硫芥与活性硫醇化合物加合特性的分析研究

关键词硫芥；加合物；谷胱甘肽；半胱氨酸；N-乙酰半胱氨酸

硫芥是指一类具有高反应活性的糜烂性化学战剂，其中芥子气（HD）素有“毒剂之王”之称，属于经典的糜烂性化学战剂，多次在战争和恐怖袭击事件中使用[1-2]。HD 具有高反应活性、强糜烂性和多靶点共损伤等特性，可通过皮肤、眼睛和呼吸道等多种途径侵入人体[3-4]，诱发炎症、氧化应激、多器官中毒损伤及基因毒性等[5-6]。然而， HD 中毒机理至今尚未完全明确，但一般认为是由于其形成的高度亲电中间体环硫鎓离子可与人体内的DNA、N-乙酰半胱氨酸（N-Acetyl-cysteine， NAC）、半胱氨酸（Cysteine，Cys）和谷胱甘肽（Glutathione， GSH）等多种活性成分形成加合物所致[7]。

GSH、Cys 和NAC 等是体内具有较高反应活性的硫醇类解毒分子，也是防御外源性烷化剂损伤的重要屏障。此外， GSH 还是细胞中重要的抗氧化剂，能清除体内的自由基，具有抵御细胞毒性的作用。研究表明，经HD 的常用模拟剂2-氯乙基乙基硫醚（CEES）暴露后，在生物体内尤其是脑组织中检测到CEES-GSH、CEES-Cys 和CEES-NAC 等系列加合物，并且驻留时间可达14 d 以上，表明CEES 经皮肤暴露后会诱导神经损伤[8-9]。

化学武器公约（Chemical Weapons Convention， CWC）附表1.A.04[10]中涵盖了9 种糜烂性毒剂（统称为硫芥），除了经典的HD 外，还有8 种结构类似物（表1），其粗品不需要进一步纯化即可作为毒剂使用。研究表明，含有1～5 个亚甲基的硫芥可能具有更强的糜烂性，如1， 2-二（2-氯乙硫基）乙基（Q）和二（2-氯乙基乙基）醚（T）的糜烂性分别约为HD 的5.0 倍和3.5 倍[11]，大鼠口服Q 和T 半数致死剂量（Median lethaldose， LD50）后，采用定量构效关系（Quantitative structure-activity relationship， QSAR）模型计算得其糜烂性分别是HD 的21 和19 倍[12]；或是与HD 混合使用以增加杀伤力，如芥子气与乙基倍半芥子气混合物（HQ）、芥子气与乙基氧联芥子气混合物（HT）等混合型战剂比HD 的糜烂性更强[11]。除此之外， HD 在储存或暴露于自然环境中，会自发降解为HD 类似物。如一战和二战时期的HD 化学弹药被大量倾弃于海底或深埋于地下后，随着时间的推移， HD 在外界环境的作用下逐渐转化为Q 和T 等，对海洋环境、地下水、掩埋土壤和周边居民都构成了严重威胁[13]。然而，目前相关的研究主要针对HD，其类似物的毒性数据亟需填补和进一步完善。

本研究基于微量定向拼接合成策略，制备了8 种硫芥实体参考品，并采用超高效液相色谱-高分辨质谱联用（UPLC-MS/HRMS）和高效液相色谱-三重四极杆质谱联用（HPLC-MS/MS）方法有效地评价了系列硫芥与不同活性硫醇体外加合特性，发现不同硫芥与GSH 和Cys 的反应速率高于NAC，并且在不同基质中各类加合物的种类及丰度均存在显著差异。本研究结果为硫芥化合物的暴露诊断、毒理学分析以及医学救援等提供了重要依据。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

DionexUltiMate 3000 型液相色谱仪和QExactive 型质谱仪（美国Thermo Fisher 公司）；ACQUITY 型超高效液相色谱仪（美国Waters 公司）；Q-TRAP 5500 型三重四极杆-离子阱串联质谱仪（美国AB Sciex 公司）；Mili-Q A10 型超纯水净化系统（美国Millipore 公司）；RVC 2-33 离心浓缩仪（德国Christ 公司）；恒温振荡水浴（瑞士GingKo 公司）；3k30 高速冷冻离心机（美国Sigma-Aldrich 公司）；DL203 精密电子天平（瑞士Mettler 公司）。

