不同高静压的压力处理对豌豆7S、11S球蛋白形成凝胶的影响

王雪艳，李开鑫，李家豪，马玲君，陈 芳，胡小松，季俊夫

（中国农业大学食品科学与营养工程学院，国家果蔬加工工程技术研究中心，北京 100083）

凝胶化是豌豆球蛋白重要的功能特性之一，可以充分地应用在改变食品质地等方面。豌豆球蛋白根据沉降系数被划分为7S球蛋白和11S球蛋白两种，7S是分子质量在170 kDa的三聚体，缺乏半胱氨酸残基；11S是由6 个亚基对（由一个酸性亚基和一个碱性亚基组成）通过非共价作用组成的六聚体，分子质量在320～380 kDa，11S含有比7S更多的含硫氨基酸[1]。由于7S和11S球蛋白在结构上存在差异，导致二者具有不同的凝胶能力。已有研究表明，在热诱导和酸诱导凝胶时，7S相比11S球蛋白表现出更强的凝胶性能[2]。如果将7S与11S球蛋白按照不同比例混合，可以有效地调控凝胶的机械性能，使其满足在不同食品中的质地要求。

前人已经对热诱导的豌豆球蛋白凝胶进行了大量的研究，但由于加热工艺会加速化学反应，对营养成分的破坏限制了其在功能性食品中的应用，通过冷诱导形成凝胶原则上不会加速化学反应，而是在微观和/或宏观上诱导分子发生物理变化，因此研究豌豆球蛋白的冷诱导凝胶成为了一大热点[3]。冷诱导中，高静压技术受到了越来越多的关注，在高静压处理下，较大的分子链（如蛋白质链）在降低到正常压力后被延长。这种延长是由处理压力的改变引起的，这表明较大分子链的3D结构会被部分或全部破坏，从而改变蛋白质结构[4]。因此高静压诱导处理可以更好地控制蛋白质所形成凝胶的形状、结构和质地，可以作为优秀的凝胶诱导方式[5-6]。高静压诱导凝胶产生是根据蛋白质结构和施加压力的条件不同从而导致蛋白质变性或聚集，其原理是通过高静压使蛋白质变性解折叠，暴露内部疏水残基，蛋白质之间相互作用、连接、形成网络结构，在释压的过程中，蛋白质聚集形成凝胶[7-8]。不同压强引起的蛋白质变性程度不同，因此会形成不同特性的凝胶。Matsumoto等[9]发现，诱导蛋白凝胶化至少需要300 MPa的压力并作用10～30 min。Kajiyama等[10]的研究表明，豆浆在500 MPa条件下处理30 min后会从液体变为固体；然而在较短的处理时间（10 min）或较低的压力下，发现豆浆保持液态，但乳化活性和稳定性得到改善。Olsen等[11]在减压后和在24 ℃条件下储存5 h后立即检测β-乳球蛋白的聚集状态和凝胶特性。结果发现施加150 MPa的压力30 min，或施加高于300 MPa的压力30 min，都能导致可溶性聚集体的形成。当持续施压30 min时，450 MPa的压力引起β-乳球蛋白溶液的凝胶化。因此，高静压在诱导不同特性的豌豆球蛋白凝胶方面具有可行性和潜力。

本研究将豌豆7S和11S球蛋白以及二者按照不同比例（质量比分别为1∶2、1∶1、2∶1）混合的蛋白进行高静压作用，设置了100、300、500 MPa 3 个压强水平分别作用10 min以形成凝胶。通过对其外观和微观结构观察、流变特性测量、质构分析以及持水力分析判定其是否形成凝胶和所形成凝胶的结构和特性。通过将凝胶溶解在不同溶剂中确定维持凝胶的主要相互作用力。通过对比不同蛋白形成凝胶的特性分析7S和11S在高静压诱导形成凝胶方面的差异。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

豌豆 山西东方亮生命科技有限公司；正己烷上海泰坦科技股份有限公司；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）电泳液（Tris-Gly，Powder）、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（5×，含巯基乙醇）、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（5×，不含巯基乙醇）、BeyoGel™ Plus PAGE预制胶（Tris-Gly，4%～20%，15 孔）上海碧云天生物技术有限公司；PageRuler预染蛋白Marker 赛默飞世尔科技有限公司；磷酸氢二钾、磷酸二氢钾 国药集团化学试剂有限公司；SDS 北京索莱宝科技有限公司；二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）、5×G250染色液 美国西格玛-奥德里奇公司；2.5%戊二醛 北京酷来搏科技有限公司；除单独说明外，所有其他化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

