基于β-二酮类铕(Ⅲ)配合物的单线态氧比率型荧光探针的合成及细胞成像应用

关键词铕（Ⅲ）配合物；比率荧光探针；单线态氧；荧光成像

单线态氧（1O2）是分子氧的最低电子激发态，通常由光敏化过程产生，作为生物系统中一种重要的活性氧，在生物体的生理和病理过程中发挥着至关重要的作用[1]。1O2 的氧化活性较高，易与生物体内的蛋白质、脂质和核酸等生物大分子反应，导致细胞坏死，甚至引发癌症和卟啉症等一系列疾病[1-4]。此外，1O2 是生物体免疫系统中的主要杀菌剂，可应用于癌症的光动力学疗法[5-6]。因此，开发一种灵敏、准确和特异性的活细胞内1O2 的检测方法尤为重要。

目前， 1O2 的检测方法主要包括电子自旋共振法[7]、化学发光法[8]、分光光度法[9]和荧光探针法[10-12]等。其中，荧光探针法具有选择性高、灵敏度高以及操作简单等优点，适用于活细胞或生物体的原位、实时及可视化荧光成像检测。近年来，已开发出多种以蒽基衍生物为识别单元、荧光素和BODIPY 等传统荧光染料[13-18]或稀土配合物[19-21]为荧光母体的1O2 荧光探针。这些探针对1O2 表现出良好的荧光响应，已被成功用于生物体中1O2 的荧光成像检测，但在应用过程中还存在一些问题，如探针以单个发射峰的强度变化作为定量依据时，易受到荧光团的光漂白、生物样品的背景荧光、仪器的不稳定以及局部探针浓度不均等因素的干扰，从而影响检测结果的准确度。

比率型荧光探针具有两个或多个发射峰，通过计算不同发射峰的荧光强度比值可实现目标物的检测，具有自校准效应，有效地提高了检测的准确度和可靠性[22-23]，因而备受关注。比率型荧光探针已被广泛用于识别次氯酸[24-26]、过氧亚硝酸盐[27-28]和一氧化氮[29-30]等生理活性物种，然而用于1O2 检测的比率型荧光探针的研究报道较少[31-32]，并且都是以有机荧光物质（如硫代香豆素和异苯并呋喃等）作为荧光团，目前尚无基于铕（Ⅲ）配合物的1O2 比率型荧光探针的报道。本研究利用β-二酮类铕（Ⅲ）配合物的强荧光特性及三元结构组成方式，将1O2 的识别基团二甲基蒽环及作为荧光参照物的5-羧基四甲基罗丹明（CTMR）引入到β-二酮类铕（Ⅲ）配合物中，合成了1O2 的比率型荧光探针[Eu（Hpfdap）3（CTMR-Phen-N）]。此探针具有选择性好、灵敏和可靠等优点，用于活细胞内1O2 的荧光成像检测，效果良好。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Vanio-EL型元素分析仪（德国Elementar公司）；HP1100LC/MSD型质谱仪（美国Agilen科技有限公司）；Bruker Avance Ⅱ 400 型核磁共振仪（瑞士Bruker 仪器公司）；F-7000 型荧光分光光度计（日本Hitachi公司）；L-35 型紫外-可见分光光度计（美国Perkin Elmer 仪器公司）；真彩荧光显微镜[33]。

9-蒽醛（国药集团化学试剂有限公司）；CTMR（上海迈瑞尔化学试剂有限公司）；5-氨基酮戊酸（ALA，上海张江生物医药有限公司）；1，10-菲咯啉、S-亚硝基-N-乙酰青霉胺（≥ 97%）、6%次氯酸钠溶液和硫酸亚铁铵（阿拉丁试剂公司）；30%过氧化氢溶液（科密欧化学试剂有限公司）。中间体1 和配位体Phen-N 分别按照文献[34]和[35]的方法合成。所用实验试剂及溶剂均为分析纯；实验用水为二次蒸馏水。

