超声波、微波预处理对核桃粕蛋白肽钙螯合能力、结构及稳定性的影响

门德盈，王增丽，项全燕，陶 亮,2,3,*，代佳和,2,3，刘俐彤，田 洋,2,3,*

（1.云南农业大学食品科学技术学院，云南 昆明 650201；2.食药同源资源开发与利用教育部工程研究中心，云南 昆明 650201；3.云南省精准营养与个性化食品制造重点实验室，云南 昆明 650201）

钙是人体内一种含量最丰富的必需微量矿物元素（占体质量的1.5%～2.0%），人体骨骼系统中98%的成分为钙元素，人体中钙的摄入主要通过膳食提供[1-2]。钙不仅是人体的重要组成成分，同时对人体健康具有重要的调控作用，如对神经调节、肌肉收缩、骨骼发育等生理活动均具有一定影响[3]。但日常生活中许多因素会导致人体出现钙缺乏症，如饮食结构、生活环境、生活习惯等[4]。目前，钙缺乏症是一个全球公共卫生问题，特别是在发展中国家[5]。人体最初的钙缺乏是无症状的，对人们的生活影响较小，极易被忽视[6]。长期钙缺乏会导致骨质疏松、佝偻病和骨软化症等不可逆转的健康损害[7]。为减少钙缺乏对人体造成的危害，市场上早已出现无机钙、有机酸钙、氨基酸钙等补钙产品[8]，但产品存在钙生物利用度低，稳定性差，胃肠道副作用大（便秘、胀气、肠胃气胀和腹胀）等弊端，越来越不被消费者接受[9]。肽钙螯合物作为新一代补钙产品具有良好的溶解性，可以防止钙沉淀，促进钙吸收[10]。目前，已有许多食品源蛋白肽与钙结合促进钙吸收的研究，例如酪蛋白磷酸肽[11]、盐鸭蛋清肽[12]、猪骨胶原肽[13]等。这些肽大部分来源于动物性和奶制品原料，但素食者及对乳品不耐受人群更倾向于植物源蛋白肽。同时，植物蛋白具有来源广泛、成本低、性能好等优点[14]，部分研究者也已开始关注植物源蛋白肽，如大豆肽、谷物副产物肽均与Ca2+具有较好的螯合能力[15]。

核桃（Juglans regiaL.）作为世界四大干果之一，含有丰富的脂肪、蛋白质、矿物质等营养成分，且在抗骨质疏松、降血压、益智等方面具有潜在的应用价值[16]，是一种食药兼用的坚果。核桃油是核桃加工的主要产品，榨油后会产生大量的核桃粕资源，目前核桃粕主要作为废物处理或者加工成饲料，造成了一定的环境污染和资源浪费，但核桃粕中含有丰富的营养成分，尤其蛋白质量分数高达40%以上[17]，含有18 种氨基酸，包括8 种人体必需氨基酸，是一种优质的植物蛋白资源。研究发现，核桃粕中蛋白质以谷蛋白为主，其溶解性较差，经碱性蛋白酶水解制备的核桃粕蛋白肽其溶解性得到显著提高[18]，是一种高效结合钙离子的植物源蛋白肽。

超声波是一种频率高于20 kHz的声波[19]，是一种安全、绿色无污染的技术，在食品加工中得到广泛应用[20]。超声波技术的特殊效应（空穴效应、机械效应、热效应、化学效应）具有辅助提取、加速反应、改变蛋白质分子特性等优势[21-22]。微波是一种电磁波，其频率为300 MHz～300 GHz，可以在高频条件下随外部电场引起水极性取向的变化，从而进一步引起分子运动和相互摩擦，对物质的内部结构造成一定的影响[23]。超声波和微波会影响到肽的折叠动力学，导致天然折叠结构发生变化，进一步影响肽的物化特性及产品应用[24-25]。目前，将超声波和微波技术运用到肽与金属离子螯合中的研究较少。本实验基于超声波、微波对核桃粕蛋白肽进行预处理，并通过紫外-可见吸收光谱、傅里叶变换红外光谱、荧光光谱、X射线衍射光谱对肽钙螯合物进行结构表证，分析不同预处理对肽钙螯合能力及结合位点的影响。通过pH值稳定性、热稳定性和胃肠道消化确定核桃粕蛋白肽钙螯合物的稳定性，旨在探索超声波、微波技术对核桃粕蛋白肽的影响及其螯合物的变化，为新型植物源蛋白肽钙新产品的研发提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

