沿面放电等离子体灭活苹果汁中耐高渗酵母的模型

孙嘉莉，王 英，敖 羽，张文乐，张绍君，包晓玮

（新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆 乌鲁木齐 830052）

在食品工业中，确保食品安全和延长其保质期是至关重要的。尽管传统的热处理方法在灭活食品中的微生物方面效果显著，但这些方法往往会损害食品的营养价值和感官品质。因此，开发既能有效灭活微生物又能保持食品品质的新技术，已成为食品科学领域的一个重要研究方向。苹果果汁因其营养价值及独特的口味，在世界范围内的消费日益增长[1]。然而酵母很容易使苹果汁发生腐败，如果不使用适当的方法对其进行灭活，就会对人体健康造成严重危害[2]。其中，耐高渗酵母（Zygosaccharomyces rouxii）是食品工业中著名的腐败酵母，也是造成苹果汁腐败的原因之一[3]。Z.rouxii因为具有耐酸、耐高渗透压、耐弱酸抑菌剂以及对高温环境的适应性等特点，可导致高糖类食品发生变质，从而使苹果汁发酵变质而腐败，使产品品质下降[4-6]。因此，探寻一种对苹果汁中Z.rouxii安全、高效的灭活方法势在必行。

等离子体被视为物质的第四种存在状态[7]，是含有多种活性物质的电离气体，由于原子或者原子团失去电子后电离形成[8]。根据激发出的电子温度，等离子体可以划分为高温等离子体和低温等离子体。在低温条件下，气体中的原子或分子被激发而形成的带电粒子云为放电等离子体。而沿面放电等离子体是指在介质表面上形成的放电等离子体。当在介质表面施加足够高的电场或电压时，气体分子会被激发并形成带电粒子云，从而形成沿面放电等离子体。大气压低温等离子体技术是对食品工业发展有促进作用的新型非热灭菌技术，因此广受全球研究者的关注[9]。研究表明，由于渗透深度小，等离子体工艺对食物处理存在限制性。但这些研究同时表明，低温等离子体具有对食品表面微生物灭活的潜力[10-11]。低温等离子体技术作为非热处理技术之一[9]，在灭菌的过程中有很多的优点，如安全、高效、不易产生残留[12]。放电等离子体处理速度快，处理能力强，已经被证实可成功灭活火腿表面的单核细胞增生李斯特菌[13]、牛肉干表面的金黄色葡萄球菌[14]、盐水鸭表面的大肠杆菌[15]等，因此，应用沿面放电等离子体技术灭活苹果果汁中的Z.rouxii是可行的。

由于受到实验条件的制约，确定适宜的等离子体处理工艺既费时又费力，并且在技术上实施起来有一定的难度。计算机模拟技术因其不需要花费大量实验时间，能够从不同数学建模中得到准确结果，可用作等离子体传质过程快速分析的一种手段，方便等离子体系统设计和扩充[16-17]。因此，利用计算机模拟技术对等离子体处理过程进行研究是目前等离子体技术研究的一个新动向。

因此，本研究采用数值模拟软件COMSOL Multiphysics建立模拟处理过程中微生物灭活作用的数值模型，并在不同放电电压下验证模型，分析不同气泡大小和不同处理量对失活效果的影响，以探讨研究沿面放电等离子灭活液体中微生物的效果。然后，将模型模拟所得失活曲线与实验所得失活曲线进行比较，进一步研究沿面放电等离子体对液体微生物的灭活影响。最后，通过数据分析确认沿面放电等离子体在苹果汁工业中灭活Z.rouxii的方法是否可行。该模型有利于沿面放电等离子体灭活微生物的工艺开发，同时为沿面放电等离子体在食品工业上的应用建立理论基础，促进等离子体技术在食品工业中的发展。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红富士苹果，采购于陕西省杨凌市，采收时间为9月中下旬，果实大小均一，表面无机械损伤，无病害或腐烂等问题，将苹果去皮榨汁后冷藏备用。

