低温胁迫下工业大麻中大麻二酚含量和差异表达基因分析

摘要：为研究低温胁迫条件下龙大麻6号大麻二酚（CBD）积累的变化规律和合成途径分子调控机制，以不同低温胁迫和常温条件处理大麻叶片为材料，测定CBD含量，同时对上述材料进行转录组测序。通过对不同低温胁迫和常温条件处理大麻叶片CBD含量变化，发现0 ℃处理组（T1）CBD含量最高，其他低温处理组5 ℃处理组（T2）、15 ℃处理组（T3）、20 ℃处理组（T4）大麻叶中CBD含量比常温组（CK）CBD含量低。转录组数据中CBD合成途径关键基因差异表达分析显示，0 ℃处理组CBD合成途径中大部分关键基因表达量都显著上调，同时其他温度胁迫条件下CBD合成途径中大部分关键基因表达量也都有变化。0 ℃能够显著提高龙大麻6号CBD的合成，提高植株体内CBD合成途径中关键基因表达量，从而使其更好地适应低温环境。

关键词：大麻；大麻二酚；低温胁迫；差异表达基因

中图分类号：S563.301 文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2024）15-0072-13

收稿日期：2023-11-17

基金项目：黑龙江省省属科研院所科研业务费项目（编号：CZKYF2023-1-B007）。

作者简介：王文重（1979—），女，博士，副研究员，主要从事工业大麻遗传育种研究。E-mail：wenwen0331@163.com。

通信作者：张利国，博士，研究员，主要从事麻类遗传基础研究。E-mail：zlg86@aliyun.com。

大麻（Cannabis sativa L.）是一种高附加值的多用途经济作物，属于桑科大麻属，广泛分布于世界各地，在我国有着悠久的栽培历史［1-3］。目前国内已审定或认定或登记的大麻品种，都是工业大麻，不含或含有极低神经成瘾性物质，不具毒品利用价值［4］。工业大麻中存在多种大麻素，主要在大麻叶和花中，大麻二酚（cannabidiol，CBD）是其中已被联合国世界卫生组织认可的健康成分，研究表明，CBD无致幻成瘾性，且具有抗惊厥痉挛、癫痫、镇痛、焦虑、抗菌抗炎、抗麻醉和神经系统保护等药理功效，广泛应用于医药和化妆品领域［5-7］。在CBD产业带领下，工业大麻产业有望在未来几年实现强劲增长，到2025年CBD产业预计将达到千亿美元级别［8］。低温是影响植物正常生长的主要障碍之一，大多数植物对低温较为敏感，一旦遭遇低温胁迫，将导致生长受限，产量下降影响植物的生长发育和次生代谢产物的合成［9］。温度是调控植物生长发育和代谢物质积累的重要条件，国内外关于温度对工业大麻生长和CBD积累研究的相关报道较少。黑龙江省地处我国北方，春季播种时间温度较低，对大麻的生长和CBD含量会造成一定的影响。因此需要开展大麻对低温胁迫响应方面的研究，了解大麻在CBD含量变化规律和合成途径分子机制。目前，黑龙江省工业大麻原料来源多样，温度与CBD含量、原料产率存在密切的关系，掌握温度与大麻CBD有效成分含量之间的关系，也为今后利用植物基因工程技术提高工业大麻的品质奠定研究基础，将有效提升花叶用工业大麻产业的市场竞争力与经济效益。

1 材料与方法

1.1 植物材料与处理

试验大麻品种为龙大麻6号，由黑龙江省农业科学院经济作物研究所提供。CK代表常温（25 ℃）处理组；T1代表0 ℃（处理1）处理组；T2代表5 ℃（处理2）处理组；T3代表15 ℃（处理3）处理组；T4代表20 ℃（处理4）处理组。

试验材料2021年种植于黑龙江省农业科学院经济作物研究所实验室人工气候温箱内，培养条件设定为相对湿度80%、光—暗周期14 h—10 h，全程充分供水。分别在0 ℃（处理1）、5 ℃（处理2）、15 ℃（处理3）、20 ℃（处理4）、CK（25 ℃）下进行培养。待植株长大至花期进行取样，为了消除个体差异，选择植株长势、外观表型、部位尽量一致的大麻叶取样，每株大麻取5～8张叶片，3次生物学重复，用锡箔纸包好后于-80 ℃保存备用。

