基于Python的手印荧光显现质量的量化评估

关键词潜在手印；手印显现；荧光；对比度；灵敏度；选择性

手印显现是指通过物理和化学等方法使手印与客体之间形成肉眼可见或仪器可辨的对比反差，进而将潜在手印转变为可见手印的过程[1-3]。迄今为止，手印显现领域研究主要集中于手印显现质量的提升[4-6]，而对手印显现质量的评估研究鲜有涉及。然而，对手印显现质量进行准确和全面地评价有助于显现方法的合理选择和证据价值的客观评估，因此，构建手印显现质量定量评估体系具有重要的理论意义和广阔的应用前景。近年来，手印显现质量的评估问题已经逐渐引起研究人员的重视。2017 年， Wang 等[7]针对手印显现中信号与噪声反差程度、各级特征的清晰程度以及试剂特异性结合程度对应提出了对比度、灵敏度和选择性等指标，作为手印显现质量的评估指标。2021 年，李明等[8]从对比度、灵敏度、选择性和毒害性等方面对手印显现质量的评估研究进行了详细介绍。

2008 年， Humphreys 等[9]首次提出了相对对比指数的评估指标，将其定义为乳突纹线与客体的反射光谱峰值之比的对数值，并利用该指标定量评估捺印手印及显现手印的质量。2011 年， Vanderwee 等[10]优化了上述质量评估体系，并验证了该体系的可靠性和重现性。2013 年， Matuszewski 等[11]提出了对比度的评估指标，将其定义为乳突纹线与小犁沟的像素平均灰度值差异。以上文献报道为定量评估手印显现的早期研究，采用的方法不具备普适性，仅适用于白色客体表面的深色手印或黑色客体表面的浅色手印。2019 年，沈敦璞等[12]建立了基于灰度分析的非荧光手印显现对比度评估体系，并于2020 年建立了基于光谱分析的荧光手印显现对比度评估体系[13]。这两项研究解决了非荧光和荧光方法显现手印的对比度定量评估问题，方法具有普适性，但前者的计算结果误差较大，后者极其依赖表征设备。目前，手印显现对比度的评估研究大多停留在定性评价层面，即使深入到定量计算层面，也存在缺陷。2012年， Li等[14]首次考察了聚集诱导发光材料显现手印的总体特征及细节特征，但该研究未涉及汗孔特征。2015 年，Wang 等[15]考察了稀土发光纳米材料显现手印的总体特征、细节特征及汗孔特征，但仅达到定性评价层面。因此，手印显现灵敏度的评估研究基本停留在定性评价层面，尚未深入到定量计算层面。2014 年，He 等[16]首次考察了纳米金显现手印的选择性，利用乳突纹线与小犁沟所对应灰度曲线的峰谷高低衡量两者之间的差异，但仅限于定性评价层面。2019 年，于海峰等[17]提出了利用乳突纹线与小犁沟所对应灰度曲线的积分面积的比值计算手印显现选择性的方法。同年，智晓晨等[18]提出了利用乳突纹线与小犁沟所对应灰度曲线的峰谷强度之差计算手印显现选择性的方法。以上研究解决了显现手印的选择性定量计算问题，但是所得数值只能反映手印中有限区域的选择性，缺乏代表性和准确性。因此，手印显现选择性的评估研究大多停留在定性评价层面，即使深入到定量计算层面，也存在缺陷。综上所述，手印显现质量的量化评估方法在不同程度上存在以下亟需解决的问题：（1）定性评价方法相对较多、定量计算方法有限；（2）评价指标分散单一、全面多维评价欠缺；（3）评价方法难以统一、评价结果可靠性低。因此，建立一种简单易行、准确可靠、客观全面以及普适性强的手印显现质量的定量评估体系至关重要。