本研究采用的Z.rouxiiLB（B-WHX-12-54）由西北农林科技大学提供，GenBank登录号为KC544459。将Z.rouxiiLB菌株培养在（28.0±0.1）℃条件下的酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast peptone dextrose agar，YPD）液体培养基（20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖和10 g/L酵母抽取物）中，振荡培养48 h（150 r/min）。后将培养液在9 000 r/min条件下离心8 min，去除上清液，用无菌蒸馏水清洗2 遍。将所得酵母重悬在无菌蒸馏水中，可获得稳定生长阶段的微生物，约为107～108CFU/mL，后冷藏保存备用。将Z.rouxiiLB接种到每个苹果汁样品中，并使每一个样品中Z.rouxiiLB的菌落数量约为1.5×106CFU/mL。

葡萄糖 国药集团化学试剂有限公司；氯化钠（分析纯）四川西陇化工有限公司；琼脂粉 上海源叶生物科技有限公司；蛋白胨 上海中秦化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

JX-RS485-20PL型臭氧传感器 北京金讯昌通电子科技有限公司；i-SPEED数码相机 奥林巴斯（中国）有限公司。

沿面放电等离子体反应器系统示意图见图1。沿面放电等离子体系统由高压交流电源（0～30 kV、50 Hz）、接地电极和有机玻璃容器组成。反应器容器直径40 mm、高350 mm，采用有机玻璃圆筒。高压电极为直径1 mm、放电长度100 mm的不锈钢弹簧，并附着在直径为12 mm、高度为350 mm的圆柱形石英管内壁上。反应器中的细胞悬浮液为接地电极，沿着石英管的纵轴方向沿面放电[18]。当沿面放电等离子体系统启动时，干燥空气由气泵泵入圆柱形石英管，并在石英管底部通过曝气器以150 L/h的流速进入反应器中进行处理，总处理量为300 mL。

图1 沿面放电等离子体反应器示意图Fig.1 Schematic diagram of surface discharge plasma reactor

1.3 方法

1.3.1 物理模型的建立

利用数值仿真软件COMSOL Multiphysics建立沿面放电等离子体模型，如图2所示，研究在21、15、11 kV放电电压，直径为5.46 mm的大气泡和直径为3.21 mm的小气泡，反应器直径为40、50 mm和80 mm时的处理量条件下沿面放电等离子体灭活苹果果汁中Z.rouxii的效果，并对此模型进行验证实验。

图2 模拟中使用的三维几何体Fig.2 Three-dimensional geometry used in the simulation

沿面放电等离子体是可以产生多种反应物质的化学反应，如H2O2、O3、·OH和·O[19]。因为臭氧是各种等离子体中公认的成分，并且具有成熟的测量方法。因此，本项研究中沿面放电等离子的建模参数采用臭氧浓度。等离子体放电时，出口处采用精准度为2 mg/m3的臭氧传感器每隔30 s测定一次臭氧浓度。在放电过程中，·O是在氧分子被激发并通过高能电子攻击解离后产生的，而臭氧则由·O与O2反应生成，如式（1）所示[19]，臭氧的浓度与放电电压有关。

1.3.2 控制方程

1.3.2.1 湍流中的气泡运输

在酵母经臭氧灭活时，假定气泡一直以终端速度连续移动。可作如下假设：

气体密度于液体密度而言，可忽略；通过黏性力和压力平衡，确定气泡在液体中的相对运动；这两个因素具有相同的压力场。

因此，液体RANSk-ε湍流方程是可解的，同时臭氧气泡的速度可由滑移模型进行引导。臭氧气泡的体积分数可由混合平均连续性方程计算出压力分布并由有效气体密度的传输方程解出，如式（2）所示[20]，其中下标l表示与液体相关的量，下标g表示和气体有关的量。

连续性方程为式（3），臭氧在水中的气体输送过程为式（4）：

式中：ρg为臭氧的气体密度/（kg/m3）；为臭氧体积分数/（m3/m3）；ug为气体速度矢量/（m/s）；mgl为从气体到液体的传质速率/（kg/（m3·s））；下同。

