暗褐脉柄牛肝菌子实体多糖的分离纯化、结构表征及体外降血糖活性

潘章超，张人谕，黎欢昶，曾念开，王 勇

（热带药物创新与转化教育部工程研究中心，人机智能协同肿瘤精准诊疗国际联合研究中心，海南省热带药用植物研究开发重点实验室，海南医学院药学院，海南 海口 571199）

糖尿病是一种以胰岛素分泌不足或自身无法正常使用胰岛素控制血糖水平为特征的疾病[1]。临床上糖尿病通常可以分为1型糖尿病、2型糖尿病和妊娠糖尿病，其中2型糖尿病占糖尿病患者总人数的90%以上[2]。我国糖尿病患者人数已超过1.14亿，据国际糖尿病联盟预测，到2030年，这一数值将达到3.66亿[3-4]。糖尿病的经久不愈容易对各种器官造成危害甚至引发一系列并发症，如房颤[5]、动脉粥样硬化、高血压[6]、糖尿病肾病和糖尿病视网膜病变[7]等，已经严重危害着人们的身体健康。目前口服降糖药和注射胰岛素是治疗2型糖尿病的主要方法，但其药物都存在一定的不良反应。因此开发一种安全、有效和副作用小的降血糖药物至关重要。

天然来源多糖因其具有降血糖[8-9]、抗氧化[10]、免疫调节[11]和抗炎[6-12]等作用引起越来越多人的关注。文丹等[13]采用水提取法得到麦冬多糖的粗提物，通过自由基清除实验证明了麦冬多糖在体外具有很好的抗氧化效果；在体内H2O2诱导的NIH/3T3细胞损伤模型中，麦冬多糖的预处理可以很好地降低NIH/3T3细胞的死亡率、单线态氧的产生和炎症因子的表达量，进一步证明了麦冬多糖在细胞体内的抗氧化效果；最后在葡萄糖苷酶活性实验中，麦冬多糖对葡萄糖苷酶具有呈浓度依赖性的抑制作用。因此，从天然产物中制备多糖，开发新型、安全、高效的降血糖药物已成为该领域的研究热点。

暗褐脉柄牛肝菌（Phlebopus portentosus(Berk.&Broome) Boedijn）又名暗褐网柄牛肝菌，俗称“黑牛肝菌”，为小牛肝菌科（Boletinellaceae）、脉柄牛肝菌属（Phlebopus）真菌[14-16]。该种主要分布在中国海南、云南和广西等地区[17]。暗褐脉柄牛肝菌个体肥美，富含多种矿物质，是高蛋白、低脂肪、备受公众喜爱的食用菌，同时具有较好的药用价值[18]，具有清热解烦、补虚提神、疏筋活血等功效[19]。现代药理研究表明真菌多糖具有显著的免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、抗菌、抗炎、降血脂等生物学活性[20-22]。Karnchanatat等[23]利用水提醇沉法得到多糖蛋白质复合物，经分离纯化后，获得大量的多糖片段PPC-P11，实验表明PPC-P11具有很强的抗氧化能力。当前，暗褐脉柄牛肝菌多糖的体外降血糖活性的研究较少，有待对其进行深入研究。本研究首先获得暗褐脉柄牛肝菌粗多糖，并对其进一步分离纯化得到纯化多糖组分，通过紫外光谱、红外光谱、核磁共振和扫描电子显微镜等对纯化多糖进行初步结构表征，通过α-葡萄糖苷酶抑制实验筛选活性最好的组分，并阐明其降血糖活性及机制，为暗褐脉柄牛肝菌降血糖相关医药产品的研发和生产提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

暗褐脉柄牛肝菌子实体购自云南西双版纳傣族自治州，由海南医学院药学院曾念开教授鉴定为小牛肝菌科脉柄牛肝菌属真菌暗褐脉柄牛肝菌（Phlebopus portentosus）的子实体。

DEAE-52纤维素 浙江联硕生物科技有限公司；日本三菱化学大孔吸附树脂（HP 20、HP 2MGL、SP 825、SP 850）上海摩速科学器材有限公司；4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl-alpha-Dglucopyranoside，PNPG）、α-葡萄糖苷酶（10 U/mg）、阿卡波糖、牛血清白蛋白、丙烯葡聚糖凝胶S-400HR 上海源叶生物科技有限公司；对硝基苯酚（4-nitrophenol，PNP）百灵威科技有限公司；D2O上海麦克林生化科技有限公司；溴化钾（光谱纯）天津市大茂化学试剂厂；考马斯亮蓝 伯乐生命医学产品（上海）有限公司；其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

