外源褪黑素提高马铃薯幼苗UV-B辐射耐性的转录组学分析

摘要：随着人类活动对大气层臭氧的破坏，导致到达地面的UV-B辐射增强，而严重的UV-B辐射会直接导致马铃薯产量、品质大幅度降低。马铃薯作为云南省重要的粮食作物，由于云南省具有特殊的地理位置，使马铃薯面临的UV-B辐射较为严峻。为探究褪黑素对增强马铃薯耐UV-B辐射的分子机制，以马铃薯品种合作88为试验材料，对外源褪黑素处理UV-B辐射下的马铃薯叶片进行转录组测序，并进行基因本体（gene ontology，GO）功能聚类分析及京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）功能聚类分析。结果表明，褪黑素可以促进马铃薯植株中缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成及精氨酸、脯氨酸代谢，提高内质网上蛋白质的加工水平，促进抗氧化物质编码基因的表达，激活UVR8等UV-B辐射的响应基因，从而缓解UV-B辐射对马铃薯植株的危害。综上所述，适量浓度的褪黑素对提高马铃薯耐UV-B辐射有积极作用，研究结果可为马铃薯抗UV-B辐射机制解析提供新的证据，并为其抗UV-B辐射研究提供一定的分子基础。

关键词：马铃薯；UV-B辐射；褪黑素；转录组；GO功能分析；KEGG分析

中图分类号：S532.01 文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2024）15-0064-08

收稿日期：2023-08-22

基金项目：海梅荣-科研发展基金（编号：KX900078000）。

作者简介：刘 莹（1999—），女，新疆喀什人，硕士研究生，主要从事作物生理生态与产量品质形成方面的研究。E-mail：1430441802@qq.com。

通信作者：海梅荣，博士，教授，硕士生导师，主要从事作物生产生理方面的研究。E-mail：2250029499@qq.com。

近年来，随着科技及工业等人类生产活动的发展，导致大气中的臭氧层变薄，臭氧含量减少。臭氧减少后会导致到达地表的紫外线B（UV-B）辐射量大大增加，从而对作物产生一定危害［1］。目前，UV-B辐射的加剧已经成为公认的全球十大环境问题之一［2］。根据Mckenzie的预测，再过30～40年，臭氧层的恢复也难以到达20世纪80年代的水平［3］。而臭氧层的减少和UV-B辐射的增加呈现1 ∶2的关系。已有研究发现，UV-B辐射增加会导致植物生长受到抑制［4］，从而降低植物生物量［5］，破坏植物的细胞结构，减少植物的净光合作用，诱导植物中的毒性氧自由基增加，降低植物的抗氧化酶活性，导致植物膜脂过氧化，严重时甚至会改变细胞代谢，导致植物细胞死亡［6-8］。

前人研究发现，褪黑素可以调节植物的生长发育、调控光合效率及叶片衰老，增强植物对冷热、渗透压、干旱、重金属等胁迫的耐受性［9-11］。根据前期生理试验结果，褪黑素可以缓解UV-B辐射对马铃薯生长的抑制作用，但是目前关于增强UV-B辐射后褪黑素对马铃薯分子水平影响的研究较少。因此，本试验拟通过外源施加褪黑素，研究褪黑素对增强UV-B辐射下马铃薯耐UV-B辐射的分子机制，从而为马铃薯抗UV-B辐射的机制解析提供新的证据，并为其抗UV-B辐射的研究提供一定的分子基础。

1 材料与方法

1.1 试验地及试验品种

本研究在云南农业大学试验基地大棚进行盆栽试验，试验材料为合作88。

1.2 试验设计

待马铃薯幼苗生长至株高15 cm左右时进行处理。试验所选的UV-B辐射强度、褪黑素浓度、处理方式均基于前期生理试验结果［12］。当UV-B辐射强度为2.5 kJ/（m2·d），外源褪黑素浓度为 25 μmol/L 时，缓解效果最优，因此选择该处理条件下的马铃薯叶片进行转录组测序。共设计如下4个处理：CK为对照；T1处理，25 μmol/L褪黑素；T2处理，2.5 kJ/（m2·d）UV-B辐射；T3处理，25 μmol/L褪黑素+2.5 kJ/（m2·d）UV-B辐射。使用在线数据分析平台（https：//www.omicshare.com）进行差异基因的分析、基因功能注释、基因本体（gene ontology，GO）以及京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析及关键通路分析，筛选与抗UV-B辐射相关的响应基因。

