氯沙坦降低癫痫大鼠共患抑郁症风险的机制研究☆

潘楠楠 胡雅纯 廖雪珍 石喆 施海姗

据统计约有20%～61%的癫痫患者共患有抑郁症[1-2]。癫痫共患抑郁症会加重患者癫痫发作的频率、降低抗癫痫药物的疗效，对患者和社会造成不利影响[3-4]。目前关于癫痫的治疗仍以控制癫痫发作为主[5]，并不能减少癫痫共患抑郁症的患病率。氯沙坦（losartan）是一种广泛用于治疗高血压的血管紧张素受体拮抗剂。近年研究发现氯沙坦可以减少癫痫发作[6-7]，另外还具有抑制炎症损伤的作用，可以在炎症损伤的靶器官内下调高迁移率族蛋白B1（high-mobility group protein B1，HMGB1）表达，减轻炎症反应，从而改善预后[8]。而HMGB1 相关的炎症反应在癫痫和抑郁症的发病机制中发挥着重要作用。因此本研究将氯沙坦用于癫痫模型大鼠，观察氯沙坦是否可以通过下调HMGB1表达，改善癫痫大鼠海马区炎症反应，从而降低癫痫共患抑郁症的风险，为癫痫共患抑郁症的预防提供新依据。

1 材料与方法

1.1 癫痫大鼠模型的建立及分组 成年SD 雄性大鼠（体质量150～180 g，n=24）购自广东省医学实验动物中心。大鼠饲养在SPF 环境中，食物和水可自由摄取。本实验所有步骤遵守中华人民共和国科技部发布的《实验动物福利伦理指南》，并获得广州医科大学动物伦理委员会批准。

大鼠采用随机数字表法分为3 组：匹罗卡品-氯沙坦（pilocarpine and losartan，PL-L）组（n=8）接受锂-匹罗卡品腹腔注射建模，建模成功后给予氯沙坦干预；匹罗卡品（pilocarpine，PL）组（n=8）接受锂-匹罗卡品腹腔注射建模；对照（control，Ctrl）组（n=8）接受氯化锂腹腔注射。

按照既往锂-匹罗卡品模型方案建立癫痫大鼠模型[9]，具体操作步骤：腹腔注射氯化锂（127 mg/kg，Sigma-Aldrich，美国），18～24 h 后腹腔注射东莨菪碱（1 mg/kg，阿拉丁，P424411，上海），30 min后腹腔注射匹罗卡品（30 mg/kg，阿拉丁，P344660，上海），当大鼠出现Racine 标准Ⅳ级及以上发作后开始计时[10]，30 min 内发作3 次视为癫痫持续状态诱导成功，癫痫持续状态持续90 min后予腹腔注射地西泮注射液（10 mg/kg）终止发作。对照组大鼠给予等量的氯化锂、东莨菪碱和生理盐水，不注射匹罗卡品。Racine 分级[10]：Ⅰ级为面部阵挛，包括眨眼、动须、节律性咀嚼、湿狗样颤抖；Ⅱ级为I级+节律性点头；Ⅲ级为Ⅱ级+前肢阵挛；Ⅳ级为Ⅲ级+后肢站立；Ⅴ级为Ⅳ级+跌倒。

1.2 氯沙坦干预 参考既往文献给予氯沙坦干预[11]：PL-L 组大鼠在癫痫大鼠模型建立成功24 h 后给予氯沙坦（浙江华海药业股份有限公司）60 mg/kg腹腔注射，连用3 d，后将氯沙坦以2 g/L 溶于大鼠饮用水中，连用18 d。PL组和Ctrl组饮用正常饮用水。

1.3 抑郁行为学评估 采用体质量增长量和蔗糖偏爱实验来评估大鼠的抑郁样行为。体质量增长量的测量：各组大鼠在实验结束后连续测量体质量1周，计算每只大鼠1 周之内的体质量增长量。蔗糖偏爱实验：大鼠单笼饲养，实验前给予2 瓶1%蔗糖水进行适应性训练；正式实验时，首先禁水16 h，然后在适应性训练时同样位置放置事先称重的2 瓶水（1%的蔗糖水和普通饮用水），饮用4 h，中间水瓶交换位置一次；实验结束后撤下2 瓶水并称重（g），计算大鼠的糖水偏爱率。糖水偏爱率＝[糖水消耗量/（糖水消耗量+普通饮用水消耗量）]×100%。