RCTdigital2.07磁力搅拌器 德国IKA公司；CF16RXII高速冷冻离心机、SU3500扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）日立（中国）有限公司；LGJ-25C冷冻干燥机 北京四环福瑞科仪公司；KN620自动凯氏定氮仪 济南阿尔瓦仪器有限公司；Zetasizer Nano ZS ZEN3700纳米粒度和Zeta电位分析仪英国马尔文公司；FS5荧光分光光度计 英国爱丁堡公司；CQC30L-600高静压设备 北京速原中天科技股份有限公司；DHR-2流变仪 美国TA公司；CT3物性分析仪 美国博勒飞公司。

1.3 方法

1.3.1 豌豆7S、11S球蛋白的提取

参考Diedericks等[12]的方法提取豌豆球蛋白。首先将豌豆磨粉获得生豌豆粉并进行脱脂，自然风干后得到脱脂豌豆粉。

脱脂豌豆粉中加入0.5 mol/L NaCl溶液，料液比为1∶10（g/mL）。室温搅拌1 h后10 000×g离心15 min，收集上清液A。按料液比为1∶5（g/mL）向沉淀中加入0.5 mol/L NaCl溶液，调节pH值到7.8左右后室温搅拌1 h并离心（10 000×g、15 min），收集上清液B。合并上清液A、B，加入冰醋酸调pH 4.8，搅拌30 min后离心。沉淀（11S）研磨后加超纯水溶解并调pH值到7.8后透析，上清液（7S与白蛋白）直接透析，透析条件为4 ℃、48 h。透析完成后11S样品直接冷冻干燥。7S样品离心得到沉淀，加水溶解后调至pH值为7.8再进行冷冻干燥。冷冻干燥后的蛋白研磨成粉末，得到7S、11S蛋白。

1.3.2 蛋白质含量（干基）的测定

蛋白质含量（干基）通过凯氏定氮法测定。

1.3.3 水分含量的测定

水分含量通过烘箱干燥法进行测定。称量玻璃平皿的质量为m1/g，加入一定量的样品粉末，称量总质量为m2/g。105 ℃烘箱干燥至恒质量后称量总质量（m3/g）。按式（1）计算水分质量分数W：

1.3.4 SDS-PAGE

参考Mession等[2]的方法进行SDS-PAGE实验。7S、11S蛋白质粉末分别溶于蒸馏水中，分别与1×SDS上样缓冲液（含β-巯基乙醇）按照1∶1（V/V）混合，或与5×SDS上样缓冲液（不含β-巯基乙醇）按照4∶1（V/V）混合，最终使混合液中的蛋白质量浓度达到2 mg/mL。将预制胶安在架子上，放进电泳槽，加入SDS-PAGE电泳液。向上样孔中分别加入15 μL样品和5 μL的Marker。初始设置电压为70 V，当样品跑到电泳胶的1/5处，加压到130 V，直至样品跑到电泳胶底部结束加压。将凝胶用考马斯亮蓝快速染色液染色，之后用体积分数5%乙酸溶液和体积分数20%乙醇溶液进行脱色，染色后的凝胶用凝胶成像仪拍照分析。

1.3.5 蛋白质溶解度的测定

蛋白质溶解度通过测定可溶性固形物的方法进行测定。取蛋白质粉末样品25 mg，溶于25 mL蒸馏水中，搅拌2 h使其溶解完全。离心取上清液用于烘干。称量玻璃平皿的质量为m4/mg，加入一定体积（V/mL）的蛋白上清液，105 ℃烘箱干燥至恒质量后称量总质量（m5/mg）。按式（2）计算蛋白质溶解度S：

1.3.6 粒径、聚合物分散性指数（polymer dispersity index，PDI）和Zeta电位测定

将10 mg的7S或11S蛋白质粉末溶于1 mL蒸馏水中，离心后将上清液稀释50 倍体积，用于测定粒径、PDI和Zeta电位。通过动态光散射测量可溶性蛋白聚集体的体积加权平均直径。在25 ℃条件下进行测定，并且根据水设定液体黏度和折射率，分别为0.933和1.333。