核桃粕蛋白肽选购于中食都庆生物技术有限公司，分子质量为180～1 000 Da，纯度为95%。

无水氯化钙 国药集团化学试剂有限公司；盐酸重庆川东化工有限公司；氢氧化钠 天津风船化学试剂有限公司；无水乙醇 天津致远化学试剂有限公司；柠檬酸 晟发生物科技有限公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶 北京索莱宝科技有限公司；钙含量显色检测试剂盒 Sigma-Aldrich（上海）贸易有限公司。

1.2 仪器与设备

KQ5200DE超声波设备 昆山市超声仪器有限公司；M1-L213B微波设备 广东美的厨房电器制造有限公司；HWS24恒温水浴锅 国华电器有限公司；LC-4014离心机安徽中科中佳科学仪器有限公司；EPOCH2酶标仪美国伯腾仪器有限公司；UV-3600i Plus紫外-可见近红外漫反射仪器 日本岛津公司；FLS1000稳态/瞬态荧光光谱仪天美（中国）科学仪器有限公司；D8 ADVANCE X射线衍射仪、Tensor 27傅里叶变换红外光谱仪 德国布鲁克公司；204F1热重分析仪 德国耐驰公司；FE28 pH酸度计梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 超声波、微波处理核桃粕蛋白肽及肽钙螯合物的制备

核桃粕蛋白肽冻干粉溶于300 mL超纯水中，形成10 mg/mL的核桃粕蛋白肽溶液。向核桃粕蛋白肽溶液中加入肽钙质量比为1∶5的CaCl2，形成pH值为7.0的混合溶液。利用超声波设备和微波设备，超声波（120、240、360、480 W）、微波（280、420、560、700 W）分别处理混合溶液5 min。处理后的混合溶液放置在55 ℃的恒温水浴锅中水浴60 min。螯合反应后，利用离心机将混合溶液离心（4 000 r/min）20 min，弃去不溶物质。随后加入无水乙醇（溶液体积的6 倍），静置20 min，以相同的离心条件进行离心，收集沉淀物即核桃蛋白肽钙螯合物（简称螯合物）。保留上清液测定其钙质量浓度，计算肽钙螯合率。

1.3.2 肽钙螯合率的测定

利用Liao Wanwen等[26]的方法测定螯合率（邻甲酚酞络合酮比色法），并稍作修改。使用钙含量显色检测试剂盒，按其要求配制钙标准溶液。在96 孔板中每孔先后加入50 µL钙标准溶液和150 µL检测工作液，混匀。室温避光孵育10 min。使用酶标仪在575 nm波长处测定吸光度，制得标准曲线y＝1.576 4x+0.040 7（R2＝0.999）。测定样品时，取1.3.1节中所述上清液1 mL，用超纯水定容至100 mL，形成稀释液，同上述步骤测定上清液钙质量浓度。螯合率的计算如式（1）所示：

式中：C1为混合物中的钙质量浓度/（mg/mL）；C2为每孔样品稀释液中的钙质量浓度/（mg/mL）；n为稀释倍数（100）。

1.3.3 核桃粕蛋白肽钙螯合物的结构表征

1.3.3.1 紫外-可见吸收光谱测试

将未处理的核桃粕蛋白肽钙螯合物（WPP-Ca）、超声波处理核桃粕蛋白肽钙螯合物（UP-WPP-Ca）和微波处理核桃粕蛋白肽钙螯合物（MP-WPP-Ca）溶解在超纯水中，形成0.1 mg/mL的肽钙螯合物溶液。先用超纯水对紫外-可见光谱仪进行空白校正。校正完成后，将溶液在250～500 nm范围内安全扫描。

1.3.3.2 傅里叶变换红外光谱测试

2 mg的WPP-Ca、UP-WPP-Ca和MP-WPP-Ca在200 mg溴化钾中分别研磨并混匀。混匀样品压制成1 mm厚的透明薄片，放入傅里叶变换红外光谱仪内进行检测。以分辨率为4.0 cm-1在4 000～400 cm-1扫描32 次。