1.3.2.2 稀释物种运输

参考马国瑜等[21]对于扩散问题的处理方法，通过使用稀释物种运输模型，能够获取溶剂中臭氧和酵母的浓度分布。这种模型能够处理溶剂中物质的运输和反应过程。其中，物质在溶剂中的运输和反应主要在这一界面上进行。菲克定律描述的扩散现象，以及由流场引起的对流现象，共同为微生物提供了运输的动力，上述内容由式（5）、（6）进行拟合：

式中：Di为物种扩散系数/（m2/s）；ci为物质浓度/（mol/m3）；u为流体速度矢量/（m/s）；Ri为物种反应速率/（mol/（m3·s））；Ni为通量矢量/（mol/（m2·s））；i指代第i类物质。

在运输的过程当中，臭氧与酵母菌两者互相反应且反应速率相等，定义为式（7）：

式中：RO3为臭氧的反应速率/（mol/（m3·s））；Ry为酵母菌液的反应速率/（mol/（m3·s））；cy为酵母菌液的浓度/（mol/m3）；cO3为臭氧的浓度/（mol/m3）；kreac为反应速率系数/（m3/（mol·s））。kreac由微生物的常数所确定，不能被预测。参考Zhou Pei等[22]的方法，其数值可以通过实验法得出，用m3/（mol·s）表示。对于已经确定的气体流速与等离子设备，kreac与N0（初始浓度）存在相关性。

1.3.3 初始和边界条件

曝气器位于反应器底层，气体流速可以通过气体流量计得到稳定的控制。通过k-ε湍流方程（2）中的重力项考虑重力：将压力点约束（p＝0）添加到出口边界（靠近大气）上的点，规定压力等级，提供一个界值，用于COMSOL启动模拟。

气体入口处数学描述如式（8）～（11）所示：

式中：k为湍流动能/（（mol·s2）/m2）；n为入口边界处的法向量；ul,tang为壁面切向速度/（m/s）。

几何体的顶端是可以忽略表面运动的自由表面，以液体的滑动条件对表面近似模拟。臭氧可以经过此边界条件自由离开反应器。

在模拟流速恒定且进口物质通量率稳定的臭氧源时，由于酵母菌仅在水中存在，因此进入口浓度定为零。

1.3.4 模型参数

等离子体灭活酵母的过程在室温条件下进行，在此过程的建模中，臭氧的物理性质具有重要意义[23-25]。

臭氧的物理性质被确定为：

臭氧密度：ρg＝2.14 kg/m3；臭氧扩散系数：Dl＝1.74×10-9m2/s；温度：T＝290.15 K；气体速度矢量：Vg＝8.33×10-6m3/s。

气泡大小对等离子体灭活微生物过程中的数值模拟有重要约束作用。为了研究气泡大小对灭活效果的影响，采用两种不同大小的曝气器以产生不同尺寸的气泡，如图3所示，气泡大小采用照相法进行测量。为了避免受苹果汁色泽的影响，拍摄过程在纯净水中进行。利用数码相机（帧速率：2 000 fps），在反应器的中间位置获取气泡图像。然后使用图像处理系统处理微气泡，选取大约200 个气泡同时统计其直径大小，计算出Sauter平均直径[25]，如式（12）所示：

图3 气泡照片Fig.3 Photographs of bubbles

式中：dbs为气泡Sauter平均直径/m；di为气泡直径/m；ni为di的气泡直径范围内的气泡数量/个；根据计算，大气泡的直径平均为5.46 mm，小气泡的直径平均为3.21 mm。

1.3.5 微生物计数

等离子处理后的微生物通过细胞培养法进行确定，并使用YPD培养基在28 ℃下培养72 h计算菌落数，一式三份进行分析。使用一级动力学模型[26]，如式（13）所示，得到失活曲线。

式中：N0为微生物初始浓度/（CFU/mL）；N为经等离子体处理t时间后微生物的浓度/（CFU/mL）；t为等离子体处理时间/min；D为杀灭其中90%微生物所需要的时间/min。