1.3.7 游离巯基含量测定

游离巯基含量测定参考Ellman方法[13]。将4 mg的5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)（5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）溶于1 mL的Tris甘氨酸缓冲液（pH 8.0）中配制Ellman’s试剂。取15 mg蛋白粉末溶解于含5 mL 8 mol/L UREA（尿素）的上述Tris甘氨酸缓冲液中，向其中加入Ellman’s试剂，于室温条件下反应60 min，以对应的缓冲溶液作为空白对照，用分光光度计测定样品在412 nm波长处的吸光度。样品的游离巯基含量通过式（3）进行计算：

式中：SH为游离巯基含量/（μmol/g）；A412为412 nm波长处的吸光度；C为样品质量浓度/（mg/mL）；D为稀释倍数；73.53＝106/（1.36×104），其中1.36×104为摩尔吸光系数/（L/（mol·cm））。

1.3.8 表面疏水性测定

蛋白的表面疏水性利用荧光探针和荧光分光光度计进行测定。激发波长固定在390 nm，发射光谱记录在430～500 nm之间。荧光探针溶液（8 mmol/L）在磷酸盐缓冲液（10 mmol/L、pH 7.0）中制备，并在黑暗中保存。将30 μL 8 mmol/L的荧光探针溶液添加到6 mL的混合物中，在25 ℃避光静置反应5 min后测定荧光强度。在过量的荧光探针条件下，通过线性回归分析评估蛋白质荧光强度与浓度，线性回归方程的斜率即为表面疏水性。

1.3.9 高静水压力预处理

取1.3.1节制备的7S、11S蛋白，以及二者以不同比例（质量比1∶2、1∶1、2∶1）配比得到的混合蛋白，以质量分数15%溶于蒸馏水中，使用磁力搅拌器进行搅拌，搅拌后用2 mol/L NaOH溶液调至pH 7.0，再继续搅拌3 h后置于4 ℃冰箱过夜，取出继续搅拌4 h后，将蛋白溶液倒入真空包装袋中，用手压式封口机封口。之后将样品分别以100、300 MPa和500 MPa高静压在25 ℃处理10 min。处理的样品置于4 ℃冰箱中过夜，形成的凝胶用于后续实验。

1.3.10 流变特性测定

采用DHR-2流变仪，采用直径为40 mm、夹角为2°的锥板，测量在1%的恒定应变下进行，属于线性黏弹区域，间隙为150 μm，频率扫描范围为0.1～100 rad/s，每个数量级取5 个点。

1.3.11 质地剖面分析（texture profile analysis，TPA）

用物性分析仪进行TPA，TPA是在自立凝胶的基础上进行的，300 MPa时蛋白形成了凝胶，但凝胶结构较弱无法分析。使用TA5探头进行测定，凝胶样品高度为4 mm、长宽为1 cm，测定参数如下：测试速率0.5 mm/s、压缩程度50%、触发值0.5 N。

1.3.12 持水力测定

参考Ayadi等[14]的方法，取5 mL离心管称量其质量，记为m0/g，装入适量凝胶样品，称量样品和离心管总质量，记为m1/g，离心（10 000 r/min、20 min、4 ℃）后倒转排水，称量排水后的样品和离心管的总质量，记为m2/g。按式（4）计算凝胶持水力：

1.3.13 凝胶中的分子相互作用测定

参考Speroni等[15]的方法，将凝胶样品以1∶5（m/m）的比例（确保样品充分溶解）分散在pH 8.0的盐水缓冲液（saline buffer，SB）（0.032 5 mol/L K2HPO4、0.002 6 mol/L KH2PO4和0.4 mol/L NaCl混合液）、SB+10 g/L SDS、SB+6 mol/L UREA和SB+40 mmol/L DTT溶液中，匀浆后反应30 min，离心、取上清液。SB、SB+SDS、SB+UREA组用BCA法测上清液中蛋白浓度，SB+DTT组用考马斯亮蓝法测上清液中蛋白浓度，用凯氏定氮法确定蛋白质量分数，即得到蛋白溶解度，以溶解度判断凝胶中的主要作用力。

1.3.14 SEM观察

参考Wan Yangling等[16]的方法，将样品浸在4 ℃、2.5%戊二醛溶液中24 h，然后用去离子水洗3 次。之后用梯度乙醇溶液对凝胶脱水，并进行干燥。干燥后的样品粘在导电胶上喷金，然后通过场发射SEM使用15 kV的加速电压对样品进行观察。