1.3.3.3 荧光光谱测试

WPP-Ca、UP-WPP-Ca和MP-WPP-Ca粉末样品经研磨后溶解在超纯水中，制备成3 mg/mL的溶液。溶液在发射波长范围为250～500 nm、激发波长为280 nm的稳态/瞬态荧光光谱仪中进行检测。

1.3.3.4 X射线衍射光谱测试

5 mg的WPP-Ca、UP-WPP-Ca和MP-WPP-Ca粉末样品均匀研磨。样品在X射线衍射仪中进行测量。扫描角度（2θ）范围为5°～90°，扫描速率为2 °/min。

1.3.4 核桃粕蛋白肽钙螯合物的稳定性研究

1.3.4.1 pH值对核桃粕蛋白肽钙螯合物的影响

50.0mg的核桃粕蛋白肽钙螯合物溶解于超纯水中配成1.0 mg/mL的溶液。分别用1.0 mol/L的HCl和NaOH溶液，调节不同处理的样品溶液pH值至2.0、4.0、6.0、8.0、10.0，得到不同pH值组别样品。不同pH值的样品溶液在37 ℃恒温水浴锅中放置60 min。恒温加热后，加热溶液在冰水浴冷却至20 ℃，4 000 r/min离心10 min。取1 mL上清液，超纯水定容至50 mL，测定钙离子质量浓度。钙离子质量浓度的测定方法和1.3.2节中所提到的一致。最后用钙离子保留率表示核桃粕蛋白肽钙螯合物的pH值稳定性，计算如式（2）所示：

式中：C3为核桃粕蛋白肽钙螯合物质量浓度/（mg/mL）；C4为上清液钙离子质量浓度/（mg/mL）；P为稀释倍数（50）。

1.3.4.2 温度对核桃粕蛋白肽钙螯合物的影响

参照Ke Hongling等[27]报道的方法进行热重分析，分析温度对核桃粕蛋白肽钙螯合物的影响。3.0 mg的核桃粕蛋白肽钙螯合物放置在坩埚中。利用热重分析仪在25～900 ℃范围内以10 ℃/min进行升温测试，N2流速控制在30 mL/min。记录样品质量变化，计算并绘制质量损失率曲线。

1.3.4.3 体外消化对核桃粕蛋白肽钙螯合物的影响

采用Minekus等[28]报道的方法进行体外胃肠道消化模拟，并稍作修改。配制螯合物与0.9%生理盐水溶液比为1∶150（mg/mL）的样品溶液。在样品溶液中加入0.5 mL盐酸溶液（1.0 mol/L）和160 mg胃蛋白酶，形成pH 2.0的消化液。消化液在37 ℃避光搅拌并且每隔30 min取出1 mL样液，补充1 mL的新鲜反应液，消化时间为2 h。胃液消化2 h后，向消化液中向加入11 mL NaHCO3溶液（0.5 mol/L）形成pH值为7.5的肠消化液。在此条件下添加18 mL的混合溶液（0.1 g/mL胰蛋白酶溶液与12 mg/mL胆酸盐溶液体积比为2∶1），37 ℃避光搅拌。反应进行2 h，操作方法与模拟胃消化过程一致。消化结束后，肠消化液在100 ℃的条件下加热10 min使酶失活，以终止消化。取上清液测定其钙含量。基于钙离子保留率评估核桃粕蛋白肽钙螯合物的稳定性，计算公式如1.3.4.1节所示。

