荔枝落果中A型低聚原花青素抑制类甜蛋白促炎机制

罗杨合，曾诗蔼，李洛欣，谢 翀，闫景坤，李玉婷，罗英捷，赵 雷,,*

（1.广西康养食品科学与技术重点实验室（贺州学院），广西 贺州 542899；2.华南农业大学食品学院，广东 广州 510642；3.东莞理工学院生命健康技术学院，广东 东莞 523808；4.营家健康科技（广东）有限公司，广东 东莞 523000）

荔枝作为“中华珍品”，是名贵的果品，有食、疗两用之功。但大量食用会引起“上火”症状，如口痒、眼皮肿胀、湿疹、疱疹、喉咙肿痛等[1]，困扰荔枝产业的发展。团队前期研究发现荔枝中引起“上火”的重要原因之一是荔枝类甜蛋白（litchi thaumatin-like protein，LcTLP）导致人体对食物不耐受，从而引起组织发生炎症反应。LcTLP可显著提高RAW264.7细胞中肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）等促炎因子分泌水平[2]，在此基础上，动物实验进一步探明，LcTLP进入胃肠道后未能被充分消化吸收，会导致肠道菌群和结肠代谢物发生变化，通过肠-肝轴引起肝脏炎症[3]，明确了食用荔枝“上火”原因为LcTLP引起的肝脏等组织的炎症反应。

目前，避免食用荔枝引起“上火”的主要方法可通过减少摄入量或利用加工方式（干制或超声处理）破坏LcTLP的炎症反应活性位点[4-5]，但这限制了荔枝鲜果的产业发展。值得注意的是，荔枝皮“性苦寒”，民间有利用荔枝皮浸泡或煮水饮用缓解过量食用荔枝所引起的不良反应的说法。北宋诗人苏轼云“食荔枝多则醉，以壳浸水饮之即解。此即食，物不消，还以本物消之之意”。研究亦发现，荔枝果皮中富含A型原花青素[6]。原花青素作为自然界第二丰富的天然酚类化合物[7]，由不同数量的黄烷-3-醇基本结构单元组成，具有抗氧化[8]、抗癌[9]、抗炎[10]等多种生物活性。相较于B型原花青素，A型原花青素结构上多一个C—O—C键，结构更稳定，其在体内可以发挥更强的生物活性，且聚合度越低，其生物利用度越高。

在自然条件下，荔枝果实从授粉到果实发育成熟的过程中会发生严重的生理落果的现象，平均坐果率仅约4%[11-12]。这可能是果实为了应对生物和非生物胁迫以及营养和激素失衡出现的结果[13]。而且荔枝落果中A型低聚原花青素（A-type oligomeric proanthocyanidins，A-OPC）的种类和含量均远高于熟果皮，是A型原花青素的潜在来源[14]。越来越多的研究证明原花青素是治疗或缓解由脂多糖诱导炎症的有效成分[15-16]，是否能够对LcTLP造成的炎症同样具有较好的抑制效果值得深入探究。因此，本研究对荔枝落果中A型原花青素组分进行了分离提取和结构鉴定，并以LcTLP为促炎介质诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7建立炎症模型，明确其抑制炎症反应的作用机制，为荔枝落果的增值开发和解决荔枝食用不耐受提供新的途径和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

白糖罂荔枝落果由广东茂名市果园提供。LcTLP由实验室制备[2]。

AB-8大孔吸附树脂、儿茶素标准品、表儿茶素标准品、原花青素A1标准品、原花青素A2标准品、原花青素A4标准品、原花青素B1标准品、原花青素B2标准品 上海源叶生物科技有限公司；乙腈（色谱纯）德国默克公司；甲酸（色谱纯）美国Sigma-Aldrich公司；小鼠巨噬细胞系RAW264.7 中国科学院细胞库；DMEM培养基、青霉素、硫酸链霉素 赛默飞世尔科技（中国）有限公司；胎牛血清 美国Gibco公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量试剂盒、细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）上海碧云天生物技术有限公司；NO测定试剂盒 南京建成生物科技有限公司；TNF-α、IL-6酶联免疫吸附检测（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒 欣博盛生物科技有限公司；辣根过氧化物酶标记兔多克隆抗体 美国Cell Signaling Technology公司。其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

E2695高效液相色谱仪 美国Waters公司；6540 UHD Q-TOF型质谱仪、1260 Mini-PROTEA制备液相色谱仪 美国安捷伦科技有限公司；PowerPac Basic电泳仪 美国Bio-Rad公司；SpectraMax i3x多功能酶标仪 奥地利Molecular Devices公司。