T6新世纪紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；Spectra Max 190全波长酶标仪 上海美谷分子仪器有限公司；RE-3000A旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；CBS-A程控全自动部分收集器 上海沪西仪器厂有限公司；HH-4数显恒温水浴锅 金坛区西城新瑞仪器厂；JNM-ECZ400S/L1核磁共振波谱仪日本电子株式会社；1100高效液相色谱仪 美国安捷伦公司；1525高效液相色谱仪 沃特世科技（上海）有限公司；Nicolet iS5红外光谱仪 美国赛默飞世尔科技有限公司；Quanta FEG250场发射扫描电子显微镜 美国FEI公司。

1.3 方法

1.3.1 暗褐脉柄牛肝菌粗多糖的提取

称取暗褐脉柄牛肝菌子实体粉末100 g，加体积分数95%乙醇溶液1 000 mL，置于超声波提取器中超声30 min（40 ℃）；离心（4 000 r/min、10 min），保留沉淀；沉淀加入1 000 mL去离子水，在80 ℃的水浴锅内浸提2 h，过滤，保留滤液，滤渣加入1 000 mL去离子水在同条件下继续提取，重复提取4 次，合并4 次滤液，将上清液浓缩；在浓缩液中缓慢加入4 倍体积的体积分数95%乙醇溶液进行沉淀，并在4 ℃静置24 h；离心（4 000 r/min、10 min）得到沉淀，沉淀加200 mL去离子水溶解；加入200 mL的Sevag试剂（氯仿∶正丁醇＝4∶1，V/V）进行萃取，去除蛋白质，保留上清液，重复此过程3 次。

1.3.2 大孔树脂的筛选及脱色

对HP 2MGL、HP 20、SP 850、SP 825 4 种型号的大孔树脂进行筛选，测定多糖脱色前后的吸光度，分别记为A前和A后，按式（1）计算脱色率，脱色前后蛋白质量分别记为M前和M后，按式（2）计算脱蛋白率，脱色前后多糖质量分别记为m前和m后，按式（3）计算多糖保留率，按照多糖保留率50%、脱色率30%、脱蛋白率20%进行加权，再选择合适的大孔吸附树脂进行脱色。将上清液置于烧杯中，加入体积分数6%的经筛选出的最优大孔树脂进行搅拌脱色[24]；脱色后得到的溶液加入4 倍体积95%乙醇溶液进行沉淀，静置过夜，离心，沉淀冷冻干燥得暗褐脉柄牛肝菌子实体粗多糖。

1.3.3 暗褐脉柄牛肝菌多糖的分离纯化

称取1.5 g暗褐脉柄牛肝菌粗多糖粉末，溶解至10 mL去离子水中，分装至2 mL离心管中，离心，保留上清液；在已处理好的DEAE-52纤维素色谱柱中加入粗多糖溶液，分别用蒸馏水、NaCl溶液（0.1、0.2、0.4 mol/L）洗脱，用苯酚-浓硫酸法[25]检测多糖含量，得到暗褐脉柄牛肝菌子实体纯化多糖含量梯度曲线；将各级洗脱液浓缩、透析和冷冻干燥48 h；对含量较高的洗脱组分进行丙烯葡聚糖凝胶S-400HR二次分级纯化，冷冻干燥即得到暗褐脉柄牛肝菌子实体纯化多糖。

1.3.4 多糖质量分数的测定

精密称取烘干至恒质量的葡萄糖对照品10 mg于100 mL容量瓶中，加蒸馏水溶解并定容至刻度，配成质量浓度为0.1 mg/mL的葡萄糖溶液备用。移取0.1 mg/mL葡萄糖对照品溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL分别置于10 mL具塞试管中，分别加蒸馏水补至2.0 mL。在试管中加入质量分数6%苯酚溶液1.0 mL后再快速加浓硫酸5.0 mL，混匀静置10 min，于沸水浴内加热15 min，然后取出快速冷却至室温。在490 nm处测吸光度，以葡萄糖质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