作为一种新兴的完全面向对象的编程语言， Python 集成了能够满足多种需求的第三方库（如OpenCV和PIL），可以有效实现图像的灰度转换、二值化和图像增强等，因此在图像处理领域广泛应用[19]。本研究提出了手印荧光显现对比度、灵敏度和选择性的定量计算公式，建立了一种基于Python 的手印荧光显现质量评估体系，从对比度、灵敏度和选择性3 个角度评估了手印荧光显现的质量，验证了此评估体系的可行性和可靠性，讨论了显现试剂的性质对手印显现质量的影响，提出了提高手印显现质量的有效策略。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Cary Eclipse 荧光分光光度计（FS，美国Agilent 公司）；H-7650 透射电子显微镜（TEM，日本Hitachi公司）；JSM-IT200 扫描电子显微镜（SEM，日本JEOL 公司）；TENSOR 27 傅里叶变换红外光谱仪（FT-IR，德国Bruker 公司）。

Y（NO3）3·6H2O、La（NO3）3·6H2O、Ce（NO3）3·6H2O、Yb（NO3）3·5H2O、Eu（NO3）3·6H2O、Tb（NO3）3·6H2O和Er（NO3）3·6H2O，纯度为99.99%；Na3VO4·12H2O、Na3PO4·12H2O、NaF、对苯二甲酸（p-PTA）、邻菲咯啉（o-Phen）、聚乙烯亚胺50%水溶液（PEI， MW 10000）、乙二醇、二乙三胺五乙酸（DTPA）、硬脂酸（SA）、油酸（OA）、NaOH、无水乙醇、95%乙醇、N，N-二甲基甲酰胺（DMF），纯度均为分析纯。以上试剂均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 显现材料的合成

YVO4∶Eu 纳米发光材料的合成参照文献[15]的方法合成Y0.85VO4∶Eu0.15 纳米发光材料。将3.26 gY（NO3）3·6H2O 和0.67 g Eu（NO3）3·6H2O 溶解于200 mL 水中，加入5 mL PEI 溶液，配制溶液A；将4.00 gNa3VO4·12H2O 溶解于200 mL 水中，配制溶液B。电动搅拌下，将溶液B 缓慢滴入溶液A 中，调节体系pH=8.0。将混合物在不同加热条件下反应2 h，离心分离、洗涤，于50 ℃真空干燥，即得到YVO4∶Eu 纳米粉末。若将加热条件设定为90 ℃水浴反应，可得到发光较弱的纳米材料；若将加热条件设定为180 ℃水热反应，可得到发光较强的纳米材料。

LaPO4∶Ce，Tb 纳米发光材料的合成参照文献[15]的方法合成La0.60PO4∶Ce0.25，Tb0.15 纳米发光材料。将2.60 g La（NO3）3·6H2O、1.09 g Ce（NO3）3·6H2O 和0.68 g Tb（NO3）3·6H2O 溶解于水或水-乙二醇混合溶剂中，配制溶液A；将3.80 g Na3PO4·12H2O 溶解于100 mL 水中，配制溶液B。电动搅拌下，将溶液B 缓慢滴入溶液A 中，调节体系pH=8.0。将混合物在180 ℃条件下水热反应2 h，离心分离、洗涤，于50 ℃真空干燥，得到LaPO4∶Ce，Tb 纳米粉末。若溶液A 中使用的溶剂为300 mL 水，可得到表面无有机分子修饰的纳米材料；若溶液A 中使用的溶剂为100 mL 水与200 mL 乙二醇的混合物，可得到表面有乙二醇分子修饰的纳米材料。

NaYF4∶Yb，Er 上转换发光微/纳米材料的合成参照文献[20]的方法合成NaY0.78F4∶Yb0.20， Er0.02 微米发光材料。将2.99 g Y（NO3）3·6H2O、0.90 g Yb（NO3）3·5H2O 和0.09 g Er（NO3）3·6H2O 溶于100 mL 水中，加入3.93 g DTPA，配制溶液A；将1.68 g NaF 溶解于100 mL 水中，配制溶液B。电动搅拌下，将溶液B缓慢滴入溶液A 中，调节体系pH=6.0，常温反应1 h。将产物离心分离、洗涤，于50 ℃真空干燥形成粉末，在500 ℃、Ar 气氛中煅烧5 h， 得到NaYF4∶Yb，Er 微米粉末。