1.3 方法

1.3.1 A-OPC的制备

参考Xie Chong等[14]的方法并稍作修改。将荔枝落果粉碎，按料液比1∶10（g/mL）与体积分数70%乙醇溶液混合，于常温条件下采用磁力搅拌提取12 h，过滤，收集滤液，重复此操作4 次，合并提取液。提取液于40 ℃条件下减压浓缩至无醇，采用AB-8大孔吸附树脂吸附浓缩液，用蒸馏水洗去蛋白质和糖等杂质，最后采用体积分数70%乙醇溶液进行洗脱，洗脱液减压浓缩经真空冷冻干燥得到荔枝落果粗提物（crude extract of litchifruitlet，CELF），保存于-20 ℃备用。

采用制备液相色谱仪对CELF中的A-OPC进行分离制备，色谱条件：色谱柱：安捷伦Pursuit Xrs C18柱（250 mm×21.2 mm，10 μm）；检测器：紫外检测器；流动相A：0.4%（体积分数）甲酸水溶液；流动相B：乙腈；流速：20 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：550 μL；检测波长：280 nm。梯度洗脱条件：0～10 min，85%～65% A，15%～35% B；10～25 min，65%～55% A，35%～45% B；25～40 min，55%～40% A，45%～60% B；40～45 min，80% A，20% B。收集13～14 min的馏分，馏分于40 ℃减压浓缩后冻干得到A-OPC，保存于-20 ℃备用。

1.3.2 A-OPC的组分鉴定

参考Wang Kun[5]和何婷[17]等的方法并稍作修改，采用高效液相色谱系统分析。色谱条件：色谱柱：Zorbox SB-C18柱；检测器：紫外检测器；流动相A：0.4%甲酸水溶液；流动相B：乙腈；流速：0.7 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：10 μL，检测波长：280 nm。梯度洗脱条件如下：0～10 min，83%～80% A，17%～20% B；10～12 min，80% A，20% B；12～15 min，80%～77% A，20%～23% B；15～22 min，77% A，23% B；22～25 min，77%～50% A，23%～50% B；25～30 min，50%～45% A，50%～55% B；30～32 min，45%～20% A，55%～80% B；32～35 min，20%～83% A，80%～17% B。

采用高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱（high performance liquid chromatography-quadrupole time-offlight tandem mass spectrometry，HPLC-Q-TOF-MS/MS）系统对样品进行电喷雾离子源（electrospray ionization，ESI）负离子分析，流动相和洗脱条件与高效液相色谱分析相同。质谱使用ESI在以下条件下收集：测定范围：m/z100～1 700；毛细管电压：3 500 V；气体流速：9 L/min；碰撞能量：500 psig。

通过与标准品保留时间的比较，对原花青素的峰进行定性定量分析，标准品包括儿茶素、表儿茶素、原花青素B1、原花青素B2、原花青素A1、原花青素A2、原花青素A4。样品中A型原花青素二聚体、三聚体和四聚体均以原花青素A2含量表示。原花青素的纯度按下式进行计算：

式中：m为总酚或原花青素的含量/mg；M为测定所用原料的质量/mg。

1.3.3 细胞培养与活性测定

小鼠RAW264.7巨噬细胞采用DMEM完全培养基（含10%（体积分数）胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL硫酸链霉素）于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养，取对数生长期细胞用于实验。采用CCK-8测定A-OPC对细胞活性的影响。将细胞以每孔200 μL、密度为5×105个/mL接种于96 孔板，并在培养箱中孵育24 h。移除培养基后分别添加含LcTLP（0.1 μg/mL）和含不同质量浓度A-OPC（10、30、60、90、120、150、200 μg/mL）的培养基，孵育24 h。根据CCK-8说明书进行活性测定。

1.3.4 LcTLP诱导细胞炎症模型的建立

参考Chen Huifang等[2]方法制备LcTLP并建立RAW264.7巨噬细胞炎症模型。将细胞以每孔1 mL、密度为5×105个/mL接种于24 孔板，孵育24 h，移除培养基。按实验分组添加相应培养基，孵育24 h后用于指标测定。其中，空白组：不含样品和LcTLP的培养基；炎症模型组：含LcTLP（100 ng/mL）的培养基；样品组：含不同质量浓度的A-OPC（60、90、120 μg/mL）及LcTLP（0.1 μg/mL）的培养基。