配制0.1 mg/mL的暗褐脉柄牛肝菌多糖溶液，吸取0.1 mL，用蒸馏水补至2.0 mL，同对照品方法操作，最后在490 nm处测吸光度，代入标准曲线换算即可求得多糖质量分数。

1.3.5 蛋白质量分数的测定

称取10 mg牛血清白蛋白于100 mL容量瓶中定容至刻度线，配制成0.1 mg/mL牛血清白蛋白标准溶液。精确称取0.020 1 g的考马斯亮蓝G-250溶于10.0 mL体积分数为95%的乙醇溶液中，加入20.0 mL 85%的浓H3PO4溶液，用蒸馏水定容至200 mL，经双层滤纸过滤后得考马斯亮蓝溶液，避光保存备用。分别吸取0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL牛血清白蛋白标准溶液，依次加入纯水补至1 mL，再加入5.0 mL考马斯亮蓝备用液，静置15 min，在595 nm处测定吸光度，根据数据绘图，得到标准曲线。

取1 mg/mL多糖溶液1 mL，同牛血清白蛋白方法操作，最后在595 nm处测吸光度，代入标准曲线换算即可求得蛋白质量分数。

1.3.6 分子质量的测定

采用水相凝胶渗透色谱法测定多糖的分子质量，色谱条件：示差折光检测器；色谱柱（PL aquqgel-OH MIXED 8 μm；7.8 mm×30 cm）；柱温30 ℃；流动相为0.2 mol/L NaNO3和NaH2PO4混合溶液（pH 7）；流速1 mL/min，进样量10 μL，进行不同相对分子质量的葡聚糖标准品（1×103～1×105）和样品分析。通过Breeze软件进行数据分析，最后确定该多糖的平均分子质量。

1.3.7 单糖组成的测定

称取10 mg（精确到0.1 mg）多糖样品于20 mL的钳口瓶中，加入5 mL的2 mol/L三氟乙酸溶液，充N2封管（10 L/min、1 min），100 ℃烘箱中水解2 h；冷却后打开盖，取1 mL加入1 mL甲醇后，70 ℃水浴下用N2吹干，加入1 mL 0.3 mol/L NaOH溶液。分别取400 μL的混合单糖标准液或多糖水解液于5 mL的具塞试管中，加400 μL PMP甲醇溶液，于70 ℃水浴中反应2 h；加400 μL 0.3 mol/L的HCl溶液中和（pH 6～7）；加水1 200 μL，再加等体积的氯仿，涡旋混匀振摇，静置，弃去氯仿相，萃取2 次。将水相用0.45 μm微孔膜（水系）过滤后供高效液相色谱仪进样分析。色谱条件：色谱柱C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相A：90 mmol/L磷酸钠缓冲液（pH 7.8）；流动相B：乙腈；检测波长：250 nm；柱温：30 ℃；流速：1 mL/min；进样体积：10 μL；梯度洗脱条件：0～9 min，86% A、14% B；9～28 min，83% A、17% B；28～29 min，78% A、22% B；29～32 min，50% A、50% B；32～36 min，86% A、14% B。

1.3.8 紫外光谱分析

取暗褐脉柄牛肝菌粗多糖10 mg，置10 mL容量瓶中定容，在200～400 nm范围进行扫描测定[26]。

1.3.9 红外光谱分析

取暗褐脉柄牛肝菌粗多糖2 mg加入0.2 g KBr固体混合研磨均匀，取约80 mg压片，在4 000～400 cm-1范围进行红外光谱测定[27]。

1.3.10 核磁共振分析

称取暗褐脉柄牛肝菌粗多糖10 mg溶于0.6 mL D2O中，溶解后转移至核磁管，密封。在核磁共振波谱仪上进行1H-NMR和13C-NMR测定[28]。

1.3.11 扫描电子显微镜观察

取少量多糖粉末直接粘到导电胶上后喷金，在10 kV加速电压下，分别在500、1 000 倍和2 000 倍条件下采用Quanta FEG250场发射扫描电子显微镜观察并记录样品的微观形态。