HD（纯度gt;96%，中国人民解放军防化指挥工程学院提供）；GSH、Cys、NAC 和甲酸（分析纯，美国Acros Organics 公司）；甲醇和乙腈（色谱纯，美国Thermo Fisher Scientific 公司）；多聚甲醛、氯磺酸、2-巯基乙醇、1，2-二溴甲烷、1，2-二溴丁烷、1，2-二溴戊烷、二氯乙醚、二氯丙醚、3，6-二硫杂-1，8-辛二醇、3，7-二硫杂-1，9-壬二醇、磷酸盐缓冲液干粉（PBS）、HCl、NaOH 及其它试剂（分析纯，国药集团北京化学试剂公司）。人源血浆（中国人民解放军总医院第五医学中心提供，并经相关伦理道德委员会批准）；人源细胞系人永生化表皮细胞（HaCaT 细胞，由中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心提供）。

1.2 实验方法

1.2.1 系列硫芥实体制备与结构表征

参照文献[14]的方法，采用定向拼接策略制备表1 中除HD以外的8 种硫芥类似物。采用GC-MS、1H NMR 和13C NMR 对其结构和纯度进行表征鉴定，结果表明，制备的系列硫芥实体化合物的纯度gt;95%，可满足后续实验要求，相关的表征数据见电子版文后支持信息。

1.2.2 硫芥与不同活性硫醇形成加合物的鉴定

称取适量的GSH、Cys 或NAC 分别溶于PBS 溶液（0.01 mol/L， pH = 7.4）中，配制成2 mg/L 的溶液。分别取1 mL GSH（Cys 或NAC）溶液置于9 个1.5 mL 塑料离心试管中，加入20 μL 硫芥（50 mg/mL，溶剂为乙腈），混匀，调节溶液pH=8～9，在37 ℃条件下水浴孵育过夜。将孵育溶液稀释至合适浓度后，进行UPLC-MS/HRMS 检测。

1.2.3 血浆染毒实验

将浓度为1 mg/mL 的9 种硫芥（50 μL）分别加入到含150 μL 血浆的1.5 mL 离心管中，随后加入200 μL 乙腈-甲醇（4∶1， V/V）溶液，涡旋30 s，于4 ℃以14000 r/min 离心10 min，取上清液，于50 ℃离心浓缩至干，加入100 μL 5%（V/V）乙腈溶液复溶，静置10 min 后涡旋30 s， 以14000 r/min 离心5 min， 移取上清液进行检测，进样量为5 μL。

1.2.4 细胞染毒实验

取对数生长期的HaCaT 细胞，细胞计数后调整浓度至2.5×105 cell/mL，按每孔2 mL 铺6 孔板，于细胞培养箱（37 ℃， 5% CO2）中培养过夜，弃去培养基，向细胞中分别加入含100 mmoL/L HD（溶剂为二甲基亚砜）的完全培养基，继续培养4 h。采用PBS 溶液收集完成染毒的细胞， 14000 r/min 离心5 min， 弃上清液。取10 μL 收集到的细胞，加入20 μL PBS 溶液使细胞重悬，在液氮和37 ℃水浴中快速冻融2 次，于4℃以14000 r/min 离心5 min，收集上清液（细胞提取液）。将20 μL 乙腈-甲醇（3∶1， V/V）溶液与10 μL 细胞提取液涡旋混匀，以14000 r/min 离心5 min，沉淀蛋白。将上清液用PBS 溶液适当稀释，使最终体积为100 μL，待测，进样体积为10 μL。

1.3 实验条件

1.3.1 UPLC-MS/HRMS 条件

液相色谱条件 采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18 色谱柱（50 mm×2.1 mm， 1.7 μm）进行样品分离，柱温40 ℃，流动相A 为0.1%（V/V）甲酸溶液，流动相B 为甲醇溶液。梯度洗脱程序：0～1 min， 1% B;1～7 min， 1%～99% B；7～8.5 min， 99% B；8.5～10 min， 1% B。进样体积：2 μL。

质谱条件 采用电喷雾离子源（ESI），正离子模式，喷雾电压3.2 kV，离子传输温度320 ℃，雾化温度320 ℃，鞘气流速35 arb，辅助气流速10 arb，扫描模式为全扫描-自动触发二级质谱扫描（Full MS/dd-MS2），一级分辨率为35000 FWHM，二级质谱分辨率17500 FWHM，扫描范围为m/z 50～1000 Da，常态化碰撞能量（NCE）为20 和35 eV。

1.3.2 HPLC-MS/MS 条件

液相色谱条件 采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18 色谱柱（50 mm×2.1 mm， 1.7 μm）进行样品分离，柱温为40 ℃，流动相A 为0.1%（V/V）甲酸溶液，流动相B 为甲醇溶液。梯度洗脱程序：0～1 min，1% B；1～7 min， 1%～99% B；7～8.5 min， 99% B；8.5～10 min， 1% B。进样体积：5 μL 或10 μL，流速为0.25 mL/min。