1.2 大麻二酚（CBD）含量测定

分别取不同环境下培养后的鲜大麻叶经85 ℃烘3 h并粉碎后的大麻叶0.200 g，加入甲醇4 mL，采用常温超声提取，提取时间为10 min，静置1 h。4 000 r/min 离心5 min，取上清液转移至10 mL容量瓶中进行定容。使用2 mL注射器装样过 0.45 μm 有机滤膜注射至液相进样瓶，采用HPLC色谱条件分析CBD含量。

1.3 RNA的提取及cDNA文库的合成

使用全式金生物技术有公司试剂盒分别提取处理组和对照组总RNA，并用Bioanalyzer 2100及Agilent RNA6000 Nano Kit对总RNA的完整性和纯度进行分析。

测序由哈尔滨博泰生物科技有限公司完成，使用Illumina HiSeqTM X TEN测序仪进行测序。使用HISAT2将clean reads比对到参考基因组（https：//gofile-3663784363.cn4.quickconnect.cn/fsdownload/QZM0L6zNu/Cannatonic.genome.fasta.gz）。筛选差异表达基因条件为：表达差异倍数 |log2FoldChange|>1，显著性P<0.01。

1.4 qRT-PCR验证

使用全式金生物技术有公司试剂盒提取总RNA后反转录为cDNA，利用Primer 5软件设计引物，采用Actin为内参基因（表1）。

应用全式金公司荧光定量试剂盒进行荧光定量试验，反应体系见表2。反应程序为：94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，57 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，40个循环。应用2-ΔΔCT方法计算相对定量结果。相关基因qRT-PCR引物如表1所示。对筛选的关键基因进行 qRT-PCR，测定相对表达量，比荧光定量试验结果与转录组数据趋势是否一致。

1.5 数据分析

每组试验重复3次，使用Excel软件处理数据及对结果作图，SPSS 25.0软件对数据进行显著性分析（α=0.05）。

2 结果与分析

2.1 不同温度处理大麻二酚（CBD）含量变化

由图1可知，0 ℃处理后CBD含量最高，5 ℃处理后含量最低。处理温度从5 ℃开始，随着处理温度升高，CBD含量逐渐增加，但15℃和20℃处理后，CBD含量差异不显著。

2.2 转录组分析

2.2.1 数据整理 工业大麻植株经过不同温度处理之后，进行相应的转录组测序分析。对每个样品的下机数据（Raw Data）分别进行统计，包括Q30（%）、模糊碱基和GC（%）。统计结果如表3所示，Q30均在90%以上，说明转录组测序数据质量较好，可用于进一步分析。

2.2.2 差异基因表达及富集分析 edgeR以count计数为起始数据，经过TMM标准化后，进行差异表达分析，结果如图2所示。T1与对照组（CK）之间共有5 785个差异基因，其中4 106个上调基因，1 679 个下调基因；T2与对照组（CK）之间共有 4 707 个差异基因，其中2 513个上调基因，2 194个下调基因；T3与对照组（CK）之间共有48 440个差异基因，其中3 343个上调基因，1 497个下调基因；T4与对照组（CK）之间共有4 570个差异基因，其中992个上调基因，3 578个下调基因（图2-A）。结果显示，不同低温处理后，T1-vs-CK（0 ℃/25 ℃）、T2-vs-CK（5 ℃/25 ℃）和T3-vs-CK（15 ℃/25 ℃）上调差异表达基因数大于下调差异表达基因数。T4-vs-CK（20 ℃/25 ℃）下调差异表达基因数远远大于上调差异表达基因数（图2-A）。整体看，处理温度从0 ℃逐渐升高至20 ℃，不同处理组与对照组相比上调基因数逐渐减少，下调基因数逐渐增加，其中T4-vs-CK（20 ℃/25 ℃）组下调基因数是上调基因数的3.6倍。在4个比较组中，T1-vs-CK（0 ℃/25 ℃）组上调表达差异基因，与T2-vs-CK（5 ℃/25 ℃）、T3-vs-CK（15 ℃/25 ℃）和T4-vs-CK（20 ℃/25 ℃）组下调基因进行比较，结果显示33个基因为共有的显著差异基因（图2-B）。T1-vs-CK（0 ℃/25 ℃）组下调表达差异基因，与T2-vs-CK（5 ℃/25 ℃）、T3-vs-CK（15 ℃/25 ℃）和T4-vs-CK（20 ℃/25 ℃）组上调基因进行比较，结果显示11个基因为共有的显著差异基因（图2-C）。这些结果表明，工业大麻在应对不同的低温胁迫时，可以触发相似的反应，同时处理1可能还存在独特的反应和机制。