2 结果与分析

2.1 转录组测序结果统计

在本次高通量测序中，对下机后经初步过滤得到的clean reads进一步进行更严格的过滤，得到高质量的基因序列，以39 028条基因作为参考，供后续信息分析。由表1可知，对12个样本进行测序得到的已知基因数介于21 204～22 179个之间，新基因数介于2 968～3 085个之间。由表2可以看出，CK组已知的基因数为21 590 个，占测序总基因数的55.32%，发现的新基因数量为3 002个，检测的总基因数为24 592个；T1处理的已知基因数为 21 937 个，占测序总基因数的56.21%，发现的新基因数为3 033个，检测的总基因数为24 970个；T2处理的已知基因有21 964个，占测序总基因数的56.28%，发现的新基因有3 052个，检测的总基因数为25 016个；T3 处理中，已知基因有21 907个，占测序总基因数的56.13%，发现的新基因有3 037个，检测的总基因数为24 944个。

2.2 基因表达分析结果

2.2.1 所有样品间基因表达水平分析 图1-B为基因相对表达量的小提琴图，一般用于基因丰度表达的可视化分析，可以展示任意位置的数据密度。综合图1-A、图1-B可以看出，转录组测序数据检测基因的表达灵敏度高，有利于差异表达基因的筛选。

2.2.2 不同处理间的差异表达基因分析 主成分分析（principal component analysis，PCA）结果显示，处理间差异显著，表明所取样本具有代表性（图2-A）。为了获得可靠的基因表达谱，选取log2（FC）＞1的reads进行差异表达基因（differentially expressed genes，DEG）注释。如图2-B所示，从CK vs T1处理的比较组中共鉴定到287个基因上调表达，301个基因下调表达； 在CK vs T2处理组的差异表达基因中，有46个基因上调表达，41个基因下调表达；在CK vs T3处理组的差异表达基因中，有436个基因上调表达，584个基因下调表达；在T1处理vs T2处理组的差异表达基因中，有305个基因上调表达，568个基因下调表达；在T1处理vs T3处理差异表达基因中，有13个基因上调表达，15个基因下调表达；在T2处理vs T3处理组的差异表达基因中，有376个基因上调表达，351个基因下调表达。在CK vs T2处理、T2处理vs T3处理2组中，上调表达的基因数量略多于下调表达的基因数量；在CK vs T1处理、T1处理vs T3处理2组中，上调表达的基因数量略低于下调表达的基因数量；在CK vs T3处理、T1处理vs T2处理2组中，上调表达的基因数量明显低于下调表达的基因数量。

2.3 马铃薯共同响应UV-B和褪黑素基因的分析

由图3可以看出，在CK vs T1处理组中，上调表达的基因有287个，下调表达的基因有301个；在CK vs T2处理组中，上调表达的基因有46个，下调表达的基因有41个；在CK vs T1处理组、CK vs T2处理组中共同上调表达的基因有8个，共同下调表达的基因有13个。

2.3.1 CK vs T1处理和CK vs T2处理共同上调表达基因GO功能富集分析与KEGG功能富集分析 对在CK vs T1处理组、CK vs T2处理组中共同上调表达的8个基因进行GO功能富集分析，如图4-A所示，在生物进程中，DEG主要参与代谢过程、细胞过程和单生物过程；在细胞组分中，DEG主要参与细胞、细胞组分、细胞器；在分子功能中，DEG主要参与催化活性、绑定和分子功能调节剂。

KEGG功能富集分析结果显示，差异基因显著富集在缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成及精氨酸和脯氨酸代谢途径（图4-B）。对共同上调表达的基因中参与缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成的基因（编号：PGSC000/68nfq6NGi0SfAfhhvyMzZjyJcDoBvyEoioX1bolg3s=3DMG400012987）及精氨酸、脯氨酸代谢的基因（编号：PGSC0Z003DMG400009959）作热图分析（图4-C），发现在UV-B辐射条件下，施加褪黑素后这2类基因高度表达，说明外源施加褪黑素能促进植物对缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的合成，并提高精氨酸、脯氨酸的代谢能力，从而对抗UV-B胁迫。

2.3.2 CK vs T1处理和CK vs T2处理共同下调表达基因GO功能富集分析与KEGG功能富集分析 对CK vs T1处理组和CK vs T2处理组中共同下调表达的13个基因进行GO功能富集分析。由图5-A可以看出，在生物过程中，DEG主要参与细胞过程、生物过程的调控和生物调节等过程；在细胞组分中，DEG主要参与细胞、细胞组分、细胞器；在分子功能中，DEG主要参与核酸结合转录因子活性和催化活性。

进一步利用KEGG对下调表达的差异表达基因进行分析，图5-B显示，KEGG的功能富集在甘油脂代谢和代谢途径。对甘油脂代谢相关的基因作了热图分析，图5-C结果表明，CK中甘油酯代谢相关的基因高表达，其他处理组基因的相对表达量并不高，说明当有增强UV-B辐射或者在外源褪黑素出现的情况下，马铃薯植株中的甘油酯代谢被抑制。