质谱条件 质谱离子源温度：550 ℃；电离模式：ESI 正离子源；采集模式：多反应监测（Multiplereaction monitoring， MRM）；气帘气（Curtain gas， CUR）：20 psi（1 psi=6.895 kPa）；离子化电压（IonSprayvoltage， IS）：+5500 V；雾化气（Gas 1）：55 psi；辅助加热干燥气（Gas 2）：55 psi；碰撞室出口电压（Collision cell exit potential， CEX）：15 eV，入口电压（Entrance potential， EP）：10 eV；去簇电压（Declusteringpotential， DP）：70 V 或100 V；碰撞能量（Collision energy， CE）如电子版文后支持信息表S1 所示。

1.4 安全说明

9 种硫芥毒剂均为糜烂性的危险剧毒物品，相关操作均由受过培训的人员穿戴防护设备在通风良好的通风橱中进行。实验结束后，所有接触过硫芥的容器均采用10% KOH-乙醇溶液及时洗消。

2 结果与讨论

2.1 硫芥-硫醇加合物的质谱解析

采用UPLC-MS/HRMS 对3 种硫醇与9 种硫芥的加合物生成情况进行靶向筛查鉴定，结合反应机理推测，采用全扫描质谱筛选和特征母离子提取方式，共鉴定出24 种加合物，名称及结构式如表2 所示。HD、Q 和CEPR 等6 种硫芥均可在5 min 内与GSH、Cys 和NAC 分子中的硫醇发生亲电取代反应生成加合物，并且Cys 和GSH 比NAC 生成加合物的速率更快。CECM、CEME 和CEMEE 由于自身反应活性相对较差，孵育30 min 后才检测到生成的相关加合物。不同硫芥与3 种硫醇分子加合速率存在差异，其原因是CECM 属于不对称烷化剂，其烷基氯基团的亲电能力相对较弱[15]。此外，在弱碱性条件下， Cys 比GSH 和NAC 更易发生电离，因此可与硫鎓离子更快进行加合（pKa 分别为8.10、8.83、9.52）[16-19]。系列硫芥与GSH 形成加合物的质谱裂解规律解析（Difflt;5 ppm）见图1，不同加合物均易在碳硫键、碳氧键或肽键处发生断裂，图1 中相同色条展示出了共有的裂解位点。（1）硫芥与GSH 加合物都会形成高丰度的碎片离子m/z 177.0328，为GSH 丢失1 分子谷氨酸（Glu）所致。（2）加合物中羟乙基硫代烷基硫代乙基（—CH2CH2S（CH2）nSCH2CH2OH， n=1～5）由于相差—CH2—，二级质谱裂解碎片也呈现一定的规律性：①GSH 脱去1 分子Glu 或Cly，形成质量数相差14.0157 的低丰度特征碎片离子；②硫芥自身碳硫键断裂形成的特异性碎片，如HO—（CH2）2—S—（CH2）n—或HO—（CH2）2—S—（CH2）n—S—（n=1～5），其中，HD、Q、T 与GSH 加合物的基峰均为m/z 105.0374（HO—（CH2）2—S—（CH2）2—）。（3）随着硫芥碳链增长， 2 个碳硫键易同时断裂，如CEPE 的特征碎片离子—S—（CH2）3—S—（m/z 106.9984）。（4）CECM、CEME、CEMEE 与GSH 加合物基峰碎片与其它硫芥存在显著差异， CEME-GSH 和CEMEE-GSH 加合物中Glu 还会再丢失硫原子而形成基峰m/z 145.0608，而CEME-GSH 的基峰则为GSH 丢失Clu-NH2 所形成（m/z 162.0219）。

此外，不同硫芥与Cys 和NAC 的加合物也呈现出相似的裂解规律（如电子版文后支持信息图S1 和S2 所示），其中， Cys-硫芥加合物均产生碎片Cys（m/z 120.0120）， NAC-硫芥加合物共有的基峰为m/z 162.0225（NAC）。因此，在进行盲样分析时，可通过高丰度的共有碎片离子推断出其加合硫醇种类，再进一步结合硫芥部分碎裂的特征碎片离子精准鉴定具体硫芥化合物的种类。