1.4 RT-PCR 检测HMGB1、IL-1β 和IL-6 相对mRNA 表达量 抑郁样行为评估结束后，所有大鼠用10%水合氯醛麻醉，经升主动脉插管至左心房，4 ℃的生理盐水约150 mL 冲洗后取脑，在冰上将海马分离出来后在液氮中快速冷冻，并在-80 ℃下保存，用于实时逆转录定量PCR（RT-PCR）分析。使用TRIzol 试剂（Sigma，美国）从海马中分离总RNA，总RNA 由纳米dropND-1000（Thermo 科学，美国）定量，用无酶DNase 试剂盒（Promega，麦迪逊，美国）消化以去除DNA 污染。将mRNA 逆转录，使用高容量cDNA-RT 试剂盒（美国应用生物系统公司）进行cDNA 检测，然后使用SYBR 绿色跳跃启动Taq准备混合物（Sigma，美国）进行RT-PCR。使用Prime 5.0 软件设计引物。HMGB1：正向引物CACT TGGATGTTGAATGCCTC，反向引物TGAAACATCC AAAACTGCCAGA。IL-1β：正向引物TTGAGTCTG CACAGTTCCC，反向引物GTCAACTATGTCCCGAC CA。IL-6：正向引物CTGCCTTCCCTACTTCACA，反向引物ATATGTAATTAAGCCTCCGACT。GAPD H：正向引物CTTCTTGTGCAGTGCCAGCC，反向引物CAAGAGAAGGCAGCCCTGGT。RT-PCR 分3 个阶段进行：第一阶段在95℃预热30 s；第二个阶段共40个周期，包括在95 ℃ 5 s，在60 ℃ 30 s；第三阶段包括在95 ℃ 15 s，在60 ℃ 1 min，在95 ℃ 15 s。采用比较ΔΔCt法对数据进行统计分析。为了减少取样造成的误差，对每个样本进行3 次RT-PCR 分析，并取平均值。

1.5 统计学方法 采用SPSS 20.0 进行统计学分析。所有数据以均数±标准差表示。图表应用Graph-Pad Prism 5 制作。多组比较采用单因素方差分析，两组之间比较采用LSD-t法，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 癫痫发作情况 所有注射匹罗卡品的大鼠发生Racine Ⅳ级以上的癫痫发作，并持续发作90 min以上。其中有4 只老鼠死于癫痫发作持续状态。最后PL-L组6只大鼠，PL组6只，Ctrl组8只。

2.2 大鼠抑郁样行为学评估结果 体质量增长量结果显示，3 组之间的体质量增长量差异有统计学意义（F=10.89,P＜0.01）。PL 组大鼠体质量增长量较Ctrl 组减少（P＜0.01），PL-L 组大鼠体质量增长量较PL组增加，差异有统计学意义（P＜0.01），而PL-L组大鼠体质量增长量与Ctrl 组相比，差异没有统计学意义（P=0.64）。见表1。

Tab.1 Results of depression-like behavior assessment of rats in each group表1 各组大鼠抑郁样行为学评估结果

蔗糖偏爱实验结果显示，3 组之间的差异有统计学意义（F=13.21,P＜0.01）。PL 组大鼠糖水偏爱率低于较Ctrl 组大鼠，差异有统计学意义（P＜0.01）；PL-L 组大鼠糖水偏爱率高于PL 组大鼠，差异有统计学意义（P＜0.01）；而PL-L 组大鼠糖水偏爱率虽然低于Ctrl 组，但两组之间差异无统计学意义（P=0.12）。见表1。

2.3 氯沙坦对HMGB1 mRNA 相对表达量的影响3 组大鼠海马区HMGB1 mRNA 相对表达量差异有统计学意义（F=20.62,P＜0.01）。与Ctrl 组相比，PL组大鼠海马区HMGB1 mRNA 相对表达量增加（P＜0.01）；PL-L组大鼠海马区HMGB1 mRNA相对表达量较PL组减少（P＜0.01），与Ctrl组相比差异无统计学意义（P=0.07）。见图1、表2。

Fig.1 HMGB1 mRNA expression in the hippocampus of rats in each group图1 各组大鼠海马区HMGB1 相对mRNA 的表达量 注：** P＜0.001。

Tab.2 The expression of HMGB1, IL-1β and IL-6 mRNA in hippocampus of rats in each group表2 各组大鼠海马区HMGB1、IL-1β和IL-6 mRNA相对表达量