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 不同超声波、微波功率对核桃粕蛋白肽钙螯合率的影响

不同超声波功率处理的核桃粕蛋白肽与钙离子螯合率的结果如图1A所示。在超声波功率0～480 W范围内，螯合率随超声波功率增大呈现先升高后降低的趋势。当超声波功率在240 W时，UP-WPP-Ca的螯合率达到最大值（（86.11±0.15）%），较WPP-Ca（（74.04±0.17）%）有所提升，表明超声波预处理促进了核桃粕蛋白肽与Ca2+的螯合，且在240 W时钙螯合能力最强。原因可能是随着超声波功率增加，超声波对核桃粕蛋白肽产生更多的空化、剪切和热效应，影响了肽的二级结构，使肽暴露出更多的Ca2+结合位点[29-30]。同时超声波促进了Ca2+的均匀分散[31]，提高了核桃粕蛋白肽与Ca2+结合效率。但当超声波功率超过240 W时，超声波的作用力使多肽结构遭到破坏，不溶性多肽增加，肽与Ca2+结合能力下降[32]。不同微波功率处理的核桃粕蛋白肽与钙离子螯合率的结果如图1B所示。在微波功率0～700 W之间，螯合率随着微波功率增大呈现先提高后降低的趋势。当微波功率在560 W时，MP-WPP-Ca的螯合率达到最大值（（77.69±0.30）%），较WPP-Ca的螯合率有所提升，表明微波处理后的核桃粕蛋白肽钙螯合物具有较高的钙螯合能力，且在560 W时钙螯合能力最强。螯合能力提高的原因可能是微波使核桃粕蛋白肽在微波场的作用下进行有规则的热运动[33]，使核桃粕蛋白肽的表面具有更多可以与Ca2+结合的活性位点。但是当微波功率超过560 W时，高功率造成体系温度过高，导致核桃粕蛋白肽不稳定，从而降低其与钙结合的能力。

图1 微波（A）和超声波（B）功率对核桃粕蛋白肽钙螯合率的影响Fig.1 Effect of microwave (A) and ultrasonic (B) power on the calcium chelation rate of walnut meal protein peptide

结果表明，在处理时间为5 min的条件下，超声波和微波功率分别为240 W和560 W时，核桃粕蛋白肽具有更好的钙离子螯合能力，且超声波提高核桃粕蛋白肽钙螯合率的能力更强。后续实验样品均采用这两个条件制备。

2.2 核桃粕蛋白肽钙螯合物的结构表征

2.2.1 紫外-可见吸收光谱分析

紫外-可见吸收光谱是一种研究物质变化及新物质产生的分析方法，官能团特征峰的波长和吸收强度变化可用于评估金属螯合物的结构变化[34]。WPP-Ca、UP-WPPCa和MP-WPP-Ca的紫外-可见光吸收光谱如图2所示。超声波和微波处理均改变了紫外吸收光谱。WPP-Ca、UP-WPP-Ca和MP-WPP-Ca的最大吸收峰分别出现在229、228 nm和229 nm处，与肽键中C＝O的n→π*跃迁相对应[35]。超声波使核桃粕蛋白肽中C＝O的原始结构发生改变，增强了n→π*的迁移，从而使UP-WPP-Ca的光谱具有蓝移趋势，这与Qu Wenjuan等[30]的研究结果相似。此外在291 nm波长处，WPP-Ca、UP-WPP-Ca和MPWPP-Ca都出现弱吸收峰，与WPP-Ca相比，UP-WPP-Ca和MP-WPP-Ca的吸收峰强度明显增强。原因可能是超声波、微波处理影响了肽中芳香族氨基酸残基由π→π*的转变[36]。紫外光谱中肽峰和强度的变化表明，超声波和微波处理增加了核桃粕蛋白肽的钙离子结合位点（—CO—NH—、—NH—、—COOH），形成了UP-WPP-Ca、MPWPP-Ca的空间结构。

图2 核桃粕蛋白肽钙螯合物的紫外-可见光谱图Fig.2 UV-Vis absorption spectra of walnut peptide-calcium chelate