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 豌豆7S、11S球蛋白的成分分析及表征

通过测定蛋白质、水分含量以及SDS-PAGE对提取的7S和11S蛋白进行成分分析。如表1所示，7S和11S样品中的蛋白质量分数分别为86.34%和93.12%，水分质量分数分别为3.67%和3.34%。7S的粒径为（114.69±0.28）nm、Zeta 电位为（-18.80±0.10）mV，而11 S 粒径高于7 S，为（121.14±1.58）nm，Zeta 电位为（-25.30±0.40）mV，由于在提取两种豌豆球蛋白的过程中存在步骤上的差异，导致7S与11S样品溶于蒸馏水后的pH值、离子强度不同，导致蛋白质分子表面带电基团也有所不同[17]。此外，结果表明11S的游离巯基是7S的2 倍，这是因为11S含有更多的半胱氨酸，提供了更多的游离巯基。vicilin是不含半胱氨酸的7S球蛋白，而convicilin含有一个半胱氨酸。因此7S球蛋白的游离巯基由convicilin提供。表面疏水性方面，7S球蛋白略高于11S球蛋白，这是由于7S和11S在氨基酸组成、疏水性残基的暴露程度方面存在一定差异，7S球蛋白有更多的疏水基团暴露在表面，这为蛋白形成凝胶提供了一定的优势。

表1 豌豆7S、11S球蛋白的蛋白质、水分含量与理化性质表征Table 1 Protein and moisture contents and physicochemical characteristics of pea 7S and 11S globulins

通过SDS-PAGE确定所提取蛋白样品中的7S和11S的种类及纯度。如图1所示，泳道1和2分别为7S、11S的变性非还原态谱带（不含β-巯基乙醇），泳道3和4分别是7S、11S的变性还原态谱带（含β-巯基乙醇）。分子质量54 kDa附近的条带为11S球蛋白的亚基Lαβ，该条带只存在于泳道2中，这是因为在变性非还原电泳中，SDS破坏了亚基之间的疏水键，因此泳道中含有亚基的条带。11S的亚基由一条酸性α链和一条碱性β链通过二硫键连接而成，在泳道4中，由于上样缓冲液中的β-巯基乙醇破坏了亚基中的二硫键，因此亚基解离成了Lα（37 kDa附近）和Lβ（17 kDa附近）两条多肽链，这与前人研究结果[18]相似。在泳道1和3中几乎没有Lαβ、Lα和Lβ的条带，可以说明7S样品几乎不含11S球蛋白。在泳道1中还含有分子质量在50 kDa和35 kDa的条带，它们分别为未裂解的vicilin亚基（Vi1）和裂解后的vicilin亚基（Vi2）[2]。由于vicilin中不含二硫键，因此在含有β-巯基乙醇的环境下没有被还原成多条链的状态，泳道3与泳道1中的条带分布一致。除此之外，还观察到在泳道2和4中含有少量Vi1和Vi2条带，说明11S样品含有少量vicilin杂质。

图1 7S、11S球蛋白的SDS-PAGE图Fig.1 SDS-PAGE analysis of 7S and 11S globulins

2.2 不同高静压诱导7S、11S蛋白形成凝胶的形态观察

观察高静压后的样品形态，根据样品能否形成固体或半固体初步判断蛋白是否形成凝胶。如图2所示，在100 MPa压力诱导下5 组样品均未形成凝胶，因此样品呈现圆形水滴状，但7S-11S混合蛋白（质量比为2∶1）已经具有形成半固体凝胶的趋势。300 MPa的条件下，所有样品中只有11S蛋白没有形成固体或半固体。500 MPa条件下，5 组蛋白均体现出了固体的状态。结果说明随着压强的升高，蛋白逐渐从溶液转变成了凝胶。这是因为高静压可以使蛋白质发生变性，结构展开并暴露内部结构，暴露的基团越多，越有利于三维网络结构的形成。7S和11S之间存在结构上的差异性，因此在形成凝胶的能力上存在不同。由于7S球蛋白中不含有半胱氨酸，没有分子间的二硫键产生，凝胶的形成主要靠氢键维持，因此7S球蛋白形成的凝胶柔性更高，其凝胶化性能更好[19]。当7S与11S混合后，它们的凝胶性能基本上都比单独的7S和11S好，或接近于单独7S的凝胶性能。这可能是因为7S和11S在形成凝胶时发挥的作用不同，7S作为凝胶网络的骨架，而11S因其较低的表面疏水性更容易与水发生结合，所以可以留在网络间隙中拦截水。