2.2.3 差异基因的GO富集分析 对不同温度处理工业大麻差异表达基因所具有的功能进行GO功能富集分析，结果发现4组间的差异表达基因分别富集55、48、51、49条GO terms中，这些GO terms属于三大功能类别：细胞成分（CC）、分子功能（MF）、生物进程（BP）。4组分析获得的GO terms很相似。CC中最丰富的成分被归类为膜（GO：0016020，membrane）、细胞膜组分（GO：0044425，membrane part）以及细胞（GO：0005623，cell）。在MF中富集最多的2条GO terms是催化活性（GO：0003824，catalytic activity）和结合（GO：0005488，binding）。在BP中富集最多的3条GO terms是代谢过程（GO：0008152，metabolic process）、细胞进程（GO：0009987，cellular process）和单一有机体过程（GO：0044699，single-organism process）（图3）。

在工业大麻叶片相应温度胁迫处理的基因功能富集中，在BP分类中排在前20的GO terms中主要与合成和代谢相关，包括单一生物过程（GO：0044699，single-organism process）、单生物代谢过程（GO：0044710，single-organism metabolic process）、氧化还原过程（GO：0055114，oxidation-reduction process），此外还有单生物细胞过程（GO：0044763，single-organism cellular process）、细胞或亚细胞成分的运动（GO：0006928 movement of cell or subcellular component）、有机氮化合物代谢过程（GO：1901564，organonitrogen compound metabolic process）、碳水化合物代谢过程（GO：0005975，carbohydrate metabolic process）、果胶分解代谢过程（GO：0045490，pectin catabolic process）（图4）。

2.2.4 差异共表达基因的GO分析

T1-vs-CK（0 ℃/25 ℃）组上调表达差异基因，与T2-vs-CK（5 ℃/25 ℃）、T3-vs-CK（15 ℃/25 ℃）和 T4-vs-CK（20 ℃/25 ℃）组下调基因共表达的33个基因进行GO分析发现，CC中最丰富的成分被归类为膜（GO：0016020，membrane），在MF中是氧化还原酶活性（GO：0016491，oxidoreductaseactivity），在BP中富集最多的是氧化还原过程（GO：0055114，oxidation-reduction process）（图5-A）。T1-vs-CK（0 ℃/25 ℃）组下调表达差异基因，与T2-vs-CK（5 ℃/25 ℃）、T3-vs-CK（15 ℃/25 ℃）和T4-vs-CK（20 ℃/25 ℃）组上调基因共表达的11个基因进行GO分析发现，CC中最丰富最多的2条GO terms是膜（GO：0016020，membrane）和细胞膜组成成分（GO：0016021，integral component of membrane），在MF中是氧化还原酶活性（GO：0016491，oxidoreductase activity），在BP中富集最多的是氧化还原过程（GO：0055114，oxidation-reduction process）（图5-B）。

2.2.5 差异基因的KEGG富集分析

根据差异表达基因的KEGG富集分析结果，分别有139、136、134、127个代谢途径参与了T1-vs-CK（0 ℃/25 ℃）、T2-vs-CK（5 ℃/25 ℃），T3-vs-CK（15 ℃/25 ℃）和T4-vs-CK（20 ℃/25 ℃）组。主要包括玉米素生物合成（zeatin biosynthesis）、光合作用（photosynthesis）、植物MAPK信号通路（MAPK signaling pathway-plant）、代谢通路（metabolic pathways），还有次级代谢物的生物合成（biosynthesis of secondary metabolites）、淀粉和蔗糖代谢（starch and sucrose metabolism）、黄酮和黄酮醇生物合成（flavone and flavonol biosynthesis）、戊糖磷酸途径（pentose phosphate pathway），戊糖和葡萄糖酸盐相互转化（pentose and glucuronate interconversions）和错配修复（mismatch repair）。本研究中由不同温度处理后调控的排在前20的代谢途径如图6所示。这些结果表明，在不同温度处理下，工业大麻的叶片会积极调整自身代谢以增加环境适应的能力。