1.3.12α-葡萄糖苷酶抑制率测定

精密称取暗褐脉柄牛肝菌多糖样品1 0 m g，用4 mL 0.01mol/L的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）溶解，得到2.5 mg/mL的暗褐脉柄牛肝菌子实体多糖溶液，并将其分别稀释成质量浓度为0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL的多糖溶液。

参考文献[29]方法，并作适当改进。暗褐脉柄牛肝菌子实体多糖样品组：吸取不同质量浓度的多糖溶液40 μL于96 孔板中，加入30 μL的α-葡萄糖苷酶（0.2 U/mL），轻晃混匀，在37 ℃的生化培养箱中孵育10 min，然后加入30 μL的PNPG溶液（0.5 mmol/L），在37 ℃的生化培养箱中孵育20 min，最终每孔加入50 μL的碳酸钠溶液（0.5 mol/L）终止反应，5 min后用酶标仪在405 nm处测定其吸光度。样品对照组：将上述步骤中的“加入30 μL的α-葡萄糖苷酶（0.2 U/mL）”改为“加入30 μL的PBS”，其余步骤相同。空白对照组：用等量的PBS溶液代替多糖溶液，其余步骤相同。用阿卡波糖溶液作为阳性对照，每个样品做3 次平行实验。

α-葡萄糖苷酶抑制率计算如式（4）所示：

式中：A0为空白对照组吸光度；A1为多糖样品组吸光度；A2为样品对照组吸度。

1.3.13α-葡萄糖苷酶抑制机理的确定

参考文献[30]方法，并稍作修改。在固定底物浓度的条件下，改变酶的用量，测定不同质量浓度的多糖组分对α-葡萄糖苷酶抑制率的影响。取40 μL不同质量浓度的多糖（0、2、4 mg/mL），每个质量浓度分别加入0.2 U/mL的α-葡萄糖苷酶液30、60、90、120 μL，30 μL 0.5 mmol/L的PNPG为底物，按1.3.12节方法测定，利用酶标仪在405 nm处测定吸光度。以酶用量（横坐标）对应反应速率（纵坐标）作图，由此图反映α-葡萄糖苷酶经暗褐脉柄牛肝菌多糖组分作用后剩余的酶活力与加入酶量间的关系。并根据动力学分析，判断是可逆抑制还是不可逆抑制。

1.3.14α-葡萄糖苷酶抑制动力学

依次向试管中加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的PNP溶液（0.5 mmol/L），再加入0.5 mol/L的碳酸钠溶液至2.31 mL，以蒸馏水为空白对照，利用酶标仪在405 nm处测定吸光度；以PNP的体积为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制线性回归方程，得到PNP标准曲线。

参考文献[31]方法，并稍作修改。在固定酶浓度为0.2 U/mL的条件下，改变加入底物PNPG的浓度，测定暗褐脉柄牛肝菌子实体多糖对α-葡萄糖苷酶活力的影响。方法同1.3.12节，改变底物PNPG浓度为0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 mmol/L。以酶反应的初速度对底物浓度作图，通过Lineweaver-Burk双倒数方程作图，并判断抑制类型。

1.4 数据处理及分析

采用Excel和GraphPad 8.0.2软件处理数据，用表示结果，采用Origin 2021软件作图，其中P＜0.05代表具有显著差异。

2 结果与分析

2.1 暗褐脉柄牛肝菌多糖的提取结果

100 g暗褐脉柄牛肝菌粉末经水提醇沉得到暗褐脉柄牛肝菌粗多糖8.9 g，得率为8.9%。以标准葡萄糖为对照品绘制标准曲线，得到拟合方程为Y＝12.425X-0.036 7（R2＝0.999 8），计算得到粗多糖中多糖的质量分数为44.13%。以牛血清白蛋白为对照品绘制标准曲线，得到拟合方程为Y＝7.775X+0.062 9（R2＝0.999 8），计算得到粗多糖中的蛋白质量分数为51.4%。

2.2 4 种大孔树脂的筛选结果

如表1所示，HP 2MGL具有较高的多糖保留率，但脱色率较差，仅41.82%，而SP 825的脱色率最好，其也具有较高的多糖保留率，综合加权平均结果分析，SP 825型大孔树脂最适用于暗褐脉柄牛肝菌多糖提取液的脱色并用于后续实验。