1.3.5 炎症因子及NO分泌量的测定

收集1.3.4节中细胞上清液。根据NO试剂盒说明书测定NO分泌量，采用ELISA试剂盒测定上清液中促炎因子IL-6和TNF-α含量。

1.3.6 蛋白表达量的测定

参考Zeng Shi’ai等[4]方法进行测定。将细胞以密度为5×105个/mL接种于6 孔板中，每孔2 mL，经不同实验组处理后，于冰上将细胞裂解15 min，收集细胞裂解液。采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白质浓度。统一蛋白质浓度后，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后转移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene difluoride，PVDF）膜，Tris含吐温-20缓冲盐溶液（Tris-buffered saline and Tween 20，TBST）洗膜5 min后用5%脱脂奶粉封闭90 min。用TBST洗去脱脂奶粉，将PVDF膜浸泡于一抗中，于4 ℃孵育过夜，TBST洗膜。再将PVDF膜浸泡于二抗中，于37 ℃孵育60 min，TBST洗膜。将PVDF膜浸泡于显色液中1 min，用Amersham Imager 600凝胶成像显影，采集蛋白条带图片。用Photoshop 2020软件采集蛋白条带灰度值并分析处理。

1.4 数据处理与分析

所有数据均采用IBM SPSS Statistics Version 20.0进行处理，Origin 2021作图，数据以表示。采用单因素方差分析进行统计分析，并使用Tukey’s事后检验确定均值之间的差异，P＜0.05视为具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 荔枝落果中A-OPC分离纯化及结构鉴定

图1是不同生长阶段荔枝落果（白糖罂）和成熟果实照片。前期研究发现第三批次落果体积大、总量多且A-OPC含量最高，选取第三批次荔枝生理落落为原料作进一步研究。落果经粉碎、大孔树脂吸附洗脱和70%乙醇溶液提取后，得到CELF，采用HPLC-Q-TOF-MS/MS对CELF进行ESI负离子分析，液相色谱图如图2a所示，样品分离出3 个大峰和6 个小峰，其中4 min的色谱峰为溶剂峰。根据原花青素的裂解方式共鉴定出13 种原花青素（表1），其中包含2 个单体、6 个二聚体、4 个三聚体和1 个四聚体，仅有2 个B型二聚体，其余全为A型原花青素。Gong Yihui等[18]对荔枝果皮中原花青素鉴定后也发现以A型为主。CELF中13.74 min的色谱峰具有相对较高的峰面积且均为A-OPC（原花青素A2和A型四聚体），为进一步获取高纯度的A-OPC，对CELF中保留时间在13～14 min的化合物利用制备液相色谱仪收集，采用HPLC和LC-Q-TOF MS/MS对其进行鉴定。结果如图2c和表2所示，A-OPC中含两个峰，A-OPC-1为原花青素A2、A型三聚体和A型四聚体，A-OPC-2为A型三聚体，计算可得A-OPC总纯度可达到88.69%。Li Shuyi等[19-20]虽然在荔枝果皮中提取的低聚原花青素含量可达提取物的89.60%，但是A型原花青素在低聚物中约占41.70%。值得注意的是，原花青素的活性和生物利用度往往受其聚合程度和结构的影响，A型原花青素相较于B型原花青素在结构上多一个C—O—C键，这一个额外的连接键使其形成一个更加稳固的3D形状，使A型原花青素更易于与生物大分子发生相互作用而产生生物活性。A型原花青素相较于B型原花青素更容易被人体吸收，且聚合度越低，生物利用度越高[21]。因此，荔枝果皮泡水的“下火”功效可能得益于A-OPC特有的药物动力学特性和功能特性，A-OPC的抗炎活性值得进一步探究。

表1 CELF中原花青素成分Table 1 Characterization of proanthocyanidins in CELF

表2 A-OPC中化合物的主要质谱数据Table 2 Primary mass spectral data of compounds in A-OPC

图1 不同生长时期白糖罂荔枝落果及成熟荔枝图片Fig.1 Pictures of developing and ripe litchi fruits

图2 CELF（a）、原花青素混合标准品（b）和A-OPC（c）的高效液相色谱图Fig.2 High performance liquid chromatograms of crude extract of litchi fruits (a),mixed standard of proanthocyanidins (b) and A-OPC (c)

2.2 A-OPC对LcTLP诱导的RAW264.7细胞NO分泌量的影响

进一步探讨以制备液相分离得到的A-OPC 对LcTLP诱导的巨噬细胞炎症的抑制作用。通过CCK-8法测定A-OPC对RAW264.7细胞活力的影响，结果如图3所示。与空白组相比，在10～200 μg/mL质量浓度范围内，A-OPC对RAW264.7细胞活力无显著性影响（P＞0.05），后续实验A-OPC质量浓度选定为60、90、120 μg/mL。