1.2 探针[Eu（Hpfdap）3（CTMR-Phen-N）]的合成

配位体的合成路线如图1 所示。

1.2.1 中间体3 的合成

将9-甲基蒽（2.77 g， 14.00 mmol）、N-甲基苯基甲酰胺（3.89 g， 29.00 mmol）和三氯氧磷（3.89 g，25.00 mmol）混合，在110 ℃下加热并持续搅拌1 h。随后将混合物冷却至约60 ℃，并加入70 mL 醋酸钠溶液（1.37 mol/L）。在70 ℃下继续搅拌2 h 后进行过滤，收集沉淀物并干燥，得到中间体2。将中间体2用一缩二乙二醇（29 mL）溶解，并加入水合肼（2.70 g， 54.00 mmol）。将此混合物在115 ℃下回流0.5 h，然后加入KOH 溶液，并继续回流0.5 h。之后，将温度升至170 ℃并保持2 h。待反应完成后，将反应液冷却并倒入230 mL 的水中。通过抽滤和干燥得到粗产物。最后，使用柱色谱法对粗产物进行纯化（洗脱剂为二氯甲烷和石油醚的混合液， 1∶20， V/V），得到1.80 g 的黄色固体目标物，产率为60.6%。1H NMR（400 MHz， CDCl3-d6），δ（ppm）：3.14（s， 6H）， 7.54（dt， J = 10.0， 20.0 Hz， 4H）， 8.36（dt， J = 9.8， 19.6 Hz，4H）。ESI-MS， m/z：calcd. for C16H14， 206.1；found， 206.1。

1.2.2 中间体4 的合成

在冰水浴条件下，首先将无水氯化铝（1.73 g， 13.00 mmol）迅速加入到干燥的二氯甲烷（20 mL）中。在氩气保护下，将两个分别含有乙酰氯（0.82 g， 10.00 mmol）和中间体3（1.80 g， 8.74 mmol）的20 mL 二氯甲烷溶液逐一缓慢滴加到上述氯化铝的二氯甲烷溶液中。持续搅拌0.5 h 后，将反应体系转移到室温下继续反应5 h。之后，将反应体系加热至60 至70 ℃并回流1 h 以完成反应。将反应液小心地倒入酸性冰水溶液中，通过减压蒸馏去除二氯甲烷，通过抽滤收集固体并进行干燥。最后，使用柱色谱法对粗产物进行纯化（洗脱剂为二氯甲烷和石油醚的混合液， 1∶2， V/V），最终得到1.36 克的黄色固体目标物，产率为63.0%。1H NMR（400 MHz， CDCl3-d6），δ（ppm）：2.80（s， 3H）， 3.10（s， 3H）， 3.18（s， 3H）， 7.54～7.62（m， 2H），8.01（dd， J = 1.7， 9.3 Hz， 1H）， 8.31-8.39（m， 3H）， 9.02（d， J=1.4 Hz， 1H）。ESI-MS， m/z：calcd. forC18H17O [M+H]+， 249.13；found， 248.90。

1.2.3 配位体Hpfdap 的合成

将中间体4（1.36 g， 5.48 mmol）、五氟丙酸乙酯（1.31 g， 6.82 mmol）和甲醇钠（0.56 g， 10.37 mmol）用无水乙醚（15 mL）溶解。随后，在室温下搅拌48 h， 以确保反应进行完全，再将100 mL 10%的硫酸溶液加入到反应体系中，并继续搅拌10 min。使用乙醚对反应混合物进行萃取，分离出有机相。随后，通过减压蒸馏的方式去除乙醚，得到固体沉淀物。对沉淀物进行干燥，使用乙醇对粗产物进行重结晶，最终得到1.50 g 的红色固体目标物，产率为69.8%。1H NMR（400 MHz， CDCl3-d6），δ（ppm）：3.10（s， 3H），3.19（s， 3H）， 6.82（s， 1H）， 7.55～7.65（m， 2H）， 7.84（d， J=9.3 Hz， 1H）， 8.31-8.41（m， 3H）， 9.10（s， 1H），15.49（s， 1H）。ESI-MS， m/z：calcd. for C21H14F5O2 [M–H]–， 393.09；found， 393.22。

1.2.4 配位体CTMR-Phen-N的合成

在氮气保护下，用超干N，N-二甲基甲酰胺（10 mL）溶解超干N，N-二异丙基乙胺（47 μL， 0.27 mmol），再将CTMR （57.40 mg， 0.13 mmol）和o-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯（63.00 mg， 0.17 mmol）加入混合液中，室温搅拌10 min。随后，在室温避光下将Phen-N（122.0 mg， 0.62 mmol）加入其中，继续搅拌4 h 使反应进行完全。最后，将反应液倒入由水（100 mL）和饱和NaCl 溶液（40 mL）组成的混合液中，用二氯甲烷对反应混合物进行3 次萃取，分离出有机提取液，经无水Na2SO4 干燥后再进行过滤。减压蒸馏去除滤液中溶剂后，最终得到57.0 mg的紫色固体目标物，产率为70.0%。ESI-MS， m/z：calcd. for C37H30N5O4 [M+H]+，608.23；found， 608.34。