2.4 褪黑素提高马铃薯耐UV-B辐射的基因分析

2.4.1 褪黑素正调控提高马铃薯耐UV-B辐射的基因分析 由图6可知 CK vs T2处理组中下调表达的基因有41个，T2处理vs T3处理组中上调表达的基因有376个，CK vs T2处理组中下调表达的基因与T2处理vs T3处理组中共同上调表达的基因有9个；CK vs T2处理组中上调表达的基因有46个，CK vs T2处理组中上调表达的基因与T2处理vs T3处理组中共同上调表达的基因有1个。

对在CKvsT2处理组中下调表达与在T2处理vs T3处理组中上调表达交集的9个基因进行GO功能富集分析，结果见图7-A。在生物进程中，DEG主要参与细胞过程、多有机体过程和应激反应；在细胞组分中，DEG主要参与细胞、细胞组分、细胞器；在分子功能中，DEG主要参与催化活性和绑定。

进一步利用KEGG对差异表达基因进行分析，图7-B显示，KEGG功能富集在内质网中的蛋白质加工。对内质网中与蛋白质加工相关的基因作热图分析，由图7-C可以看出，在CK组中内质网上的蛋白质加工相对活跃。施加外源褪黑素后，内质网上的蛋白质加工表现得最为活跃。在增强UV-B辐射的条件下，未施加外源褪黑素时，内质网上蛋白质加工的活跃程度小于增强UV-B辐射的条件下施加外源褪黑素处理的马铃薯植株。说明施加外源褪黑素能提高内质网上的蛋白质加工水平，从而提高马铃薯植株的抗逆性。

2.4.2 褪黑素负调控增加对马铃薯耐UV-B辐射的基因分析 由图6可知，在T2处理vs T3处理组中，下调表达的基因有351个；在CK vs T2处理组中上调表达的基因与T2处理vs T3处理组中下调表达的基因有15个；在T2处理vs T3处理组中下调表达的基因有351个；在CK vs T2处理组、T2处理vs T3处理组中共同下调表达的基因有1个。

对在CK vs T2处理组中上调表达与T2处理vs T3处理组中下调表达间交集的15个基因进行GO功能富集分析。如图8-A所示，在生物过程中，DEG主要参与细胞过程、单生物过程和代谢过程；在细胞组分中，DEG主要参与细胞、细胞组分等；在分子功能中，DEG主要参与催化活性和绑定。

KEGG功能富集分析结果（图8-B）显示，差异基因显著富集在次级代谢产物合成途径和精氨酸、脯氨酸代谢合成途径，因此本研究对次生代谢产物合成的相关基因和精氨酸、脯氨酸代谢合成的相关基因作了热图分析。由图8-C可以看出，T2处理中精氨酸、脯氨酸相关基因的表达优于其他处理，说明当马铃薯植株受到UV-B胁迫时，可以通过自身合成精氨酸、脯氨酸来对抗胁迫。

2.4.3 褪黑素介导UV-B受体基因和抗氧化物质基因的表达 如图9所示，UV-B受体UVR8等大量下游基因在T2处理组上调表达，部分在CK处理组上调表达，但在T1处理组下调表达，表明施加外源褪黑素会抑制UV-B受体基因的表达。在褪黑素介导马铃薯耐UV-B辐射的抗氧化系统中，大量抗氧化物相关基因参与增强UV-B辐射的表达。有18个基因在T2处理组上调表达，剩下的13个基因在T2处理组中下调表达但在T3处理中的相对表达量相对T2处理上调，表明褪黑素会促进抗氧化物质基因的表达。

3 讨论

对CK vs T1处理组和CK vs T2处理组中共同上调表达的基因进行KEGG分析，差异基因显著富集在缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成及精氨酸和脯氨酸代谢途径。在T1、T2处理组中，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成及精氨酸和脯氨酸代谢相关基因的上调表达量明显高于CK组，T3处理组相较于T1、T2处理组的基因上调表达程度更高，表明外源褪黑素、UV-B辐射的增强都可以使缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成量上调，使精氨酸、脯氨酸代谢相关基因上调表达，且当2种处理条件加成时，其效果更大。氨基酸是蛋白质的构成单位，马铃薯在面对UV-B逆境胁迫时或许可以通过调控氨基酸的合成从而产生逆境蛋白来提高对逆境的耐受性。

