.3.4 植物防御酶活性及丙二醛含量测定

取相同部位的叶片，每个处理取3张，液氮快速冷冻后采用全自动样品快速研磨仪将叶片磨成粉末，称取0.1 g左右样品置于2 mL离心管中，保存在-80 ℃冰箱中待测。超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）活性及丙二醛（MDA）含量均按照试剂盒上的方法测量，试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。

1.3.5 土壤理化性质和酶活性的测定

取盆栽土自然风干后过40目筛，测定土壤理化性质，包括pH值（雷磁PHS-3C pH 计）、有机质含量（重铬酸钾容量法）、速效钾含量（NH4OAc浸提-火焰光度计法）以及铵态氮、速效磷含量（SKALAR SAN++连续流动注射分析仪）；测定土壤酶活性，包括土壤酸性磷酸酶（S-ACP）和土壤脲酶（S-UE）。2种酶活性测定均采用试剂盒法，试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。

1.4 数据处理

采用SPSS 25.0 软件进行差异显著性检验（Duncans 新复极差法，α=0.05），并用Excel 2019进行绘图。

2 结果与分析

2.1 不同堆肥浸提液对烟草黑胫病病原菌的抑制作用

烟草黑胫病病原菌在含有不同处理液的培养基中生长状况如图1所示，堆肥浸提液对菌丝生长的抑制作用总结在表3中。不同堆肥浸提液均表现出了相同的抑制规律，即菌丝在原液中生长受到的抑制显著强于高温灭菌液；且不同堆肥原液的抑制效果存在差异，其中堆肥AB浸提液的抑制效果最好，抑制率达85.54%。结果表明，堆肥浸提液原液明显抑制烟草黑胫病菌生长，浸提液经过高温灭菌处理后，其中含有的微生物被破坏杀死，导致浸提液失去抑制功能，而原液中的微生物可能通过竞争、寄生以及拮抗等作用对烟草黑胫病菌起到抑制效果。

2.2 扫描电镜分析堆肥浸提液对烟草黑胫病病原菌的抑制方式

结果表明，对照组的菌丝体形态正常、健康饱满、匀质光滑，菌丝表面没有明显的破损、凹陷和干瘪等现象（图2-A）；在堆肥浸提液原液处理下菌丝体发生断裂，菌丝萎缩、粗细不均，菌丝表面被细菌附着并发生明显破损（图2-B），且部分菌丝体扭曲变形、干瘪凹陷成片状，内容物已经基本泄漏（图2-C）。

2.3 不同堆肥处理对盆栽烟草的防病促生效果

2.3.1 对烟草黑胫病的防控效果

由表4可以看出，与CK相比，施用堆肥降低了烟草黑胫病的发病率及病情指数，对烟草黑胫病具有一定程度的防控效果。堆肥A和AB这2个处理发病率均为0%，防效达100.00%；其他处理出现不同程度的发病，CK0处理发病率较低，为8.33%，较CK降低了85.72%，防效可达84.21%；B处理发病率较CK降低了28.56%，防效为19.30%。可见添加堆肥能有效减轻黑胫病的发生程度，但不同配方的堆肥对烟草黑胫病的控制效果存在一定程度的差异。

2.3.2 对盆栽烟草生长状况的影响

由表5可知，不同堆肥处理与CK相比，株高和叶片数差异不显著，但对叶片数的促进作用要强于株高，效果较好的处理为CK0、A和AB，较CK分别提高了28.42%、53.58%和28.42%。堆肥处理后最大叶长、最大叶宽和最大叶面积较CK显著增加，增幅分别为34.65%～57.35%、25.28%～51.66%和70.15%～138.91%。添加堆肥对烟株的农艺性状有明显的改善作用；在各堆肥处理中，以CK0处理的烟株长势最好，促生效果最为明显。

2.4 不同堆肥处理对烟株叶片内防御酶活性及丙二醛含量的影响

2.4.1 对SOD活性的影响

SOD被认为是一种重要的自由基清除剂，它能够维持机体的代谢平衡，并可在植物和病原体之间的识别过程中提供初始抗性信号［12-13］。图3结果显示，与CK相比，添加堆肥处理的烟株叶片内SOD活性显著降低，其中A处理降幅最大，为63.28%；其次为CK0处理和AB处理，分别下降60.57%和38.82%；在各堆肥处理中，B处理SOD活性最高，仍比CK下降24.33%。结合表3中发病率和病情指数数据，推测在CK和B处理中，烟草黑胫病病原菌侵染烟株后导致自由基积累，促使SOD表达用于清除自由基；而CK0、A和AB处理中SOD活性较低，可能由于堆肥很好地抵御了病原菌的入侵，减轻了病菌对烟株的伤害。

2.4.2 对POD活性的影响

POD在植物体内广泛存在，它能够促进木质素、植物生长激素和酚类化合物的生成，使细胞壁增厚来抵御病原菌的入侵，是植物抗病有关的防御酶［13-14］。由图3可知，CK受病原菌胁迫严重，POD活性显著升高，达 2 994.37 U/g；添加堆肥处理的POD活性显著降低，降幅为62.37%～78.22%，其中A处理POD活性最低，为652.28 U/g，其次为AB处理，POD活性为807.94 U/g，CK0、B处理POD活性分别为 1 126.64、1 045.93 U/g。结合表3，推测出现这类情况的原因与SOD相似，即堆肥通过对病原菌的抑制作用，抵御了病菌入侵烟株。