1.2.5 铕（Ⅲ）配合物[Eu（Hpfdap）3（Phen-N）]的合成

用乙醇溶液（10 mL）溶解Hpfdap（0.35 g， 0.90 mmol）、Phen-N（0.06 g， 0.30 mmol）和EuCl3·6H2O（0.11 g， 0.30 mmol），然后将1.0 mol/L 的氢氧化钠溶液滴入其中，调节混合溶液的pH=6.5～7.0。随后，将反应液在90 ℃下回流2 h。反应结束后离心收集沉淀，用体积比为1∶9 的乙醇-水混合溶液洗涤，再用乙醇对干燥后的粗产物进行重结晶，最终得到0.21 g 的黄色固体目标物，产率为45.7%。ESI-MS， m/z：calcd. for C75H51EuF15N3NaO6 [M+Na]+， 1550.26；found， 1549.88。元素分析（%）：calcd. for C75H51EuF15N3O6， C 58.99， H 3.37， N 2.75；found， C 58.52， H 3.38， N 2.69。

1.2.6 探针[Eu（Hpfdap）3（CTMR-Phen-N）]的合成

用乙醇溶液（10 mL）溶解Hpfdap（0.35 g， 0.90 mmol）、CTMR-Phen-N（0.18 g， 0.30 mmol）和EuCl3·6H2O（0.11 g， 0.30 mmol）， 将1.0 mol/L NaOH 溶液滴入其中，调节混合溶液的pH=6.5～7.0。随后，将反应液在90 ℃下回流2 h。反应结束后离心收集沉淀，用体积比为1∶9 的乙醇-水混合液洗涤，再用乙醇对干燥后的粗产物进行重结晶，最终得到0.27 g 的红色固体目标物，产率为43.6%。ESI-MS， m/z：calcd. for C63H42EuF15NaO6 [M-（CTMR-Phen-N）+Na]+， 1355.18；found， 1355.59。元素分析（%）：calcd. for C100H71EuF15N5O10， C 61.92， H 3.69， N 3.61；found， C 61.53， H 3.69， N 3.59。

1.3 活性氧/氮物种的制备

参照文献[36]的方法，通过钼酸钠与过氧化氢反应制备1O2；ClO–通过稀释6%次氯酸钠溶液获得；NO 来自于供体S-亚硝基-N-乙酰青霉胺；过氧亚硝酸阴离子（ONOO–）来自于供体SIN-1；NO2–来自于亚硝酸钠；羟基自由基（·OH）通过硫酸亚铁铵与过氧化氢的反应获得[37]。

1.4 光谱测量

精密称量探针[Eu（Hpfdap）3（CTMR-Phen-N）]，用丙酮溶解，配制浓度为1 mol/L 的探针储备液，备用。用蒸馏水溶解各种活性氧/氮物种，得到浓度为1 mol/L 的活性物种储备液，备用。向含有Na2MoO4（0.15 mmol）和0.25%氢化蓖麻油的0.1 mol/L 碳酸缓冲溶液（pH=10.5）中加入90 μL 探针储备液，避光条件下振荡反应5 min， 再将适量H2O2 溶液加入其中，将反应液定容至3 mL， 避光条件下振荡反应4 h。用0.05 mol/L硼酸缓冲溶液（pH=7.2）对反应液进行3倍稀释后，测定吸收光谱和荧光光谱。测量荧光光谱时，激发波长为330 nm，而激发和发射狭缝宽度均为5 nm。在所有的光谱测量中，探针浓度均为10 μmol/L。在选择性实验中，各活性物种的浓度均为12.2 mmol/L，探针与活性物种的反应时间为30 min。

1.5 细胞荧光成像

在进行细胞实验前，将Hela 细胞置于含10%胎牛血素、1%青霉素和1%链霉素的RPMI-1640培养基中，在37 ℃、含5% CO2 的培养箱中培养24 h。将探针溶液加入至含0.25%氢化蓖麻油的二甲亚砜溶液中，再用等渗盐溶液（含140 mmol/L NaCl、3.5 mmol/L KCl 和10 mmol/L 葡萄糖）稀释至80 μmol/L，用于细胞成像实验。