2.2.2 傅里叶变换红外光谱分析

当金属离子与配体原子（O、N和S）结合时，配位键的振动会引起傅里叶变换红外光谱的改变，由此可以揭示肽的有机基团与Ca2+的相互作用。WPP-Ca、UP-WPP-Ca和MP-WPP-Ca的红外光谱如图3所示。不同组别的傅里叶变换红外光谱具有明显差异，表明超声波和微波处理的核桃粕蛋白肽与Ca2+螯合反应后部分氨基酸基团发生了改变。WPP-Ca、UP-WPP-Ca和MP-WPPCa分别在3 351.68、3 350.23 cm-1和3 346.86 cm-1处出现吸收峰。与WPP-Ca相比，UP-WPP-Ca和MP-WPP-Ca分别红移了1.45 cm-1和4.82 cm-1，三者都处于N—H波段的伸缩振动[37]。这些现象表明超声波、微波处理引起了N—H的伸缩振动，促使—NH2与Ca2+螯合。现象进一步说明了超声波和微波处理使更多的氨基酸N—H带（N端、赖氨酸、精氨酸残基等）参与Ca2+螯合反应。因此，UP-WPP-Ca和MP-WPP-Ca的伸缩振动强度减弱。—C＝O键的伸缩振动会在红外吸收光谱1 700～1 600 cm-1区域内形成酰胺I带[38]。与WPP-Ca相比，UP-WPP-Ca和MP-WPP-Ca出现的吸收峰从1 659.93 cm-1分别蓝移到1 660.89 cm-1和1 663.30 cm-1，表明UP-WPP-Ca和MPWPP-Ca中—C＝O的振动强度增加，UP-WPP-Ca和MPWPP-Ca的分子内氢键减少，更多的—C＝O提供了Ca2+的配位位点，Wang Xu等[36]研究黄瓜籽肽钙螯合物也发现酰胺I带相同的迁移现象。在1 600～1 500 cm-1区域内的红外吸收光谱为N—H弯曲振动引起的酰胺II带[9]。与WPP-Ca相比，UP-WPP-Ca和MP-WPP-Ca出现的吸收峰从1 555.31 cm-1分别蓝移到1 557.24 cm-1和1 556.27 cm-1，表明UP-WPP-Ca和MP-WPP-Ca中更多的N—H提供了Ca2+的配位位点，表现出与C＝O振动强度相似的变化趋势。此外，1 430～1 370 cm-1区域的傅里叶变换红外光谱对应羧酸盐基团（—COO—）的伸缩振动[9]。WPP-Ca在1 415.01 cm-1处有一个吸收峰。MP-WPP-Ca的峰值蓝移至1 416.94 cm-1，这可能是—COO—与Ca2+螯合时，引起羧酸盐基团的键长拉伸，此现象与Hu Guanhua等[39]的研究具有同样的蓝移趋势。UP-WPP-Ca的峰值从1 415.01 cm-1红移至1 414.53 cm-1，原因可能是—COO—与Ca2+螯合时，引起羧酸盐基团的键长收缩，此现象与Fang Shunxiang等[40]的研究结果类似。羧酸盐基团的伸缩振动表明，超声波、微波处理的核桃粕蛋白肽最终导致螯合物羧酸盐基团键长的伸缩振动。这些结果证实了核桃粕蛋白肽的—C＝O、—NH—、—COO—基团参与了与Ca2+的螯合反应。此外，UP-WPP-Ca和MP-WPPCa的吸收峰从1 110.80 cm-1分别蓝移到1 113.21 cm-1和1 111.28 cm-1，表明相较于WPP-Ca，超声波、微波处理增强了—C＝O键的拉伸振动强度。在1 000～500 cm-1的区域内，WPP-Ca、UP-WPP-Ca和MP-WPP-Ca都出现了不同程度的吸收峰，这是由于C—H和N—H键被N—Ca键取代而产生的振动。有研究报道，氨基、羰基、羧基、酰胺键及羧酸盐基团是多肽与Ca2+螯合的主要结合位点[41-42]，超声波、微波处理影响到这些结合位点，进一步提高了核桃粕蛋白肽钙的螯合能力。

图3 核桃粕蛋白肽钙螯合物的傅里叶变换红外光谱图Fig.3 FTIR spectra of walnut peptide-calcium chelate

2.2.3 X射线衍射光谱分析

X射线衍射光谱常用于分析聚合物的结晶态与无定形态的微观结构[43]。从图4可以看出，WPP-Ca、UP-WPP-Ca和MP-WPP-Ca都有两个主要的宽分散和弱分散衍射峰。说明三者都是一种无规则的非晶型结构[44]。相较于WPP-Ca，UP-WPP-Ca和MP-WPP-Ca的峰较为狭窄且衍射峰强度明显增强，这表明超声波、微波预处理使核桃粕蛋白肽的结构发生改变（即两种处理方式引起核桃粕蛋白肽分子排列的变化），进一步使核桃粕蛋白肽与Ca2+螯合形成更为有序的结构。