NaYF4∶Yb，Er 纳米材料的合成参照文献[21]的方法合成NaY0.78F4∶Yb0.20，Er0.02 纳米发光材料。将2.99 g Y（NO3）3·6H2O、0.90 g Yb（NO3）3·5H2O、0.09 g Er（NO3）3·6H2O、8.53 g SA 与100 mL 95%乙醇混合，升温至75 ℃使其溶解，配制溶液A；将1.20 g NaOH 溶解于20 mL 水中，配制溶液B。电动搅拌下，将溶液B 缓慢滴入溶液A 中，调节体系pH=7.0， 75 ℃恒温反应40 min。将产物抽滤、洗涤，在50 ℃真空干燥，得到稀土硬脂酸盐前驱体。将此前驱体与1.68 g NaF、50 mL OA、100 mL 水和150 mL 无水乙醇混合均匀后， 180 ℃水热反应24 h。产物离心分离、洗涤，于50 ℃真空干燥，得到NaYF4∶Yb，Er 纳米粉末。

Eu（p-PTA）3（o-Phen）纳米材料的合成参照文献[22]的方法合成Eu（p-PTA）3（o-Phen）纳米配合物。配制浓度均为0.25 mol/L 的Eu（NO3）3 乙醇溶液、p-PTA DMF 溶液及o-Phen 乙醇溶液。将60 mLp-PTA 溶液与20 mL o-Phen 溶液混合，升温至50 ℃，调节体系pH=7.0，配制溶液A。电动搅拌下，将20 mL Eu（NO3）3 溶液缓慢滴入溶液A 中， 50 ℃下反应5 h。将产物离心分离、洗涤，于50 ℃真空干燥，得到Eu（p-PTA）3（o-Phen）纳米粉末。

1.2.2 手印纳米显现

采用经典的粉末法显现手印。使用下转换及上转换发光材料显现后的手印，分别搭配254 nm 紫外光源及980 nm 红外光源对手印进行荧光增强，并置于暗场下拍照。拍摄参数为：光圈值f/4、曝光时间1.6 s、感光度200。

1.2.3 手印显现质量的定量评估

手印显现图像的处理过程如图1 所示。步骤Ⅰ：通过灰度处理（Grayscale processing）将彩色图像转化为灰度图像。步骤Ⅱ～Ⅶ从两个层面将灰度图像进一步处理。一方面是乳突纹线、小犁沟、客体背景的识别与提取。步骤Ⅱ：通过图像分割（Image segmentation）处理将灰度图像转化为图像切片；步骤Ⅲ：通过灰度方差图像分割（Grayscale variance segmentation）算法将所得图像识别为手印（Fingerprint，FP）区域和背景（Background， B）区域；步骤Ⅳ：通过最大类间方差（OTSU）算法将所得图像二值化处理并识别为乳突纹线（Ridge， R）和小犁沟（Furrow， F）区域；最终，分别计算出B、R 和F 区域的灰度均值。另一方面为乳突纹线细节特征点的识别与提取。步骤Ⅴ：通过图像增强（Image enhancement）处理将灰度图像的纹线结构清晰化；步骤Ⅵ：通过骨架化（Skeletonization）算法将乳突纹线细化；步骤Ⅶ：通过细节特征点识别（Minutiae recognition）算法将所得图像识别为交点（Bifurcation）和端点（Termination）；最终，以特征点为中心建立切片，并利用步骤Ⅳ方法计算各细节特征点切片中R、F 区域的灰度均值。

手印显现对比度（Contrast）的计算公式如式（1）所示：

其中， GR 表示乳突纹线的灰度均值；GB 表示客体背景的灰度均值；GRi 和GBj 分别表示乳突纹线和客体背景区域内单个像素点的灰度值；x 和y 分别表示乳突纹线和客体背景区域所包含像素点的总数。