对CK vs T2处理组中上调表达与T2处理vs T3处理组中下调表达交集的基因进行KEGG分析发现，T2处理组中的精氨酸、脯氨酸相关合成基因上调表达，但在T1、T3处理组中并没有发现这种现象，表明增强UV-B辐射会使马铃薯幼苗中精氨酸、脯氨酸合成相关基因上调表达，而外源褪黑素的施加并不会上调精氨酸、脯氨酸相关基因的表达量。脯氨酸相对表达量在前面的试验中进行过测定，发现在未增强UV-B的情况下，确实出现了施加外源褪黑素后其浓度降低的现象，结合分子生物学数据，发现在未增强UV-B时，施用外源褪黑素会抑制脯氨酸的合成，在增强UV-B辐射的条件下，未施加褪黑素的植株中脯氨酸含量低于施加外源褪黑素的植株，其原因可能是虽然施加外源褪黑素会使脯氨酸的合成基因下调表达，但有可能会间接激活其他途径，从而合成脯氨酸，因为大量试验证明，在胁迫环境中施加外源褪黑素有利于提高脯氨酸的含量［13-15］。精氨酸是参与植物众多生理过程信号分子多胺和一氧化氮的前体物质，也是植物体内重要的氮素储藏营养物质［16］。有研究发现，外源多胺能够提高植物的光合色素水平，增强光合能力和抗氧化能力，从而提高植物的耐胁迫能力，保护植物不受逆境的伤害［17］。一氧化氮是一种脂溶性生物活性分子，能够在细胞内扩散，从而诱导防御基因的表达，它通过对蛋白质进行翻译后修饰及与其他信号分子的互作来调控植物的防御反应［18］。因此在增强UV-B辐射的条件下，马铃薯幼苗可以通过提高精氨酸、脯氨酸含量来应对辐射胁迫［19］。

在本试验中，T2处理组受到增强UV-B辐射后，马铃薯植株会上调UVR8等相关基因的表达量，从而保护植株免受辐射的损伤，但在T1处理组这些基因都被下调表达了。研究发现，CK组中部分基因是上调表达的，表明马铃薯幼苗自身的内源褪黑素也可以上调部分UV-B受体基因的表达量，但是外源褪黑素的施加并不利于UVR8等相关基因的表达。2002年人们才发现UV-B受体UVR8的存在，编码UVR8的七叶螺旋桨蛋白首先从拟南芥中的UV-B超敏突变体（uvr8-1）中被鉴定出来。在没有UV-B辐射的情况下，UVR8以二聚体的形式存在于细胞质中，二聚体之间通过二聚体界面上带电氨基酸间的盐桥连接在一起，当UVR8中特定色氨酸吸收UV-B射线后，同型二聚体变为活性单体并与组成型光合蛋白1（COP1）相互作用以启动UVR8依赖性信号传导，UVR8的C端有27个氨基酸的区域与COP1的C端wd40重复结构域结合，在受到UV-B辐射后，COP1可引导UVR8进入细胞核，UVR8和COP1之间的相互作用也需要对靶基因进行正向调控，包括HY5、HY5同源基因（HYH），它们编码转录因子，调控UVR8介导反应的1个基因子集［20］。目前，关于UVR8在植物体内的生理功能的研究主要包括抑制下胚轴的生长、促进花青素和类黄酮的积累等［21］。类黄酮是植物抵御UV-B辐射增强的主要物质，对类黄酮含量的测定结果也表明，增强UV-B辐射会使类黄酮含量升高，前面的分子数据分析结果表明，次生代谢产物的合成基因被上调表达，而类黄酮是重要的次生代谢产物。综合分析发现，类黄酮含量升高的原因是次生代谢产物的合成基因被上调表达、UVR8和UV-B受体被激活从而调控与类黄酮合成相关的下游基因的表达。因此，在增强UV-B辐射的条件下，可激活UVR8等UV-B受体来应对UV-B辐射的加强。在T1、T2处理组中，大量抗氧化物基因都上调表达，如与抗坏血酸和谷胱甘肽合成相关的基因，在前面的试验中测定抗坏血酸、谷胱甘肽的含量发现，在施加外源褪黑素、增强UV-B辐射处理下，其含量升高，表明施加外源褪黑素、增强UV-B辐射都可以提高马铃薯幼苗合成抗氧化物质的能力。在T2处理组中下调表达的基因在T3处理组中上调表达，说明在合成抗氧化物质时，施加外源褪黑素和增强UV-B辐射的作用可以互补。

4 结论

通过对GO功能聚类分析及KEGG功能聚类分析，发现褪黑素可以促进马铃薯植株中缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成量及精氨酸、脯氨酸的代谢，并可提高内质网上蛋白质的加工水平，促进抗氧化物质基因的表达，激活UVR8等与UV-B辐射相关的响应基因来促进马铃薯植株生长。

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