图3 A-OPC对RAW264.7细胞活力的影响Fig.3 Effect of A-OPC on the viability of RAW264.7 cells

图4是A-OPC对RAW264.7巨噬细胞NO分泌量的影响。在0.1 μg/mL LcTLP作用下，细胞分泌NO上升至32.73 μmol/L，为空白组6.22 倍，说明细胞促炎模型建立成功。与模型组相比，添加A-OPC对NO的分泌抑制呈现出剂量依赖性。在60、90、120 μg/mL条件下，对NO的抑制率分别为7.31%、45.61%和58.38%。NO是一种重要的炎症介质，可由活化的巨噬细胞产生。过量的NO不仅具有细胞毒性，同时能够激活核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信号通路导致促炎因子分泌增多，从而导致炎症反应的发生[4]。因此，添加A-OPC后可以抑制NO的分泌，初步得到A-OPC可以抑制LcTLP引起的炎症反应。

图4 A-OPC对RAW264.7细胞NO分泌量的影响Fig.4 Effect of A-OPC on NO secretion in RAW264.7 cells

2.3 A-OPC对LcTLP诱导的RAW264.7细胞炎症因子分泌量的影响

图5为A-OPC对RAW264.7细胞炎症因子分泌量的影响，与A-OPC对NO的抑制效果相似，A-OPC的添加抑制了LcTLP诱导的RAW264.7细胞因子IL-6和TNF-α的分泌。在60、90 μg/mL和120 μg/mL质量浓度下，A-OPC对IL-6的抑制率分别为6.25%、17.26%、39.80%，呈现出剂量依赖性。在60 μg/mL质量浓度下，A-OPC即可显著降低TNF-α分泌量至451.43 pg/mL（P＜0.01），抑制率达到92.78%，继续增加A-OPC质量浓度，TNF-α的分泌量无显著变化，在120 μg/mL质量浓度下抑制率为86.31%，说明在60 μg/mL质量浓度下，A-OPC对TNF-α的分泌抑制已达最佳。炎症因子IL-6和TNF-α为促炎因子，其分泌量的降低被认为是巨噬细胞炎症消失的重要因素[22]。Xie Chong等[14]发现荔枝果皮中原花青素三聚体的含量与抗炎活性显著相关。Dudek等[23]从花生皮中分离得到的A型原花青素三聚体和四聚体在50 μg/mL条件下能有效抑制LPS诱导的TNF-α分泌。Han Shan[16]和Wang Qinqin[24]等研究发现原花青素A1和原花青素A2均能显著降低LPS诱导的RAW264.7细胞中促炎细胞因子的产生。因此，A-OPC中含原花青素A2、A型原花青素三聚体，作为主要的抗炎物质，表现出显著的抗炎活性，并显著减少了促炎细胞因子的分泌。

图5 A-OPC对RAW264.7细胞炎症因子分泌量的影响Fig.5 Effect of A-OPC on secretion of inflammatory cytokines in RAW264.7 cells

2.4 A-OPC对LcTLP诱导的RAW264.7细胞一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）及环氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）蛋白表达量的影响

COX-2和iNOS被认为是炎症反应中的关键酶[25]。图6为A-OPC对LcTLP诱导的RAW264.7细胞iNOS及COX-2蛋白表达量的影响。细胞经LcTLP孵育24 h后，COX-2和iNOS表达量大幅度增加，添加A-OPC后对LcTLP刺激产生的COX-2和iNOS具有抑制效果，在60 μg/mL质量浓度下，A-OPC即可显著降低iNOS的表达量至0.607（P＜0.01），但在90 μg/mL质量浓度下才对COX-2的表达具有显著抑制效果（P＜0.01），进一步提高A-OPC浓度表现出剂量依赖性。iNOS是巨噬细胞用于产生NO的酶，能催化L-精氨酸转化为NO和L-瓜氨酸[26]。而细胞受到促炎物质刺激后，会在转录水平上调控COX-2，通过激活丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和NF-κB通路，最终促进COX-2基因的转录。原花青素可通过多种方式抑制COX-2，包括通过COX-2基因转录、COX-2蛋白表达和COX-2酶活性[27]。结果表明A-OPC发挥抗炎效果是通过抑制上游关键酶COX-2和iNOS的表达实现，其抑制路径需要进一步探究。