2.2.4 荧光光谱分析

色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等芳香族氨基酸可以在特定的激发波长下产生内源性荧光[45]，而且内源性荧光猝灭是肽折叠的典型现象。肽的构象变化、与金属离子等小分子的相互作用可通过荧光强度变化进行判断[46]。如图5所示，UP-WPP-Ca、MP-WPP-Ca的荧光强度均出现下降，原因可能是超声波和微波处理的核桃粕蛋白肽与Ca2+之间形成更多的非共价相互作用，增加了核桃粕蛋白肽与Ca2+结合的芳香族氨基酸的数量，从而降低了荧光强度，这与2.2.1节紫外光谱芳香族氨基酸残基的π→π*的迁移结果一致，与Wang Yilun等[47]的荧光光谱结果相似。MP-WPP-Ca的荧光强度高于UP-WPP-Ca的荧光强度，表明UP-WPP-Ca中更多的芳香族氨基酸与Ca2+螯合。这些研究结果表明，超声波、微波处理可以促进核桃粕蛋白肽中芳香族氨基酸与钙离子的螯合。

图5 核桃粕蛋白肽钙螯合物的荧光光谱图Fig.5 Fluorescence spectra of walnut peptide-calcium chelate

2.3 核桃粕蛋白肽钙螯合物稳定性结果

2.3.1 核桃粕蛋白肽钙螯合物的酸碱稳定性

图6显示了WPP-Ca、UP-WPP-Ca、MP-WPP-Ca在酸性和碱性条件下的稳定性。相较于WPP-Ca，UP-WPP-Ca、MP-WPP-Ca具有更好的酸碱稳定性。在pH 6.0～10.0时，UP-WPP-Ca具有较好的稳定性。在pH 6时，UP-WPP-Ca和MP-WPP-Ca的钙离子保留率分别为（82.92%±1.68）%、（79.03%±1.85）%；在pH 10时，钙离子保留率分别为（94.72%±1.94）%、（91.23%±1.72）%。在酸性环境（pH 2～6）中，MP-WPP-Ca的稳定性高于UP-WPP-Ca的稳定性。在pH 2时，钙离子保留率分别为（25.49%±1.74）%（UP-WPP-Ca）和（30.81%±1.85）%（MP-WPP-Ca）。相较WPP-Ca，虽然在酸性环境下UP-WPP-Ca和MP-WPPCa的稳定性有所提高，但在酸性环境下同样具有低稳定性的缺点。原因是带正电荷的氢离子与带正电荷的钙离子竞争核桃粕蛋白肽上的螯合位点，导致部分螯合的Ca2+丢失。碱性环境下，UP-WPP-Ca和MP-WPP-Ca稳定性较好，且均高于WPP-Ca。总之，超声波、微波处理的核桃粕蛋白肽可以促进螯合物酸碱稳定性，提高Ca2+的保留率。

图6 核桃粕蛋白肽钙螯合物在酸碱环境中的稳定性Fig.6 Stability of walnut peptide-calcium chelates in acidic and alkaline environments

2.3.2 核桃粕蛋白肽钙螯合物的热稳定性

图7为WPP-Ca、UP-WPP-Ca、MP-WPP-Ca的热重分析和微商热重分析图。WPP-Ca、UP-WPP-Ca、MP-WPP-Ca的熔点变化和化学结构的差异可以通过不同温度环境下的热解速率进行确定。在初始加热阶段（25～130 ℃），WPP-Ca、UP-WPP-Ca、MP-WPP-Ca显示一定程度的质量损失。在这个阶段，MP-WPP-Ca和WPP-Ca的质量损失速率没有显著差异，分别在119.23 ℃和115.54 ℃出现最大质量损失速率。但是UP-WPP-Ca的质量损失速率显著低于WPP-Ca和MP-WPP-Ca。表明UPWPP-Ca的热敏感性降低。随着温度的持续升高，WPPCa、UP-WPP-Ca和MP-WPP-Ca开始迅速分解。在有机降解过程中，非共价键（分子间/分子内的氢键、静电和疏水相互作用）都会发生断裂。微商热重分析曲线显示WPP-Ca、UP-WPP-Ca、MP-WPP-Ca均处在吸热状态，WPP-Ca在343.48 ℃时达到最大质量损失速率，而UPWPP-Ca、MP-WPP-Ca分别在327.64 ℃和343.82 ℃处达到最大质量损失速率。UP-WPP-Ca和MP-WPP-Ca的最大质量损失速率显著小于WPP-Ca的最大质量损失速率。综合结果表明，UP-WPP-Ca和MP-WPP-Ca的热稳定性优于WPP-Ca。耐热性的差异是由于螯合物形成的空间构象的变化，这一结果可由2.2.2节中傅里叶变换红外光谱变化证实。