图2 不同压力的高静压诱导7S、11S蛋白形成凝胶或非凝胶的形态Fig.2 Gel or non-gel forms of 7S and 11S induced by different high hydrostatic pressures

2.3 高静压诱导7S、11S凝胶的流变性质

通过流变分析评估蛋白是否形成凝胶以及凝胶强度等特性。不同高静压条件下的蛋白质样品在线性黏弹范围内的频率扫描如图3所示。图3A为100 MPa条件下的样品，在此压强下，除了7S-11S混合蛋白（质量比为2∶1），其他各组基本都表现为初始时弹性模量G’值低于黏性模量G”值，后段变为G’值高于G”值，因此样品表现为溶液。图3B显示，在300 MPa的高静压下，所有的蛋白样品在全频率范围内都始终满足G’值高于G”值，说明样品表现为凝胶。当压强升高到500 MPa时，由图3C可以看出，所有样品仍旧表现为凝胶状态，并且G’和G”相对于100、300 MPa条件都有不同程度的升高。总地来说，随着压强的升高，样品逐渐从溶液状态转变为凝胶状态，并且G’和G”逐渐升高。7S/11S混合后形成的凝胶模量高于二者单独形成的凝胶，可能是由于在施压过程中，蛋白质单体的构象发生变化，并在压力释放过程中蛋白亚基发生重排，形成新的聚合，在王苑等[20]的研究中也发现了类似的现象。此外，11S凝胶的G’和G”增大的范围不如其他4 组样品，这说明11S蛋白在高静压条件下可暴露的基团已经过早达到了最高值，并且由于11S球蛋白不易展开的特性，能够暴露并发生相互作用的基团数目也受到限制。

图3 不同压力的高静压诱导的7S、11S凝胶的G’和G”随角频率的变化Fig.3 Changes in G’ and G”of 7S and 11S gels induced by different high hydrostatic pressures as a function of angular frequency

使用1 rad/s时的tanδ和G’值进行样品之间的直接比较（图4）。tanδ为G”与G’的比值，tanδ越小说明凝胶结构越强。100 MPa条件下的所有蛋白样品的tanδ1rad/s都在0.5～1.1之间时，表明为弱相关的浓缩分散体。300 MPa和500 MPa条件下的所有样品tanδ1rad/s都在0.2～0.4之间，表明为较强的凝胶状结构。G’1rad/s可以直接作为凝胶强度的指示值[21]。与频率扫描的流变分析结果一致，随着压强的升高，所有蛋白样品的G’1rad/s都逐渐升高，11S蛋白样品在任何高压下的G’1rad/s都低于其他4 组，混合蛋白样品的G’1rad/s几乎与7S蛋白样品相近或略高。

图4 不同高静压诱导的7S、11S凝胶的tan δ1rad/s（A）与G’1rad/s（B）Fig.4 tan δ1rad/s (A) and G’1rad/s (B) in 7S and 11S gels induced by different high hydrostatic pressures

2.4 高静压诱导7S、11S凝胶的质构特性

TPA是在自立凝胶的基础上进行的，在300 MPa的压强下，虽然蛋白形成了凝胶，但凝胶结构较弱，无法分析。500 MPa的压强下凝胶的TPA结果如表2所示。硬度指凝胶抵抗变形的能力，即断裂所需的最大力[22]。结果显示，5 组样品的硬度之间均具有显著性差异。硬度最大的为7S-11S混合蛋白（质量比为2∶1），剩余样品由大到小排列依次为7S-11S混合蛋白（质量比为1∶1）、7S蛋白、7S-11S混合蛋白（质量比为1∶2）和11S蛋白，11S蛋白凝胶的硬度低至0.06 N。硬度的结果与流变特性的模量之间具有完全一致的对应关系。

表2 500 MPa高静压诱导7S、11S凝胶的质构分析Table 2 Textural analysis of 7S and 11S gels induced by high hydrostatic pressure at 500 MPa