向Hela 细胞中加入1 mL 含80 μmol/L ALA 的等渗盐溶液，在37 ℃、含5% CO2 的培养箱中培养0.5 h 后，用等渗盐溶液清洗数次，然后加入含80 μmol/L 探针[Eu（Hpfdap）3（CTMR-Phen-N）]的等渗盐溶液，在培养箱中继续培养1 h， 用汞灯激发20 min， 然后用于荧光成像检测。作为对照，采用同样的方法将Hela 细胞分别与含80 μmol/L ALA 的等渗盐溶液、含80 μmol/L 探针的等渗盐溶液以及依次含80 μmol/L ALA、200 μmol/L 叠氮化钠和80 μmol/L 探针的等渗盐溶液进行孵育，用于荧光成像检测。此外，按照上述方法，将细胞分别与80 μmol/L ALA 和80 μmol/L 探针孵育后，考察汞灯的激发时间对细胞内1O2 荧光成像的影响。

2 结果与讨论

2.1 探针[Eu（Hpfdap）3（CTMR-Phen-N）]的设计原理

利用β-二酮类铕（Ⅲ）配合物的三元结构组成方式，将1O2 的识别基团蒽环引入到β-二酮配位体的结构中，设计出识别配位体Hpfdap，利用氨基与羧基之间的键合反应将作为荧光参照物的CTMR结合到氨基菲咯啉（Phen-N）上，作为辅助配位体CTMR-Phen-N，将两种配位体与铕（Ⅲ）离子进行配位，构建基于铕（Ⅲ）配合物-罗丹明双荧光团的比率型荧光探针[Eu（Hpfdap）3（CTMR-Phen-N）]用于1O2 检测。利用蒽环识别1O2 的铕（Ⅲ）配合物荧光探针的研究结果[38-40]表明，与1O2 反应前，由蒽环导致的三线态-三线态相互作用使铕（Ⅲ）配合物的荧光强度很弱；与1O2 反应后，蒽环被氧化为内氧化物，铕（Ⅲ）配合物的红色荧光得以恢复。与1O2 反应前后，探针结构中的罗丹明部分不变，推测其荧光强度也不会发生明显变化，可用于荧光检测的内部校准。根据文献[38-39]推测的探针与1O2 的反应原理如图2 所示。

2.2 探针对1O2 响应前后的发光性质

采用紫外-可见吸收光谱考察了探针[Eu（Hpfdap）3（CTMR-Phen-N）]和未修饰CTMR 的铕（Ⅲ）配合物[Eu（Hpfdap）3（Phen-N）]与¹O2 反应前后的光谱特性。如图3A 所示，未与¹O2 反应时，两种配合物在336 nm 和429 nm 处均显示出明显的吸收峰，这两个吸收峰归属于Hpfdap 结构中蒽环的特征吸收。与未键合CTMR 的铕（Ⅲ）配合物[Eu（Hpfdap）3（Phen-N）]相比，探针在550 nm 处新增一个CTMR 的吸收峰，表明配位体Phen-N 上成功修饰了CTMR。如图3B 所示，当探针与¹O2 反应后，在336 nm 和429 nm 处的吸收峰消失，这说明Hpfdap 结构中的蒽环部分被¹O2 氧化形成了内氧化物；而位于550 nm 处CTMR 的吸收峰在反应后基本保持不变，这表明CTMR 并未与¹O2 发生反应。基于这一特性，该探针可以对¹O2 进行比率测定。

进一步考察了探针和未修饰CTMR 的铕（Ⅲ）配合物与1O2 反应前后的荧光光谱。如图4A 和4B 所示，与1O2 反应后，探针和未修饰CTMR 的铕（Ⅲ）配合物均在330 nm 和614 nm 处显示出铕（Ⅲ）离子特征的最大激发和发射峰；与铕配合物[Eu（Hpfdap）3（Phen-N）]相比，探针在550 nm 和575 nm 处分别增加了一个CTMR 的激发和发射峰，表明罗丹明已成功键合到探针结构中。探针与1O2 反应前后的荧光光谱如图4C 所示，与1O2 反应后，探针的铕（Ⅲ）离子特征发射峰强度显著升高，量子产率也由1.60%提高至25.16%（电子版文后支持信息表S1），而位于575 nm 处的CTMR 发射峰强度却基本保持不变，这说明探针中的蒽环部分已被完全氧化为内氧化物结构，导致配位体与铕（Ⅲ）离子的“天线效应”得以恢复，同时也说明该探针可用作检测1O2 的比率型荧光探针。