手印显现灵敏度（Sensitivity）的计算公式如式（2）所示：

其中， GRl 和GFl 分别表示每个被识别细节特征点切片中乳突纹线和小犁沟的灰度均值；n 表示被识别细节特征点切片的总数；GRli 和GFlk 分别表示每个切片中乳突纹线和小犁沟区域内单个像素点的灰度值；x 和z 分别表示每个切片中乳突纹线、小犁沟区域所包含像素点的总数。

手印显现选择性（Selectivity）的计算公式如式（3）所示：

其中， GR、GB 和GF 分别表示乳突纹线、背景和小犁沟的灰度均值；GF *表示修正后小犁沟的灰度均值；GRi、GBj 和GFk 分别表示乳突纹线、背景和小犁沟区域内单个像素点的灰度值；x、y 和z 分别表示乳突纹线、背景和小犁沟区域所包含像素点的总数。

2 结果与讨论

2.1 手印显现对比度的量化评估

2.1.1 对比度的量化原理

手印显现对比度是指显现手印信号与客体背景噪声之间的对比反差程度[7]。手印显现对比度的定义参考了分析化学领域的信噪比，将显现手印和客体背景分别归为分析信号和干扰噪声。其中，分析信号来源于乳突纹线（R）部位所产生的荧光，干扰噪声来源于客体背景（B）部位所产生的荧光。因此，可利用分析信号与干扰噪声之间的灰度均值之比（GR/GB）定量评估手印显现对比度。

2.1.2 对比度的影响因素

选用较弱发光的YVO4∶Eu 纳米材料[YVO（W）]和较强发光的YVO4∶Eu 纳米材料[YVO（S）]分别显现大理石表面的潜在手印，研究材料的发光强度对显现对比度的影响。由图2A 和图2B 可见，在254 nm紫外光激发下， YVO（W）与YVO（S）在618.0 nm 处均产生了最强荧光发射峰，对应于Eu3+的5D0→7F2 能级跃迁[15]，并且前者的强度较低（404.5，图2A），后者的强度较高（692.2，图2B）。从视觉效果的角度定性判断，如图2A′和图2B′所示， YVO（S）具有较高的发光强度，使其显现的乳突纹线与客体背景之间的视觉反差更明显。Python 计算结果如表1 所示，两次显现的背景噪声强度未产生显著差异，而使用YVO（S）显现手印的显现信号强度更高，使对应的对比度数值更大。综上所述，提高材料的发光强度有利于增强手印显现的对比度。

选用红色发光的YVO4∶Eu 纳米材料[YVO（R）]和绿色发光的LaPO4∶Ce， Tb 纳米材料[LPO（G）]分别显现红便笺纸表面的潜在手印，研究材料的发光颜色对显现对比度的影响。由图3A 和图3B 可见，在254 nm 紫外光激发下，背景在（0.48， 0.33）处产生了红色荧光， YVO（R）、LPO（G）分别在（0.63， 0.37）和（0.29， 0.61）处产生了红光和绿光，并且YVO（R）的发光颜色与背景荧光颜色相似（图3A）， LPO（G）的发光颜色与背景荧光颜色相异（图3B）。从视觉效果的角度定性判断，如图3A′和图3B′所示， LPO（G）具有绿色发光性能，其产生的绿色显现信号与红色背景噪声之间的视觉反差更明显。Python 计算结果见表2，两次显现的背景噪声强度未产生显著差异，而使用LPO（G）显现手印的显现信号强度更高，使对应的对比度数值更大。综上所述，调谐材料的发光颜色有利于增强手印显现的对比度。另外，相比调谐材料的发光颜色，提高材料的发光强度对显现对比度的增强效果更明显，这与文献[23]的结果一致。