表1 4 种树脂对暗褐脉柄牛肝菌多糖的脱色实验结果Table 1 Decolorization efficiencies of four types of resin for the crude polysaccharide from P.portentosus

2.3 暗褐脉柄牛肝菌多糖的分离纯化结果

如图1所示，通过DEAE-52纤维素柱色谱后，获得了3 个明显的洗脱峰。其中，蒸馏水洗脱峰与NaCl（0.1 mol/L）的洗脱峰面积比较大，含量相对较多，合并洗脱液，经透析、冷冻干燥后得3 种暗褐脉柄牛肝菌纯化多糖组分粉末：PPP-0、PPP-1、PPP-2，其中PPP-0含量最高，PPP-2含量最低。由于另外两个组分较少且不易收集，因此只将PPP-0收集后进行下一步分离纯化。PPP-0经Sephacryl凝胶S-400HR柱分离纯化后得到单一对称的吸收峰见图2，证明PPP-0均一性良好，将洗脱液收集冻干得絮状组分PPP-0。

图1 暗褐脉柄牛肝菌多糖的DEAE-52纤维素色谱洗脱曲线Fig.1 Elution curves of polysaccharides from P.portentosus by DEAE-52 cellulose column chromatography

图2 图1中PPP-0的丙烯葡聚糖凝胶S-400HR柱层析洗脱曲线Fig.2 Elution curve of PPP-0 shown in Fig.1 by Sephacryl S-400HR column chromatography

2.4 分子质量

表2为暗褐脉柄牛肝菌多糖（PPP-0）分子质量表，图3为暗褐脉柄牛肝菌多糖的分子质量测定色谱图，暗褐脉柄牛肝菌多糖的水相凝胶渗透色谱洗脱曲线只有一个峰，重均分子质量为31 059 Da，说明多糖组分均一。

图3 暗褐脉柄牛肝菌多糖的凝胶渗透色谱图Fig.3 Gel permeation chromatogram of PPP-0

表2 暗褐脉柄牛肝菌多糖的分子质量Table 2 Molecular mass of PPP-0

2.5 单糖组成

如图4所示，与13 种单糖混合对照品标准图谱进行对比，暗褐脉柄牛肝菌多糖由4 种单糖组成，分别为甘露糖Man、葡萄糖Glc、半乳糖Gal、岩藻糖Fuc，其物质的量比为1.029∶5.312∶14.022∶2.925，其物质的量百分比依次为4.4%、22.8%、60.2%、12.6%。

图4 13 种单糖标准品（A）及暗褐脉柄牛肝菌多糖（B）的高效液相色谱图Fig.4 High performance liquid chromatograms of mixture of 13 monosaccharide standards (A) and PPP-0 (B)

2.6 紫外光谱分析

如图5所示，黑色曲线是DEAE-52纤维素柱色谱分离后得到的多糖溶液紫外光谱图，红色曲线是该多糖经过丙烯葡聚糖凝胶S-400HR柱色谱分离后的紫外光谱图，可以看出，该多糖在260 nm附近有紫外吸收，结合多糖含量测定结果，推测可能为成分均一的糖蛋白复合体。

图5 暗褐脉柄牛肝菌多糖的紫外光谱图Fig.5 UV spectra of PPP-0

2.7 红外光谱分析

由图6可知，3 405 cm-1处的吸收峰宽且强，为多糖分子中—OH的分子间缔合的氢键，2 937 cm-1处的中等强度的吸收峰是饱和C—H伸缩振动，1 652 cm-1处为酰胺羰基峰，说明组分中含有氨基糖，多糖中可能含有部分与糖结合的蛋白。1 384 cm-1处出现弱的吸收峰，是由于C—H的变角振动。1 081 cm-1处是醇羟基的变角振动吸收峰。这些都是典型的多糖特征峰。988 cm-1处的吸收峰表明该多糖为吡喃型糖环，866 cm-1处附近的一系列的吸收峰表明该多糖同时存在α和β两种构型。