2.4 氯沙坦对大鼠海马区炎症因子表达的影响 3组大鼠海马区IL-1β（F=17.38，P＜0.01）和IL-6（F=6.04，P=0.04）mRNA的表达差异有统计学意义。PL组大鼠海马区IL-1β（P＜0.01）和IL-6（P=0.03）mRNA 相对表达量较Ctrl组增加；PL-L 组大鼠海马区IL-1β（P＜0.01）和IL-6（P=0.02）mRNA 相对表达量较PL 组减少，而与Ctrl 组相比，则差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

3 讨论

癫痫患者易共患抑郁症，而抑郁症又会加重癫痫患者的病情，并降低其生活质量[12]。因此，预防癫痫患者共患抑郁症具有重要意义。基于近年来关于癫痫共患抑郁症的相关机制研究，本研究采用氯沙坦干预癫痫大鼠，观察氯沙坦在癫痫共患抑郁症中的作用。本研究发现，PL 组大鼠呈现出体质量减少以及快感缺失等抑郁样行为表现，这与之前的研究结果[13]一致。给予氯沙坦干预后，PL-L 组大鼠的抑郁样行为较PL组大鼠明显好转，与Ctrl组大鼠无明显差异。这些结果提示，氯沙坦干预可能降低了癫痫大鼠出现抑郁样行为的风险，表明氯沙坦在减轻癫痫相关抑郁症状方面具有潜在的治疗效果。

氯沙坦是一种常用的抗高血压药物，通过选择性地阻断血管紧张素Ⅱ受体1（AT1 受体），抑制血管紧张素Ⅱ的生物学效应[14-15]。近年来有研究发现，氯沙坦还具有减轻炎症损伤、抑制包括HMGB1在内的多种炎性因子释放的作用[16-17]。氯沙坦的抗炎作用可能是通过抑制血管紧张素Ⅱ生物学效应，间接地降低HMGB1 的表达和释放[18]；也可能直接影响HMGB1 的核内转运和细胞外释放，从而抑制HMGB1 在炎症反应中的作用[19-20]。在动物癫痫模型中，氯沙坦已被证实可能通过改变其脑内炎症因子水平，降低癫痫发作的严重程度或提高抗癫痫药物的疗效[21]。本研究发现PL 组大鼠海马区HMGB1 mRNA相对表达量较Ctrl组显著增加，而氯沙坦干预后与PL 组大鼠相比，PL-L 组大鼠海马区HMGB1 mRNA相对表达量明显减少，与Ctrl组相比则无统计学差异。这些结果表明，氯沙坦可以减少癫痫大鼠海马区HMGB1的表达。

HMGB1 是一种高度保守的核蛋白，在细胞核内广泛存在，是损伤相关分子模式（damageassociated molecular patterns，DAMP）家族的典型成员，具有多种生物学功能，包括维护DNA 结构稳定性、调节基因转录以及调节炎症和免疫反应[22-23]。在炎症和免疫反应中，HMGB1 被认为是重要的促炎因子，在炎症信号转导通路中发挥作用，促进炎症细胞的迁移和活化，并诱导炎症因子的释放[24-25]。研究证实癫痫发作可导致海马区细胞损伤和死亡，这些损伤促进HMGB1 释放，HMGB1 可以通过与细胞表面的受体（如晚期糖基化终末产物受体和Toll 样受体4）结合，激活下游信号通路，增加炎症介质（如IL-1β、IL-6 等）的合成和释放，充当“损伤相关分子模式”以诱导炎症对靶器官的损伤，加重癫痫发作[26-27]。而炎症因子，如IL-1β、IL-6等，可影响神经递质的合成、释放和再摄取[28-29]，从而导致神经递质失衡，进而影响情绪调节和抑郁症的发生[30-31]。本研究发现PL 组大鼠海马区HMGB1 mRNA 相对表达量明显增加的同时，IL-1β、IL-6的mRNA 相对表达量水平也增加，而给与氯沙坦干预后PL-L 组大鼠海马区HMGB1 mRNA 相对表达量明显减少，同时IL-1β、IL-6 的mRNA 相对表达量水平降低。

如何预防癫痫共患抑郁症是癫痫治疗的重要挑战。综上所述，本研究初步证实了氯沙坦可通过抑制HMGB1 释放，减少炎症因子IL-1β、IL-6 的表达，从而减少癫痫大鼠共患抑郁症的风险。这提示氯沙坦可能成为预防癫痫共患抑郁症的有效方法。然而，考虑到临床应用与动物实验之间的差异，以及癫痫共患抑郁症的复杂性，将来尚需开展更多的研究来证实。