弹性为第一次压缩后恢复的高度，代表了凝胶在被压缩后恢复原来状态的能力[23]。从弹性数据结果来看，11S蛋白凝胶的弹性（-0.08 mm）最差，与其他4 组凝胶之间存在显著性差异。弹性值最大的样品为7S-11S混合蛋白（质量比为2∶1），可能因为11S蛋白对于凝胶网络结构的填充作用，使得凝胶弹性增强。

内聚性为两次循环压缩所做的正功之比，代表了凝胶在外力下保持内部结构的能力[24]。内聚性结果与弹性结果基本一致，即11S凝胶显著低于其他4 组，且为负值。3 组混合蛋白凝胶样品中，随着7S蛋白含量的提高，其内聚性逐渐提高。影响弹性和内聚性的因素主要是凝胶分子之间的交联程度。由此说明，7S凝胶比11S凝胶的交联程度更强。而二者经过混合后的蛋白凝胶比单独的任何一种蛋白形成的凝胶的交联程度都强，说明7S与11S之间的相互结合会更加有利于形成强的凝胶。

咀嚼性是硬度、弹性和内聚性3 种指标的乘积，可以代表凝胶质构特性的整体变化趋势。结果表明，11S蛋白凝胶的咀嚼性显著低于其他4 组蛋白，7S-11S混合蛋白（质量比为2∶1）凝胶的咀嚼性高于其他4 组蛋白。通过TPA可以得到各方面特性都比较弱的凝胶为11S蛋白凝胶，都比较强的为7S-11S混合蛋白（质量比为2∶1）凝胶，TPA的大小趋势与流变特性趋势完全一致。

2.5 高静压诱导7S、11S凝胶的持水力

由于蛋白质的分子间交联和聚集形成的凝胶网络可以拦截水，凝胶的持水力是凝胶保留水分能力的指标[25-27]。持水力受多种因素的影响，包括凝胶孔的大小和蛋白质的物理化学性质，这些因素参与凝胶的形成[28]。具有高持水力的凝胶是保持食品质地的理想选择。图5为各个条件下形成凝胶的持水力。结果显示，随着压强的升高，所有的蛋白质凝胶的持水力均显著提高。这是因为压强诱导蛋白质展开，促进了水结合能力。高静压处理产生的未折叠构象能在柔性网络中的蛋白质基团之间形成连接以捕获水分子。代晓凝等[29]发现当蛋白质变性程度增加、活性基团暴露于分子表面时，形成的凝胶网络结构越致密，使凝胶和水分子结合的能力越强，就可以保持更多的水分子不易流失。此外也可能因为解折叠后产生的新的亲水残基与水发生了结合。300 MPa条件下，持水力基本上随着11S蛋白的占比增大而升高。500 MPa条件下的11S蛋白凝胶的持水力最高，达到100%，与其他4 种蛋白之间具有显著性差异。同时与7S相比，11S可能需要更高的压力才能达到完全变性[30]，因此在相同压力下（500 MPa），11S很难形成较好的网络结构，这也导致了11S凝胶的流变特性模量以及质构特性都为最低。

图5 不同高静压诱导的7S、11S凝胶的持水力Fig.5 Water-holding capacity of 7S and 11S gels induced by different high hydrostatic pressures

2.6 高静压诱导7S、11S形成凝胶的作用力

对500 MPa形成的凝胶用不同的溶剂进行溶解，可以判断维持凝胶三维结构的主要作用力（图6）。SB主要用来提取未结合或通过静电结合的蛋白质。所有的凝胶在SB中都表现出非常低的溶解度（小于30%），这表明大多数蛋白质参与了三维网络的形成。在SB中，7S蛋白凝胶的溶解度最高，11S蛋白的溶解度最低，混合蛋白凝胶中，随着7S蛋白比例的升高，在其中的溶解度越高。

图6 维持高静压（500 MPa）诱导的7S、11S球蛋白凝胶的不同作用力Fig.6 Different forces maintaining high hydrostatic pressure(500 MPa) induced 7S and 11S globulin gels

SDS用于破坏疏水相互作用，因此SDS缓冲液可以用来破坏凝胶中的静电相互作用和疏水相互作用。在该溶液中，所有蛋白凝胶的溶解度都有很大程度的提高。有65%左右的7S蛋白凝胶可以溶于其中，11S蛋白凝胶的溶解度也比SB中的溶解度升高很多，而混合蛋白凝胶的溶解度依旧介于11S和7S蛋白凝胶之间，各种蛋白凝胶之间存在显著性差异。该结果表明，疏水相互作用也是维持凝胶结构的相互作用力，并且发挥很重要的作用。