图6 暗褐脉柄牛肝菌多糖的红外光谱图Fig.6 Infrared spectrum of PPP-0

2.8 核磁共振波谱分析

一般情况下，在δ4.3～5.5端基质子区，α-糖苷的端基质子的化学位移一般大于δ4.95，β-构型的糖端基质子化学位移小于δ4.95，根据图7A，δ4.94、4.93、4.48是β型H1质子信号，δ5.01和δ5.02处是α型H1质子信号，表明该多糖既有β型吡喃糖环结构也有α型吡喃糖环结构，δ1.17、1.18、1.27、1.25为岩藻糖CH3的质子信号。δ3.17、3.42等化学位移在δ3.0～4.0区域为糖残基中非端基质子的次甲基和亚甲基共振区。图7B中，在端基碳的共振区（δ90～110）中，δ97.91是α型C1的共振信号，δ15.74为岩藻糖CH3上C的共振信号，对于游离C6共振信号约在δ62氧取代后则位移到δ68，所以δ68.32和δ68.86是发生氧取代的C6信号，说明该多糖有(1→6)糖苷键。综合以上信息，可知该多糖包括α和β两种构型，具有(1→6)糖苷键，但该多糖是结构较为复杂的杂多糖，仅凭现有数据无法分析其具体结构，还需要结合甲基化实验和二维核磁共振相关谱进一步分析确定其结构。

图7 暗褐脉柄牛肝菌多糖的1H-NMR（A）和13C-NMR（B）图Fig.7 1H-NMR (A) and 13C-NMR (B) spectra of PPP-0

2.9 扫描电子显微镜图分析

从图8可以看出，暗褐脉柄牛肝菌多糖呈片状，有的卷曲，大小、形状不均匀，在更高倍数下，表面相对紧密，说明此组分多糖分子间交联非常紧密，彼此间相互作用较强。

图8 暗褐脉柄牛肝菌多糖的扫描电子显微镜图Fig.8 SEM images of PPP-0

2.10 α-葡萄糖苷酶抑制活性

通过α-葡萄糖苷酶抑制实验，测得暗褐脉柄牛肝菌子实体粗多糖抑制率曲线，相同情况下对比阳性对照药物阿卡波糖的抑制率曲线。由此可初步判定暗褐脉柄牛肝菌子实体粗多糖对α-葡萄糖苷酶具有一定的抑制作用。

为筛选出降血糖活性最好的纯化多糖组分，将暗褐脉柄牛肝菌子实体粗多糖、PPP-0、PPP-1、PPP-2分别进行酶抑制实验，抑制率曲线如图9所示，当多糖质量浓度在0.25～2.5 mg/mL时，暗褐脉柄牛肝菌多糖的粗多糖、PPP-0、PPP-1、PPP-2均有一定的α-葡萄糖苷酶抑制活性，其中PPP-1与PPP-2抑制率与多糖质量浓度呈正相关的量效关系，PPP-0抑制率与多糖质量浓度量效关系不明显，并且抑制率均低于阳性对照药品阿卡波糖。纯化多糖组分中PPP-1与PPP-2在多糖质量浓度为0.25～2.5 mg/mL的范围内呈现上升的趋势，且随着质量浓度的增大，PPP-1对α-葡萄糖苷酶的抑制率从32.20%到57.15%，PPP-2对α-葡萄糖苷酶的抑制率从39.04%到70.55%。在同等多糖质量浓度（1.0 mg/mL）下，不同的多糖组分对α-葡萄糖苷酶抑制率为PPP-2＞PPP-0＞粗多糖＞PPP-1；在同等多糖质量浓度（2.0 mg/mL）下，不同的多糖组分对α-葡萄糖苷酶抑制率为PPP-2＞粗多糖＞PPP-0＞PPP-1，其中PPP-2的抑制活性远高于另外3 个组分。由于提取分离纯化实验所得的多糖组分PPP-2含量最少，多糖组分PPP-0含量最大，所以最终选择PPP-0组分进行酶抑制动力学实验，探究其抑制机理及类型。

图9 暗褐脉柄牛肝菌子实体多糖抑制率曲线Fig.9 Inhibitory effects of polysaccharides from P.portentosus on α-glucosidase

2.11 α-葡萄糖苷酶抑制机理的确定

在测定酶活性体系中，如果有一定量的不可逆性抑制物质存在时，会使酶的分子构象发生永久性变化而失活，表现在其速率直线不经过原点；如果有一定量的可逆性抑制物质存在时，由于抑制剂的量恒定，所以可以得到一条经过原点的速率直线。