2.2 染毒血浆中硫芥与硫醇加合物的鉴定

UPLC-HRMS/MS 具有精确度高和分辨率良好等优势，可用于硫芥与硫醇分子孵育溶液中所形成未知加合物的快速筛查与鉴定。针对复杂基质样品中低丰度加合物的检测，需要采用灵敏度更高且定量分析能力更强的HPLC-MS/MS。分别选择特异性好和质谱响应高的3对离子对（见电子版文后支持信息表S1），采用HPLC-MS/MS，建立MRM 检测方法。实验结果表明，血浆染毒样品孵育1 h 后，一次进样可同时完成6 种不同硫芥与3 种硫醇分子形成的加合物的筛查。图2为不同硫芥与硫醇分子加合物的色谱图，色谱出峰时间主要集中在2～6 min。提取离子色谱峰的峰面积表明，不同硫芥在血浆中与活性硫醇分子生成加合物的种类和丰度差异显著，其中，与Cys 形成的加合物的含量明显高于GSH 和NAC，这与前述的不同硫醇分子的反应活性以及血浆中3 种硫醇分子的丰度一致（Cysgt;GSHgt;NAC）[20]。此外，不同硫芥自身反应活性存在差异，导致检出的加合物的种类不同，如活性较高的Q、T与3种硫醇分子（GSH、Cys和NAC）均可生成加合物；HD、CEPR 和CEBU、CEPE仅可检测到GSH 和Cys 的加合物；活性较低的CEME 和CEMEE仅检测到CEME-Cys加合物；活性最差的CECM无加合物检出。

2.3 染毒细胞中硫芥-硫醇加合物的确证分析

为更准确地预测硫芥与生物体内硫醇分子之间的相互作用，探究潜在的毒理机制，考察了染毒细胞中不同硫芥与硫醇加合物的生成情况。皮肤是硫芥中毒的最主要的靶器官之一，硫芥暴露后会引起皮肤糜烂和坏死等病理变化。前期预实验结果表明， 100 μmol/L 的染毒剂量不会诱导大量的HaCaT 细胞死亡。基于建立的MRM 分析方法，对染毒细胞提取液进行筛查鉴定，结果如图3 所示，除CECM、CEME和CEMEE 外，其余5 种硫芥均可与细胞内的GSH 和Cys 形成加合物，并且与GSH 形成加合物的丰度显著高于Cys，这与血浆加合物的生成情况存在显著差异，其主要原因可能是由于细胞中GSH 含量（1～10 mmol/L）远高于Cys（3～5 μmol/L）[20]。其中， Q 与GSH 和Cys 生成加合物的含量最高，预示其可能具有更高的细胞毒性和反应活性。此趋势与文献[21-22]中Q 与HSA 的生物标志物鉴定工作中所提及的Q 比HD 更易与HSA 形成加合物的结果相符，其原因可能是Q 更易形成“双硫鎓”离子过渡态，对巯基具有更强亲和力。此外，没有检出9 种硫芥与NAC 形成的加合物，此结果与Roser 等[8]在细胞中未检测到HD 及其模拟剂CEES 与NAC 加合物的结果类似，其原因可能是NAC 与硫芥类毒剂的活性较Cys和GSH 差，并且与其在细胞中含量较低有关。

3 结论

优化了《化学武器公约》中的9 种硫芥的实体参考品微量定向合成方法，并采用UPLC-MS/HRMS 对不同硫芥与GSH、Cys 和NAC 的试管孵育反应液进行分析，共鉴定出24 种加合物。基于Pubmed、WebOf Science、Scopus 和Reaxys 等网络数据库，按主题、摘要和结构式对鉴定加合物进行查新检索（检索时间跨度为1999～2024 年）。结果表明，除HD 与GSH、Cys 和NAC 形成的3 种加合物已有文献报道外，其它硫芥与GSH、Cys 和NAC 形成的21 种加合物均为全新结构。进一步建立了基于HPLC-MS/MS 的MRM 分析方法，对染毒血浆样品中不同硫芥与几种活性硫醇的加合物进行确证分析，发现不同硫芥反应活性存在显著差异，其中， Q 和T 反应活性都显著强于HD，而CECM、CEME 和CEMEE 反应活性较弱；几种硫芥与NAC 形成加合物的丰度低于GSH 与Cys；而染毒细胞实验结果表明，不同硫芥与GSH的加合物含量要远高于Cys 和NAC，其原因是除胞内GSH 含量高于其余两种硫醇化合物外， Q、T 和其余几种长碳链的硫芥具有更强的细胞膜穿透能力。总之，通过研究不同硫芥与几种重要硫醇分子的加合特性，发现Q、T、CEBU 和CEPE 的反应活性高于HD，预示其可能具有更强的体内暴露毒性，相关的研究结果为揭示系列硫芥的毒效应及溯源确证等提供了重要依据。