UREA改变水的结构，允许疏水斑块的水合作用，并且还直接与多肽的极性基团相互作用，因此UREA缓冲液主要通过破坏疏水相互作用和氢键溶解蛋白质[31]。凝胶在UREA缓冲液中的溶解度也有了很大提升，说明氢键也是维持凝胶结构重要的相互作用力。凝胶在SB和SDS缓冲液之间以及在SB和UREA缓冲液之间的差异表明，这些样品中的主要相互作用力是氢键[32]。Li Zhiyu等[31]提出生物聚合物之间的疏水相互作用、氢键以及二硫键是三维网络结构形成的原因，而大分子以及水分子之间的氢键和静电相互作用在凝胶化过程中对基体中自由水的截留起着关键作用。因此可以推断凝胶在500 MPa条件下的持水力高主要是氢键与静电相互作用发挥着作用。

综合凝胶在SB、SDS和UREA中溶解度的结果，可以说明维持凝胶的作用力主要是非共价键。然而之前的研究也曾多次报道，凝胶的主要结构是通过疏水相互作用和二硫键稳定的[33-34]。因此通过探究凝胶在DTT中的溶解度判断二硫键存在的情况。结果显示，相比于SB中的溶解度，DTT中的溶解度仅有略微的上升，说明在凝胶中蛋白质之间存在二硫键。之前的一些研究曾报道过，由于巯基的反应性增加，二硫键在高静压诱导的蛋白质聚集中起重要作用[35]。因此虽然二硫键的数目不多，但由于二硫键作为共价相互作用力，具有更高的键能，因此在维持凝胶结构方面也提供了很大的帮助。

2.7 高静压诱导7S、11S形成凝胶的微观结构

蛋白凝胶在不同压强下形成的溶液或凝胶的SEM图像如图7所示。蛋白聚集体参与了凝胶的网络形成。在100 MPa条件下，所有的蛋白聚集体都呈现连续的网状结构，但孔径较大，聚集体较小，且主要表现为丝状聚集体。说明在该压强下，蛋白有形成凝胶的趋势，但由于聚集体之间的连接不够紧密，结构较为松散，无法在孔隙中拦截水分子，于是便呈现为溶液的状态。

图7 不同高静压诱导的7S、11S凝胶的SEM图像Fig.7 SEM images of 7S and 11S gels induced by different high hydrostatic pressures

当压强升高到300 MPa时，蛋白开始逐渐形成球状聚集体，孔隙也逐渐变小，网络结构变得更加致密。7S凝胶虽然形成了大量的聚集体，但具有较大的孔洞，因此凝胶的结构相对松散，持水力较差。11S蛋白凝胶中含有大量的孔洞，这不利于水分的保持，但聚集体连接紧密，因此相比于7S凝胶具有较好的持水力。

500 MPa时，所有的蛋白均体现为球状聚集体，孔径降为最小，网络结构紧凑且致密。这种致密的网络结构，可以有效地将水保持在体系中，因此能够产生具有理想机械性能的凝胶[36]。11S蛋白凝胶虽然没有形成较大直径的聚集体，但孔径最小，因此有利于与水分子通过氢键或静电相互作用进行紧密的结合，具有最强的持水力。相对于7S蛋白，混合蛋白凝胶的结构更加均匀有序，聚集体大小也保持一致，因此机械性能要比7S蛋白凝胶更加优秀。

3 结论

随着压力从100 MPa升高到500 MPa，豌豆球蛋白逐渐由溶液转变为非自立凝胶，再转变为自立凝胶。蛋白凝胶的G’逐渐升高，质地变强，持水力提高。蛋白结构逐渐由丝状聚集体转变为球状聚集体，网络结构逐渐致密均匀，孔隙逐渐变小。维持高静压诱导豌豆球蛋白凝胶的作用力主要是氢键和疏水相互作用，其次为二硫键和静电相互作用。当7S-11S混合蛋白的质量比为2∶1时，经过500 MPa压力诱导形成的凝胶在流变特性、凝胶刚性、质构特性以及持水力等方面都有显著的提高。因此，7S、11S蛋白按不同比例制备凝胶可以扩大可调控的凝胶强度范围。