图6 A-OPC对RAW264.7细胞iNOS和COX-2蛋白表达量的影响Fig.6 Effect of A-OPC on protein expression of iNOS and COX-2 in RAW264.7 cells

2.5 A-OPC对LcTLP-诱导的RAW264.7细胞NF-κB/MAPK通路的影响

抑制NF-κB和MAPK信号通路的激活是炎症性疾病的重要治疗策略。为进一步探讨A-OPC对LcTLP诱导的细胞炎症的抑制机制，探究了A-OPC对NF-κB通路上游激酶p65和NF-κB抑制蛋白（inhibitor of NF-κB，IκBα）磷酸化水平的影响。如图7所示，炎症模型组（添加0.1 μg/mL LcTLP）显著提高了p-p65/p65和p-IκBα/IκBα的表达，说明LcTLP引起炎症的主要原因是MAPK和NF-κB通路所介导的[4]。然而，添加A-OPC可抑制这种作用来减少磷酸化水平，在60、90、120 μg/mL时，p65的磷酸化水平下调27.85%、74.94%和96.71%。不同的是，A-OPC在60～90 μg/mL时对IκBα的磷酸化无明显抑制效果，而在120 μg/mL时才表现出明显抑制作用，下调37.07%。NF-κB被认为是一种关键的促炎信号通路，因为它在许多促炎基因（如细胞因子、趋化因子和黏附分子）的表达中起作用。转录因子NF-κB由5 个亚基（p65、RelB、c-Rel、p52和p50）组成，其中，p65亚基被认为是最重要的一个，可以在许多位点磷酸化[28]。在其非活性形式中，NF-κB通过与抑制剂蛋白IκB-α结合而存在于细胞质中。在LPS和TNF-α等外部刺激的激活下，IκB被磷酸化和降解，导致NF-κB易位到细胞核。核易位后，NF-κB亚基p65的磷酸化增强了各种促炎基因的转录。因此，A-OPC可能通过抑制p65和IκB-α亚基的磷酸化和核易位减少促炎基因的转录。

图7 A-OPC对NF-κB通路上游激酶磷酸化水平的影响Fig.7 Effect of A-OPC on phosphorylation of upstream kinases in the NF-κB signaling pathway

MAPK通路蛋白的磷酸化被认为是激活巨噬细胞中NO和促炎细胞因子产生的关键因素，MAPKs在NF-κB的激活中发挥关键作用[29]。图8展示了A-OPC对MAPK通路上游激酶细胞外信号调节蛋白激酶（extracellular regulating kinase，ERK）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和p38磷酸化水平的影响。LcTLP刺激后对JNK、ERK以及p38磷酸化显著升高，加入A-OPC后以剂量依赖性方式还原JNK、ERK以及p38的磷酸化蛋白。在120 μg/mL下，JNK、p38和ERK磷酸化程度分别比模型组降低了29.05%、73.28%和21.84%。这些结果表明，A-OPC可显著降低LcTLP诱导的MAPK和NF-κB通路蛋白表达的磷酸化水平。Harbeoui等[30]发现，富含原花青素的葡萄籽提取物能够下调NF-κB和MAPK通路，对LPS诱导的炎症具有抑制的效果。因此，荔枝落果中A-OPC可通过MAPK和NF-κB通路对LcTLP诱导的炎症产生抑制效果。

图8 A-OPC对MAPKs通路上游激酶磷酸化水平的影响Fig.8 Effect of A-OPC on phosphorylation of upstream kinases in the MAPK signaling pathway

3 结论

本研究从荔枝落果中分离纯化获得纯化物A-OPC，并对其结构鉴定主要成分为原花青素A2、2 个A型原花青素三聚体和1 个A型原花青素四聚体，计算其A-OPC总纯度可达到88.69%。细胞实验表明，A-OPC能有效抑制LcTLP引起的炎症反应，通过下调COX-2和iNOS的表达抑制RAW264.7分泌NO，并抑制促炎细胞因子IL-6和TNF-α的分泌。进一步阐明A-OPC抑制LcTLP的抗炎活性的机制，A-OPC可显著降低LcTLP诱导的NF-κB和MAPK通路上游激酶p65、IκBα、ERK、JNK和p38表达的磷酸化水平，从而达到抑制作用。综上所述，荔枝落果富含A-OPC，能够有效缓解LcTLP诱导的细胞炎症，可作为一种升级再造的农业副产物原料用于解决荔枝及其相关产品的不耐受问题，从而为减少荔枝食用不良反应的发生提供了一种潜在的策略。