1.3.6 模型验证

实验利用沿面放电等离子体反应系统验证计算机模型，放电电压（21、15、11 kV）。实验中，在固定时间取反应器中含有酵母的苹果汁样品，并采用细胞培养法测得酵母浓度。所有实验进行3 次，利用COMSOL软件对酵母菌的存活曲线进行分析。

1.3.7 模型应用

1.3.7.1 不同气泡大小对灭活效果的影响

采用两种不同大小的曝气器以产生不同尺寸的气泡，以探究不同气泡大小对灭活效果的影响。根据计算，选择直径为5.46 mm的大气泡和直径为3.21 mm的小气泡。将初始菌液浓度定为1.5×102、1.5×104CFU/mL和1.5×106CFU/mL，在模型中输入气泡大小参数得到存活曲线，并将其与实验结果作对比。

1.3.7.2 不同处理量对灭活效果的影响

不同处理量对气液传质过程的影响在反应器的设计和放大的过程中起着重要作用[20]。本实验在扩大反应容器的半径时，加工的苹果汁的量也相应地改变。当反应容器的直径为40、50 mm和80 mm时，相应的加工苹果汁的体积分别扩大了1、1.56 倍和4 倍。将参数输入到模型中，并将模拟值与实验值进行对比，进而定量分析处理量对灭活效果的影响。

1.4 数据处理与统计分析

所有实验重复进行3 次。图表绘制使用软件Origin 2021，数据使用SPSS 26进行方差分析（ANOVA），数据平均值间的显著性分析采用Tukey多重比较法，水平为P＝0.05，P＜0.05时效果影响显著，P≥0.05效果影响不显著。

2 结果与分析

2.1 模型参数

图4体现了在具有差异的初始菌液浓度下进行灭活实验，所获得相应的反应速率系数。实验中放电电压为21 kV，气泡大小为3.21 mm，处理量为300 mL。结果表明，随着初始菌液浓度的升高，kreac值降低，当初始菌液浓度为1.5×102CFU/mL时，获得最大kreac值，为0.256，而当初始菌液浓度为1.5×106CFU/mL时，获得最小kreac值，为0.202。所得结果可能是因为微生物的堆积结构可以在等离子处理过程中作为保护屏障[27]。实验数据显示，kreac值与初始菌液浓度值N0值之间的线性关系可以用kreac＝-0.014 38lgN0+0.288 05（R2＝0.98）描述，这些数据进一步被用于计算机模拟模型中，并应用COMSOL软件中的线性插值函数进行输入。

图4 反应速率系数（kreac）与酵母浓度（N0）之间的相关性Fig.4 Correlation between reaction rate coefficient (kreac) and yeast concentration (N0)

2.2 模型验证

当放电电压设置为21、15、11 kV时，通过臭氧传感器测量得到入口处臭氧浓度分别为21.43、17.14 mg/L和12.86 mg/L。放电电压的变化会影响活性物质的浓度，即较高的区域浓度值与能量密度的增加相关[28]。Mai-Prochnow等[29]在白色念珠菌和小孢子菌的灭活过程中也发现了类似的结果。通过实验结果可得，放电电压的升高可在达到同样的微生物灭活效果时，等离子体的处理时间缩短。

图5显示了当初始菌液浓度为1.5×104CFU/mL、气泡大小为3.21 mm、处理量为300 mL时，在3 种不同的放电电压21、15 kV和11 kV下，得到的实验和模拟的酵母失活曲线。将3 条失活曲线作比较，模拟结果与实验结果具有很好的重合性。酵母被灭活所需要的时间随着放电电压的升高及臭氧浓度的增加而减少。在细胞计数采样过程中，存储时间会使模拟结果和实验结果产生差异。即在液体中产生的副产物经过等离子体处理后仍可以继续发挥杀菌作用，这会导致模拟结果较实验结果稍高。在等离子体处理苹果汁中的弗氏柠檬酸杆菌[26]的灭活过程中也观察到了类似的结果。表1将3 种放电电压下等离子体对Z.rouxiiLB灭活过程的模拟D值和实验D值进行对比。当放电电压为21、15 kV和11 kV时，D值误差分别为4.652 5%、4.615 8%和3.306 3%。