2.2 手印显现灵敏度的量化评估

2.2.1 灵敏度的量化原理

手印显现灵敏度是指显现手印中细节特征的清晰程度和总体数量[7]。手印显现灵敏度的定义中包含两方面信息：（1）细节特征的质量，细节特征切片中乳突纹线与小犁沟之间的灰度均值的比值（GRl/GFl）越大，体现出细节特征的清晰程度越高；（2）细节特征的数量，将切片中GRl/GFl 进行累加，该累加值越大，则体现出细节特征的总体数量越多。因此，可利用细节特征点切片中乳突纹线与小犁沟之间的灰度均值的比值的累加值[Σ（GRl/GFl）]定量评估手印显现灵敏度。

2.2.2 灵敏度的影响因素

选用微米尺度的NaYF4∶Yb， Er 材料[NYF（M）]和纳米尺度的NaYF4∶Yb， Er 材料[NYF（N）]分别显现玻璃表面的潜在手印，考察材料的粒径尺寸对显现灵敏度的影响。由图4A 和图4B 可见，煅烧法合成的NYF（M）材料出现明显的团聚现象，其粒径尺寸为微米级（242.1 nm×862.5 nm， 图4A）；水热法合成的NYF（N）材料具有良好的单分散性，其粒径尺寸为纳米级（30.7 nm×45.1 nm， 图4B）。从视觉效果的角度定性判断，如图4A1′和图4B1′所示， NYF（M）的粒径尺寸较大，容易粘连甚至覆盖细节特征；NYF （N）的粒径尺寸较小，容易清晰精细地反映细节特征。Python 识别的细节特征数量如图4A2′和图4B2′所示，使用NYF（M）和NYF（N）显现的手印分别被标记出32 和53 个细节特征；两者所对应的灵敏度数值依次为60.258 和100.742。综上所述，选用粒径较小的材料有利于增强手印显现的灵敏度。

2.3 手印显现选择性的量化评估

2.3.1 选择性的量化原理

手印显现选择性是指显现试剂与手印物质之间的特异结合程度[7]。通常，背景部位较光滑且不易遗留手印物质，因此背景与显现试剂之间的吸附作用微弱，背景的灰度均值（GB）较小；小犁沟部位受到相邻乳突纹线的阻挡且容易沾染手印物质，小犁沟与显现试剂之间可能产生非特异性吸附，所以小犁沟的灰度均值（GF）偏大。但是，考虑到显现试剂的荧光强度通常较高，少量沾染即可引起GF 显著增加，进而影响计算结果的客观性，所以需要对GF 进行修正。乳突纹线与显现试剂之间的吸附作用最强，故乳突纹线的灰度均值GR 最高，可抵消并修正GF。因此，可将GF/GR 作为修正系数，并将GF 与GF/GR 的乘积作为修正后小犁沟的灰度均值（GF *），进而客观评估手印显现的选择性。

2.3.2 选择性的影响因素

选用片状形貌的Eu（p-PTA）3（o-Phen）纳米材料（EPP）和球状形貌的YVO4∶Eu 纳米材料（YVO）分别显现玻璃表面的潜在手印，研究材料的微观形貌对显现选择性的影响。从图5A 和5B 可以看出， EPP 的微观形貌呈现为片状（图5A）， YVO 的微观形貌为球状（图5B）。从视觉效果角度定性判断，如图5A1′和5B1′所示， EPP 的微观形貌为纳米片，其较大的接触面积和过强的吸附性能极易在小犁沟处产生吸附；而YVO 的微观形貌为纳米球，其较小的接触面积和适中的吸附性能不易产生非特异性吸附。Python 统计的选择性质量分布图如图5A2′和5B2′所示，使用YVO 显现的手印被统计出高选择性区域的比例较大；Python 统计的选择性数值如表3 所示，使用EPP 和YVO 显现的手印所对应的选择性数值分别为0.927 和1.287。综上所述，选用接触面积较小和吸附性能适中的材料有利于增强手印显现的选择性。