2.3 pH 值对探针荧光性能的影响

考察了pH 值对探针与1O2 反应前后荧光强度比值（F614/F575）的影响。如图5 所示，当缓冲溶液的pH=3～10 时，探针本身的F614/F575 很小且基本保持不变；与1O2 反应后，探针的F614/F575 在pH=7.2 时达最大值，并随溶液酸度和碱度的增强而呈逐渐下降的趋势。因此，该探针适用于弱酸性至弱碱性体系中1O2的比率荧光检测。

2.4 探针对1O2 的选择性及动力学实验

为了考察探针[Eu（Hpfdap）3（CTMR-Phen-N）]检测1O2 的选择性，对常见的活性氧/氮物种与探针反应前后的荧光强度变化进行了测试，各活性物种的剂量为1O2 剂量的5 倍。如图6 所示，与探针溶液本身的本底荧光相比，加入1O2 后， F614/F575 显著增强，而ClO–、H2O2、ONOO–、NO2–、NO 和·OH 几乎不影响。此结果表明，探针对1O2 的响应具有较高的选择性，不受其它常见活性物种的干扰。

以辣根过氧化物酶（HRP）-吲哚乙酸（IAA）反应体系[41]作为单线态氧源，考察了探针在含有0.25%氢化蓖麻油的0.05 mol/L 醋酸缓冲溶液（pH=4.0）中与1O2 反应的动力学过程。如图7 所示，向含一定浓度的探针（10 μmol/L）和HRP（0.5 μmol/L）溶液中加入不同量的IAA，反应一段时间后， F614/F575 逐渐上升，并在20 min 时达到平台，表明此探针能快速捕获1O2 并产生荧光响应。

2.5 探针对1O2的荧光测定

考察了探针与不同浓度1O2 反应前后荧光光谱的变化。如图8A 所示，随着H2O2 浓度的增大，在614 nm 处探针中铕（Ⅲ）离子的荧光强度逐渐升高，最高约达16 倍，而在575 nm 处探针中CTMR 的荧光强度未发生明显变化。以F614/F575 对1O2 浓度作图（图8B）， 1O2 浓度在0.11～2.44 mmol/L 范围内呈现良好的线性关系，线性方程为y = 1.087x + 0.205（R2 = 0.995），检出限（S/N = 3）为3 μmol/L， 测定结果与已报道的β-二酮类铕（Ⅲ）配合物荧光探针测定1O2 的结果[40]相当，表明探针具有较高的灵敏度，可用于1O2 的定量测定。

2.6 细胞内1O2的荧光成像检测

采用MTT 法[42]对探针的细胞毒性进行了考察（电子版文后支持信息图S15），结果表明，探针具有较低的细胞毒性。为了探究探针用于活细胞内1O2 荧光成像的可行性，将细胞与光敏化剂及探针孵育，再用汞灯激发产生1O2，进行荧光成像，如图9 所示。当细胞只与探针孵育时，细胞内发出绿色荧光信号（图9E），这是罗丹明的粉色荧光与细胞的本底蓝色荧光相互叠加的结果；当细胞只与光敏化剂ALA 孵育时，细胞呈现出微弱的绿色荧光信号（图9F）；当细胞先后与ALA 及探针共同孵育时，细胞中显示出很强的黄绿色荧光信号（图9G），这是图9E 中的绿色荧光与探针和1O2 反应后产生的铕（Ⅲ）离子的红色荧光相互叠加的结果；当继续向与ALA 和探针孵育的细胞中加入叠氮化钠（1O2 的猝灭剂）时，细胞又恢复为与图9E 相同的绿色荧光（图9H）。上述结果说明探针可穿过细胞膜进入细胞中，与光敏化剂经照射后产生的1O2 在细胞内发生反应。在此基础上，进一步考察了不同光照时间下细胞内1O2 的荧光成像情况。如图10 所示，随着光照时间延长，细胞内1O2 的生成量逐渐增加，红色荧光信号逐渐增强，而叠加的绿色荧光信号基本不变，说明此探针可用于细胞内1O2 的比率荧光成像。

3 结论

以含蒽环的β-二酮化合物为识别配位体、键合了罗丹明的菲咯啉为辅助配位体，设计并合成了1O2比率型荧光探针[Eu（Hpfdap）3（CTMR-Phen-N）]，通过1H NMR、MS 和元素分析方法确定了探针的结构。吸收光谱及荧光光谱研究结果表明，此探针对1O2 显示出增强型比率荧光识别性质，具有选择性好、准确度高、响应速度快以及检出限低等优点。将此探针成功应用于细胞内1O2 的荧光成像。未来有望应用于生物医疗及癌症的光动力学治疗领域。