2.4.3 对MDA含量的影响

MDA是膜脂过氧化的关键产物之一，其生成会加重膜的破坏，因此可利用MDA来反映膜脂过氧化的程度，并间接测定膜系统受损程度以及植物的抗逆性［15］。MDA含量越高，说明植物细胞膜质过氧化程度高，从而表明细胞膜受到的伤害越严重。图3结果显示，未添加堆肥处理的烟株叶片中MDA含量最高，达 5.81 nmol/g，说明CK叶片细胞膜受到的损伤最严重；添加堆肥处理的叶片中MDA含量均显著低于CK，且A处理下MDA含量最低，为3.69 nmol/g，较CK下降了36.49%；CK0、B和AB处理MDA含量较CK分别下降了28.03%、21.94%和17.81%。说明添加堆肥显著抑制了烟株体内细胞膜脂过氧化过程，减少了细胞受到的伤害。综合上述指标，可知堆肥A的抗病效果最明显。

2.5 不同堆肥处理对土壤理化性质及酶活性的影响

2.5.1 对理化性质的影响

从表6可以看出，堆肥处理对土壤理化性质影响显著。相比CK，堆肥处理土壤pH值和速效钾含量分别增加6.25%～9.63%和33.93%～62.23%，且2个指标均在AB处理下增幅最大。堆肥处理提升速效磷含量效果明显，在CK0处理下可提高147.21%。各堆肥处理的有机质含量与CK相比差异不显著。这也表明堆肥处理下烟株农艺性状改善与土壤中磷、钾等营养元素含量升高有关。

2.5.2 对酶活性的影响

土壤磷酸酶是催化土壤有机磷转化为无机磷的酶类，是评价土壤磷素生物转化方向和强度的重要指标［16］。由图4可知，各堆肥处理S-ACP活性均高于CK，分别提高12.45%、2.06%、20.90%、1.11%，主要是由于施用堆肥后积累的大量磷反应底物刺激土壤微生物分泌了较多的酸性磷酸酶［17］。土壤脲酶活性增强能有效促进土壤中的有机氮向无机氮转化［18］。与CK相比，S-UE 活性在CK0和A处理下分别提高20.78%和19.55%；B处理提高了13.00%。AB处理较CK没有提高，可能是由于AB堆肥中本身含有大量的铵态氮，含量为829.98 mg/kg。

3 讨论与结论

有研究表明，堆肥浸提液中的拮抗微生物通过竞争、寄生、分泌抗生素等方式对病原菌起抑制作用［7］。此外，浸提液中含有的酚类物质、挥发性脂肪酸以及氨等化合物也具有直接毒性，能够对病原菌产生不利影响［19］。本试验设置堆肥原液和高温灭菌液2种处理，可以有效地区分是生物因素还是非生物因素起作用，以便更好地了解堆肥抑菌机理。Koné等的研究也表明，由多种商业堆肥制成的提取液能显著抑制致病疫霉等多种病原菌的生长，经高温灭菌后则丧失了抑制效果，本研究结果与之一致，由此推断堆肥浸提液中含有的微生物是抑制病原菌的先决条件［20］。结合扫描电镜结果可知，堆肥浸提液中的微生物对烟草黑胫病病原菌的抑制作用具体表现为造成病原菌菌丝变形、断裂，菌丝壁穿洞引起内含物质泄漏。

本试验结果显示，施用堆肥能够显著促进烟株的生长和发育，最大叶宽、最大叶长和最大叶面积等农艺指标均显著增加，说明堆肥对烟株的发育具有很好的促生效果。任小利等关于堆肥对烟草、茄子、番茄等作物的促生增产效果研究也证实此结论：施用堆肥后，堆肥中本身含有的营养物质提高了作物产量形成的能力，且堆肥施用后影响了根际土壤微生物区系，减少了病原菌数量，增加了功能菌数量，从而进一步提高了肥料的利用效率［21-23］。施用堆肥可以有效地防控烟草黑胫病，但不同堆肥的抑制效果存在差异，其中A和AB处理效果最好，CK0次之，B处理最差，可能是由于堆肥B处理中加入的生物炭对土壤微生物的生长产生了不利影响，比如在某些情况下会挥发苯等有毒物质［24-25］。SOD、POD活性与植物抗病性有关，MDA含量反映细胞受损程度。本研究结果表明，施用堆肥后SOD和POD活性均显著低于CK，说明施加堆肥显著抑制了土壤中病原菌的生长繁殖，使病原菌无法成为优势菌，很难迁移到烟株根系完成侵染，烟株没有受到病原菌损害，故防御酶活性较低；而CK处理的MDA含量最高恰好印证了这一解释。堆肥的抑病机理不仅体现在为植物生长提供充足的养分和影响微生物群落的构成，还体现在能够有效地改善植物生长发育的环境条件和土壤的生态环境［26］。本试验结果表明，堆肥中含有较高的氮、磷、钾及其他营养元素，能够明显提高土壤养分含量，促进烟株的生长，且提高了土壤的pH值，改善土壤酸化程度。施用堆肥后，土壤中酸性磷酸酶和脲酶活性提高，两者均由参与养分循环的细菌分泌，说明施肥后促进土壤细菌对肥料养分的转化，张建华等的研究也证明了此观点［8，27］。本研究有效探讨了堆肥防控烟草黑胫病的机制，但添加堆肥对根际土壤微生物多样性和结构的影响有待进一步探索。

堆肥的施用对防控烟草黑胫病具有良好效果，其机理可以总结为以下几点：堆肥中含有的微生物严重抑制了烟草黑胫病病原菌的生长，使其难以侵染烟株；堆肥的施用改善了土壤理化性质，促进了烟株生长发育，提高了其抗逆境胁迫的能力；堆肥的施用提高了土壤酶活性，促进了肥料转化，有效提高了烟株的生长速率。在实际应用中，还应考虑堆肥原料复杂性以及病原菌多样性，从而对土传病害的绿色防控更有针对性和预见性。

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