2.2.6 CBD合成途径基因响应不同温度胁迫

植物大麻素生物合成途径分为3个催化步骤：（1）聚酮合成（polyketide formation）；（2）异戊烯化（prenylation）；（3）氧化环化（oxidative cyclization）。本研究中发现低温胁迫也能够诱导CBD合成途径相关基因表达。橄榄醇合成酶（olivetol synthase，OLS）和橄榄酸环化酶（olivetolic acid cyclase，OAC）是聚酮合成途径中的关键酶。在所有的显著差异表达基因中，有3个基因被注释为OLS，为T1-vs-CK（0 ℃/25 ℃）组和T3-vs-CK（15 ℃/25 ℃）组共有的差异基因CsCAN_00G0063150，低温胁迫后显著上调表达。基因CsCAN_00G0217670和CsCAN_00G0066890在受到低温胁迫时下调表达（图7）。基因CsCAN_00G0063150，CsCAN_00G0066890和CsCAN_00G0217670 GO富集为BP条目生物合成的过程（GO：0009058，biosynthetic process）。基因CsCAN_00G0063150还参与查尔酮生物合成过程（GO：0009715，chalcone biosynthetic process）和大麻素生物合成过程（GO：1901696，cannabinoid biosynthetic process）。

在所有的显著差异表达基因中，1个OAC（CsCAN_00G0220930）为4个温度处理共有的差异基因，还有另外1个OAC（CsCAN_00G0204700）为T1-vs-CK（0 ℃/25 ℃）组和T2-vs-CK（5 ℃/25 ℃）组共有的差异基因，上述基因在受到低温胁迫之后均显著上调表达。

大麻戊烯基转移酶1（cannabis sativa prenyltransferase 1，CsPT1）和烯戊烯基转移酶4（cannabis sativa prenyltransferase 4，CsPT4）已被证明在大麻素生物合成途径中催化产生大麻二酚酸（cannabigerolic acid，CBGA）的步骤，CBGA是产生大麻二酸（CBDA）和四氢大麻酚酸（THCA）的终点酶的底物。在所有的显著差异表达基因中，有8个基因被注释为PT，这些基因中没有响应4个胁迫所共有的差异基因。在T1-vs-CK（0 ℃/25 ℃）组和T3-vs-CK（15 ℃/25 ℃）组温度胁迫处理下，有5个PT共有的差异基因，除CsCAN_00G0027410之外其他均显著上调表达（图7）。T4-vs-CK（20 ℃/25 ℃）温度胁迫处理下，2个PT均下调表达。其中CsCAN_00G0202190属于叶绿素生物合成过程（GO：0015995，chlorophyll biosynthetic process）。

大麻二酚合成酶（cannabidiolic acid synthase，CBDAS）催化CBGA单萜部分氧化环化，分别转化为大麻二酸（cannabidiolicacid，CBDA）。在所有的显著差异表达基因中，有29个基因被注释为CBDAS。其中21个CBDAS响应T1-vs-CK（0 ℃/25 ℃）组温度胁迫处理，10个CBDAS响应T2-vs-CK（5 ℃/25 ℃）组温度胁迫，14个CBDAS响应T3-vs-CK（15 ℃/25 ℃）组温度胁迫，13个CBDAS响应T4-vs-CK（20 ℃/25 ℃）组温度胁迫。除CsCAN_00G0100790之外，其他28个基因GO富集为BP条目氧化还原过程（GO：0055114//oxidation-reduction process）。

2.2.7 差异基因的qRT-PCR验证

为了验证由RNA-seq测序获得的基因表达模式的准确性，通过qRT-PCR检测了CBD生物合成途径中10个DEG的表达模式（图8）。比较了用qRT-PCR检测的基因的表达量在T1（0 ℃/25 ℃）、T2（5 ℃/25 ℃）、T3（15 ℃/25 ℃）和T4（20 ℃/25 ℃）4个比较组之间的相对表达情况。所选基因的qRT-PCR检测的相对表达趋势与RNA-seq检测的表达趋势一致，说明RNA-seq数据是可靠的，重复性好。