选用表面乙二醇修饰的LaPO4∶Ce，Tb 纳米材料[LPO （E）]和表面无有机分子修饰的LaPO4∶Ce，Tb 纳米材料[LPO（N）]分别显现玻璃表面的潜在手印，研究材料的表面性质对显现选择性的影响。由图6A 和6B 可见，位于1047 cm–1（图6A）和1041 cm–1（图6B）处的吸收峰对应于PO4 3– 离子的非对称伸缩振动，位于953 cm–1（图6A）和955 cm–1（图6B）处的吸收峰对应于P—O—P 的对称伸缩振动，位于623 cm–1（图6A）、619 cm–1（图6B）及565 cm–1（图6A 和图6B）处的吸收峰对应于O—P—O 键的弯曲振动，说明以上两种LPO 纳米材料均为稀土的正磷酸盐。此外，位于3383 cm–1（图6A）处的强吸收峰对应于乙二醇羟基的伸缩振动，位于2976 cm–1（图6A）处的吸收峰对应于乙二醇亚甲基的反对称伸缩振动，说明LPO（E）的表面被乙二醇修饰；而LPO （N）在对应位置并未出现亚甲基的伸缩振动峰，仅在3385 cm–1（图6B）处出现弱吸收峰（来源于水分子），说明LPO（N）的表面无有机分子修饰。从视觉效果的角度定性判断，如图6A1′和图6B1′所示， LPO （E）的表面被乙二醇修饰，具有很强的吸附性能，极易在小犁沟处产生吸附；而LPO（N）表面无有机分子修饰，具有适中的吸附性能，不易产生非特异性吸附。Python 统计的选择性质量分布图（图6A2′和6B2′）表明，使用LPO（N）显现的手印被统计出高选择性区域的比例较大。Python统计的选择性数值如表4 所示，使用LPO（E）和LPO（N）显现的手印所对应的选择性数值分别为0.367 和0.549。综上所述，选用吸附能力适中的材料有利于增强手印显现的选择性。

2.4 量化评估方法的重现性研究

通过对主观视觉判断和客观评估数值的比较，验证了此量化评估方法的准确性。为验证本方法的重现性，将手印样本数量增加为10 组，平行重复2.1～2.3 节的实验操作，手印显现照片及对应的量化评估结果见电子版文后支持信息图S1～S10 及表S1～S10，对量化评估方法重现性的统计结果见图7。手印显现对比度（图7A）、灵敏度（图7B 和7C）和选择性（图7D）的平均值与视觉效果（图2～图6）及Python 计算结果一致，表明本方法具有良好的准确性；另外，统计结果的标准差较小，表明本方法具有良好的重现性。虽然统计结果的标准差较小，但也不尽相同，这与手印显现操作造成的不可避免的细微差别（如手印遗留物质、手印捺印质量、手印显现方法和手印着粉数量等）有关，说明此量化评估方法具有较好的灵敏响应性。

3 结论

以对比度、灵敏度和选择性作为评估手印荧光显现质量的具体指标，建立了基于Python 的定量评估手印荧光显现质量的方法。提出了上述3 个评估指标的定量计算公式，并验证了由Python 计算出的客观评估数值与视觉效果的主观判断结论的一致性。详细讨论了影响手印荧光显现质量的主要因素，即材料的发光强度和材料的发光颜色主要决定显现的对比度，材料的粒径尺寸主要决定显现的灵敏度，材料的微观形貌和表面性质主要决定显现的选择性。同时，提出了增强手印荧光显现质量的有效途径，即提高材料的发光强度和调谐材料的发光颜色有利于增强显现的对比度，降低材料的粒径尺寸有利于增强显现的灵敏度，调整材料的微观形貌和改变材料的表面性质利于增强显现的选择性。本研究对象仅为显现手印（检材），并未涉及捺印手印（样本），后续研究将借助Python 定量评估检材与样本相似程度，将物证价值由定性判断水平提升到定量评估水平。