图7 核桃粕蛋白肽钙螯合物的热稳定性Fig.7 Thermal stability of walnut peptide-calcium chelate

2.3.3 核桃粕蛋白肽钙螯合物在模拟胃肠道消化过程中的稳定性

膳食营养物质通常经过胃肠道消化被吸收，胃蛋白酶和胰蛋白酶会水解核桃粕蛋白肽形成更小的肽或氨基酸，同时胃肠道消化环境也会影响多肽的结构和活性。因此，基于胃肠道消化环境可以用于评价膳食物质的消化稳定性[48]。核桃粕蛋白肽钙螯合物在胃肠道环境中的钙离子保留率如图8所示。在体外胃肠消化过程中，UP-WPP-Ca和MP-WPP-Ca具有显著的高稳定性。胃消化2 h后，WPP-Ca的钙离子保留率为（86.07±0.77）%，UP-WPP-Ca和MP-WPP-Ca的钙离子保留率分别为（89.22±0.46）%和（90.23±0.75）%。相较于WPPCa，UP-WPP-Ca和MP-WPP-Ca的钙离子保留率均有所提高。结果表明UP-WPP-Ca和MP-WPP-Ca通过降低Ca2+的快速释放，提高肽钙螯合物的螯合能力和转运至肠道的递送能力，且MP-WPP-Ca比UP-WPP-Ca更稳定，说明MP-WPP-Ca较UP-WPP-Ca更能耐受酸性环境。在肠道消化过程中（消化时间2～4 h），随着时间的延长，WPPCa、UP-WPP-Ca和MP-WPP-Ca的钙离子保留率持续下降。原因可能是胃内的酸性条件引起了螯合物的结构变化，影响了Ca2+的结合能力。此外，胃蛋白酶、胰蛋白酶的存在可能导致肽的降解，降低了Ca2+的保留率。消化4 h时，WPP-Ca、UP-WPP-Ca和MP-WPP-Ca的钙离子保留率分别为（81.01±0.42）%、（85.73±0.58）%和（83.11±1.58）%。肠道消化结果表明，UP-WPPCa和MP-WPP-Ca可提高螯合物的肠道消化稳定性，且UP-WPP-Ca比MP-WPP-Ca更稳定，在偏碱性环境下UPWPP-Ca较MP-WPP-Ca可以更好地提高核桃粕蛋白肽保留钙离子的能力。胃肠道消化研究表明，UP-WPP-Ca和MP-WPP-Ca较WPP-Ca具有更强的钙离子螯合能力，因此具有基于多肽载运钙离子提高钙生物利用度的潜力，同时可避免肠道环境残留过多的钙离子形成难溶性氢氧化钙，影响肠道健康或引起其他疾病。

图8 核桃粕蛋白肽钙螯合物在胃肠道消化中的稳定性Fig.8 Stability of walnut peptide-calcium chelate toward gastrointestinal digestion

3 结论

本研究成功制备了具有较高Ca2+螯合能力、稳定性强的UP-WPP-Ca和MP-WPP-Ca。超声波、微波处理通过影响核桃粕蛋白肽结合钙离子的位点（氨基、羰基、羧基、酰胺键及羧酸盐基团）和增加核桃粕蛋白肽的芳香族氨基酸残基与Ca2+螯合数量提高了核桃粕蛋白肽钙螯合能力。此外，超声波和微波处理通过影响核桃粕蛋白肽的分子排列促使核桃粕肽钙螯合物形成有序结构。UPWPP-Ca和MP-WPP-Ca在不同pH值、温度和模拟胃肠消化下较WPP-Ca保持了更高的稳定性，即超声波、微波处理的核桃粕蛋白肽在提高载钙能力和生物利用度方面具有一定的潜在价值，对核桃粕蛋白肽钙螯合物的加工生产及补钙产品的开发具有一定的指导意义。同时，关于UP-WPP-Ca、MP-WPP-Ca、WPP-Ca的钙转运和促钙吸收的能力差异还需开展进一步的研究。