表1 3 种不同放电电压下等离子体对Z.rouxii LB灭活过程的实验值和模拟值Table 1 Experimental and simulated values for the inactivation process of Z.rouxii LB by plasma under three different discharge voltages

图5 不同放电电压对等离子体灭活Z.rouxii LB的影响Fig.5 Effect of different discharge voltages on SDP inactivation of Z.rouxii LB

2.3 不同气泡大小的影响

图6显示了在不同气泡大小3.21 mm和5.46 mm下沿面放电等离子体处理苹果汁中Z.rouxiiLB的灭活曲线。沿面放电等离子体放电电压为21 kV，Z.rouxiiLB初始浓度为1.5×102、1.5×104、1.5×106CFU/mL，处理量为300 mL。

图6 不同气泡大小对等离子体灭活Z.rouxii LB的影响Fig.6 Effect of different bubble sizes on SDP inactivation of Z.rouxii LB

结果表明，在21 kV的放电电压下，初始菌液浓度为1.5×102CFU/mL时，3.21 mm和5.46 mm气泡大小模拟的D值分别为2.493 2 min和2.612 8 min，两者之间相差4.575 1%；初始菌液浓度为1.5×104CFU/mL时，模拟D值分别为2.560 6 min和2.6712 min，两者之间相差4.1455%；初始菌液浓度为1.5×106CFU/mL时，模拟D值分别为3.644 7 min和3.936 1 min，两者之间相差7.402%，在处理过程中，测得的实验值比模拟值偏低，尤其是在初始菌液浓度较高，为1.5×106CFU/mL时。这可能是由于脱离处理后，等离子体的残留活性物质依然可以发生灭活作用。此现象与Magureanu[30]和郭俭[31]等的研究一致，其中的机理有待进一步研究。在不同气泡大小情况下D值误差均不超过8%，实验结果与模拟结果相吻合。由此可见，气泡大小的改变对等离子体灭活作用不会产生显著的影响（P≥0.5）。

2.4 不同处理量的影响

图7显示了在反应器直径为40、50 mm和80 mm时，沿面放电等离子体处理苹果汁中Z.rouxiiLB的模型及实验与模拟D值的比较。此时，加工苹果汁的体积分别扩大了1、1.56 倍和4 倍。沿面放电等离子体放电电压为21 kV，Z.rouxiiLB初始浓度为1.5×104CFU/mL，气泡大小3.21 mm。结果表明，在21 kV的放电电压下，初始菌液浓度为1.5×104CFU/mL时，当反应容器的直径为40、50 mm和80 mm时，实验D值分别为2.735、4.002 min和4.759 min，模拟D值分别是2.561、3.855 min和4.388 min。实验D值与模拟值误差不超过8%，匹配良好。研究证明，处理量的变化对等离子体灭活微生物效果影响显著（P＜0.05）。当苹果汁的加工量增加时，达到所需灭活效果的加工时间更长。

图7 不同处理量对等离子体灭活Z.rouxii LB的影响Fig.7 Effect of different sample volumes on SDP inactivation of Z.rouxii LB

3 结论

在本研究中，利用数值仿真软件COMSOL Multiphysics建立计算机模型，研究苹果果汁中Z.rouxiiLB在沿面放电等离子体反应器中的灭活过程。依据此项研究所建立的计算机模型，得到了不同放电电压条件下酵母的存活曲线。通过验证后的模型，进一步研究不同气泡大小和处理量对等离子体灭活耐高渗酵母的影响，模拟结果和实验结果在各个条件下误差不超过8%。实验结果与模拟结果同时表明，随着初始菌液浓度的增加，反应速率系数减小，随着放电电压的增加，灭活酵母所需时间也将缩短。不同气泡尺寸对酵母菌的灭活作用不显著，处理量增加会使灭活时间延长。在模拟结果的基础上，可以对等离子体灭活酵母的处理过程最佳化，同时为等离子体技术的工程化应用奠定理论基础。