3 讨论

首先，本研究探讨了不同温度处理下工业大麻植株CBD积累的规律，结果表明：与对照（25 ℃）相比，T1组（0 ℃）处理后CBD含量最高，表明0 ℃对大麻CBD含量有一定的影响。T2组（5 ℃）、T3组（15 ℃）和T4组（20 ℃）与对照常温组（25 ℃）相比CBD含量均有所下降，其中T2组（5 ℃）CBD含量最低。随着处理温度的升高，从5 ℃到20 ℃，CBD含量缓慢上升，但始终低于常温对照组。由此可见，0 ℃短时处理后会提高大麻CBD含量，但短时 5～20 ℃之间，短时处理会减低大麻CBD含量。可能与植物体对温度的适应机制有关，在5～20 ℃这个温度范围内，持续较低温度使得工业大麻生长变慢，低温抑制地上部生长，使得干物质积累量减少［10-11］。

其次，试验研究了低温胁迫对工业大麻CBD含量的调控作用，通过不同温度处理后对大麻叶片进行转录组分析，发现在T1-vs-CK组（0 ℃/25 ℃）上调基因数量最多，且差异表达基因上调数远多于下调数。另外对于差异共表达基因进行GO分析发现，三大功能类别中膜（GO：0016020，membrane）、氧化还原酶活性（GO：0016491，oxidoreductase activity）和氧化还原过程（GO：0055114，oxidation-reduction process）富集最多。由于植物受到低温胁迫时会促进细胞内活性氧的产生，推测温度处理可能影响了大麻细胞内的氧化还原反应。植物次生代谢物的合成不仅是一类有用的天然产物，而且是植物抵抗环境胁迫防御系统的重要组成。转录组测序检测到的DEG相关功能主要集中在膜系统结构、碳水化合物（蔗糖和淀粉）代谢、次生代谢产物合成等代谢通路。本研究对KEGG富集分析发现，植物MAPK信号通路（MAPK signaling pathway -plant）、次级代谢物的生物合成（biosynthesis of secondary metabolites）、代谢通路（metabolic pathways）等通路显著富集，表明温度处理影响了次生代谢。Shan等的研究表明，结缕草在低温胁迫下（4 ℃）能够激活植物体内氧化应急反应、MAPK信号通路、类黄酮和异黄酮生物合成和萜类主干物质生物合成等次生代谢产物通路富集显著。

大麻素的前体实际上起源于2种不同的生物合成途径：聚酮合成（polyketide formation）途径和非甲羟戊酸途径（MEP pathway）［12］。橄榄醇合成酶（OLS）和橄榄酸环化酶（OAC）是聚酮合成途径中的关键酶，在它们的作用下产生橄榄酸（olivetolic acid，OLA）。脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶（DXS）是MEP途径中的第一个酶，在植物激素调控、逆境抗性和病原体防御等生理过程中发挥着重要作用［13］，MEP途径最终合成焦磷酸香叶酯（geranyl diphosphate，GPP）。转录组数据分析发现有3个差异表达基因被注释为OLS基因，2个差异表达基因被注释为OAC基因，2个差异表达基因被注释为DXS基因，上述7个差异表达基因在T1-vs-CK组（0 ℃ /25 ℃）均上调表达，且在4个处理组中表达量最高。由此可见，T1组（0 ℃）处理促进提高OLS、OAC和DXS基因的表达，进而提高CBD含量。大麻异戊烯转移酶4（CsPT4）和1（CsPT1）是大麻素生物合成的限速酶，催化GPP和OLA产生大麻二酚酸（CBGA）［14］。转录组数据共有8个差异表达基因被注释为PT基因，6个差异表达基因在 T1-vs-CK组（0 ℃/25 ℃）上调表达，上调表达的基因数量明显高于其他处理组。大麻二酚合成酶（CBDAS）催化CBGA单萜部分氧化环化，转化为大麻二酸（CBDA）。本研究数据中共有29个差异表达基因被注释为CBDAS基因，13个差异表达基因在T1-vs-CK组（0 ℃/25 ℃）上调表达，上调表达的基因数量明显高于其他处理组。

4 结论

温度与植物生长发育、有机物产量的积累密切相关，不同温度处理后对大麻CBD的含量和调控通路产生了不同影响。本研究中，0 ℃能显著增加工业大麻叶中CBD含量，其机理可能是通过影响合成通路中OLS、OAC、PT、DXS和CSDAS关键酶基因的表达进而提高CBD含量。

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