通过酶标仪在405 nm处测得各组的吸光度，代入PNP回归方程，计算得到加入不同酶量后的反应速率，以酶用量对应反应速率作图，结果如图10所示，得到不同质量浓度的PPP-0对α-葡萄糖苷酶的抑制动力学曲线，以此分析α-葡萄糖苷酶经PPP-0多糖组分作用后剩余的酶活力与加入不同酶量之间的关系。α-葡萄糖苷酶经过1 mg/mL PPP-0作用后，通过对数据分析，酶活力和酶添加量之间的关系是一条直线，方程为y＝0.017 4x-7×10-5，R2＝0.999 9；随着PPP-0质量浓度增加到2 mg/mL时，酶活力和酶添加量之间的关系是一条斜率减小的直线，方程为y＝0.016 9x-9×10-5，R2＝0.999 8。由于两条曲线的纵截距很小，近似于0，所以可认为其过原点，说明PPP-0对α-葡萄糖苷酶的抑制为可逆作用。PPP-0和α-葡萄糖苷酶可逆性地结合，抑制了酶的活力，使其催化效率降低，而不是因为PPP-0质量浓度的增加，使酶分子构象发生永久变化导致有效酶量的减少，以至于酶催化效率的下降。酶活力单位的定义为在37 ℃、pH 6.8的条件下1 min内PNPG能转化为1 μmol PNP的酶量。

图10 PPP-0对α-葡萄糖苷酶的抑制动力学曲线Fig.10 Inhibition of kinetic curves of α-glucosidase by PPP-0

2.12 α-葡萄糖苷酶抑制动力学

以蒸馏水为空白对照，利用酶标仪在405 nm处测定吸光度；以PNP的体积为横坐标，吸光度为纵坐标，作线性回归方程，得到PNP回归方程：y＝2.084x+0.010 8，R2＝0.999 7。在测定酶活性体系中，改变底物PNPG的浓度，加入浓度0.2 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液，测定不同浓度PPP-0对酶活力的影响，以未加酶液PPP-0组作对照。由Lineweaver-Burk法双倒数作图，即以1/[S]为横坐标（[S]表示底物浓度），1/[V]为纵坐标（[V]表示酶促反应速率），结果如图11所示，可知PPP-0和无抑制的两条直线相交于纵坐标，存在抑制剂时，米氏常数Km值逐渐增大，最大反应速率Vmax保持恒定，可推测出PPP-0组分对α-葡萄糖苷酶的抑制作用类型是竞争性抑制。

图11 PPP-0对α-葡萄糖苷酶的Lineweaver-Burk图Fig.11 Lineweaver-Burk plot for α-glucosidase inhibition by PPP-0

3 结论

4 种大孔树脂（HP 2MGL、HP 20、SP 850、SP825）中，SP 825大孔树脂脱色综合效果最好，且对多糖溶液的脱色率为63.49%，醇沉得到粗多糖8.9 g（得率8.9%），且粗多糖中多糖质量分数为44.13%，蛋白质量分数为51.4%。

通过DEAE-52纤维素和丙烯葡聚糖凝胶S-400HR柱色谱分离和纯化得到暗褐脉柄牛肝菌多糖3 个组分：PPP-0、PPP-1、PPP-2，其中PPP-0含量最高且为均一成分，重均分子质量为31 059 Da；单糖组成分析表明PPP-0是一种由半乳糖Gal、葡萄糖Glc、岩藻糖Fuc和甘露糖Man组成的杂多糖，其物质的量占比依次为60.2%、22.8%、12.6%、4.4%。

通过紫外光谱分析得出所制备的多糖，可能为成分均一的糖蛋白复合体；红外光谱与核磁共振波谱分析得出该多糖结构中存在α型和β型吡喃糖；扫描电子显微镜显示，所制备的暗褐脉柄牛肝菌多糖呈片状卷曲。

粗多糖、PPP-0、PPP-1和PPP-2均可抑制α-葡萄糖苷酶活性，但抑制率均低于阳性对照药品阿卡波糖；测定酶活体系中，PPP-0组分对α-葡萄糖苷酶的抑制为可逆性抑制，即不会使酶的分子构象发生永久性变化而失活；通过酶抑制动力学分析，可知PPP-0对α-葡萄糖苷酶的抑制为竞争性抑制。