白腐乳加工中蜡样芽孢杆菌的污染分布及空气洁净度的监测

摘 要：目的：研究白腐乳生产加工过程中菌落总数和蜡样芽孢杆菌的污染分布，并对生产车间空气洁净度进行监测，确定控制腐乳中蜡样芽孢杆菌数量的关键环节。方法：通过对白腐乳生产加工过程中的不同样品进行菌落总数和蜡样芽孢杆菌含量测定，同时对各生产车间及主要器具进行检测，并连续监测生产车间空气洁净度，确定蜡样芽孢杆菌滋生的关键环节。结果：白腐乳生产加工过程中，酸水的加入使得豆浆中菌落总数及蜡样芽孢杆菌数骤升，毛坯发酵阶段蜡样芽孢杆菌也大量滋生；胶架的卫生及车间洁净度对白腐乳生产卫生格外重要。结论：可以通过加强原辅料管理、定期清洁消毒生产车间和器具、建立健全的微生物测定和空气洁净度监测程序来控制白腐乳中蜡样芽孢杆菌数量。

关键词：蜡样芽孢杆菌；腐乳；食品安全；食品卫生；洁净度

Distribution of Bacillus cereus Contamination and Monitoring of Air Cleanliness in White Sufu Processing

YUAN Yuhua1， SUN Wei2*

（1.Guangzhou Jushu Food Co.， Ltd.， Yangjiang 529500， China;

2.College of Food Science and Engineering， South China University of Technology， Guangzhou 510640， China）

Abstract： Objective ： To study the pollution distribution of total bacterial count and Bacillus cereus in the production and processing of white sufu， monitor the air cleanliness of the production workshop， and determine the key link to control the number of Bacillus cereus in sufu. Method： The total number of colonies and the content of Bacillus cereus in different samples during the production and processing of white sufu were determined. At the same time， the production workshops and main appliances were tested， and the air cleanliness of the production workshop was continuously monitored to determine the key link of Bacillus cereus breeding. Result： In the production and processing of white sufu， the addition of acid water caused the total number of colonies and the number of Bacillus cereus in soybean milk to rise sharply， and Bacillus cereus also proliferated in the fermentation stage of fermented bean curd blank. The hygiene of the rubber frame and the cleanliness of the workshop are particularly important for the hygiene of white sufu production. Conclusion： The number of Bacillus cereus in white sufu can be controlled by strengthening the management of raw materials， regularly cleaning and disinfecting production workshops and appliances， establishing and improving microbial determination and air cleanliness monitoring procedures.

Keywords： Bacillus cereus; sufu; food safety; food hygiene; cleanliness

蜡样芽孢杆菌是一种条件性致病菌，可通过空气、水源、土壤及动植物等途径传播，当其在食品中的含量超出一定范围时，能够引发腹痛、腹泻等症状，严重时甚至危害生命[1]。腐乳是一种具有独特风味的中国传统发酵豆制品，其加工方式多为人工操作，且加工环境较为开放，容易受到蜡样芽孢杆菌的侵染。食品工业对于生产过程及产品有着严格的微生物要求，而生产环境是微生物污染的重要来源。

空气洁净度指单位体积空间内，空气中所含微粒大小及数量的多少，是区分空间洁净度级别的标准。控制加工环境的空气洁净度对食品车间至关重要。

本文通过测定腐乳不同加工环节的样品、生产中主要器具及生产车间的微生物含量来探究蜡样芽孢杆菌的污染分布，以明确蜡样芽孢杆菌滋生的关键控制点；同时测定车间洁净度，以便监测和预防生产环境中微生物污染带来的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

平板计数琼脂培养基、甘露醇卵黄多粘菌素琼脂基础培养基、多粘菌素B、蜡样芽孢杆菌鉴定试剂盒等，购买于广东环凯微生物技术有限公司。

LS-100LD型高温高压灭菌锅，江阴滨江医疗设备有限公司；DHP-600AB培养箱，天津市赛得利实验分析仪器制造厂；SW-CJ-2D型超净工作台，天津赛得利斯实验分析仪器制造厂；TH20BL自动温湿度记录仪，妙观科技有限公司；ST510压差计，希玛仪表集团有限公司；HT-9829热敏风速仪，鑫思特科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 生产工序中蜡样芽孢杆菌的污染检测

（1）菌落总数测定方法。白腐乳的生产工序如图1所示。在不同的生产工艺点取样，样品分别为黄豆、豆浆、白坯、毛坯、酸水、种水、盐坯及腐乳成品，参照《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》（GB 4789.2—2022）检测样品中的菌落总数。

（2）蜡样芽孢杆菌测定方法。参照《出口食品蜡样芽孢杆菌检测标准》（SN/T 0176—2013），取5 g样品，加入45 mL 8.5%的生理盐水稀释，充分均质后进行梯度稀释。选取合适梯度的稀释液100 µL于MYP选择性培养基，涂布均匀，于30 ℃下培养24 h后计数。蜡样芽孢杆菌在MYP平板上的典型特征为微粉红色菌落，周围有白色或浅粉红色沉淀环。

1.2.2 后发酵过程中蜡样芽孢杆菌的生长规律

后发酵阶段是腐乳在分解酶作用下分解腐乳胚的蛋白质，产生氨基酸和醇类物质的关键环节[2-3]。每隔一段时间取白腐乳样品（0 d、15 d、30 d、60 d、90 d、180 d、270 d），检测不同发酵时期下微生物群落的数量。

1.2.3 主要生产器具中菌落总数及蜡样芽孢杆菌测定

参照《公共场所卫生检验方法 第4部分：公共用品用具微生物》（GB/T 18204.4—2013），将5 cm×5 cm的灭菌规格板置于物体表面，用浸有生理盐水的棉签来回涂抹10次，剪去手指接触的部位，将棉签放入10 mL灭菌生理盐水的采样管内，立即送往实验室检测。

1.2.4 生产车间空气洁净度的监测

（1）空气沉降菌的检测。按照《公共场所卫生检验方法 第3部分：空气微生物》（GB/T 18204.3—2013）中的自然沉降法进行空气采样。将营养琼脂平板及MYP平板放置于采样点，打开平皿，使其完全暴露在空气中5 min，随后盖好平板，转移至培养箱中倒置培养，菌落总数及蜡样芽孢杆菌分别于37 ℃和30 ℃下培养48 h后进行计数。

（2）车间洁净度检测。参照《洁净室施工及验收规范》（GB 50591—2010），现场测定静压差、风速、温度、相对湿度。

1.2.5 数据处理

实验操作重复3次，使用IBM SPSS Statistics 26和Origin 2018软件进行数据处理和绘图。

2 结果与分析

2.1 不同生产工序中蜡样芽孢杆菌的检测

白腐乳的生产工艺流程分为两个阶段，即白坯接种毛霉后的固态发酵过程和罐装酒水后腐乳坯的后发酵过程。通过对不同工艺流程中不同样品进行检测，能够明确蜡样芽孢杆菌的污染分布情况，为腐乳中蜡样芽孢杆菌的控制提供理论支持。如表1所示，腐乳作为发酵豆制品，生产工序中菌落总数整体偏高。点浆环节的酸水是引入蜡样芽孢杆菌的关键环节，数量达到5.7×103 CFU·g-1，并随着原辅料带入以及生产线的传递等原因，腐乳盐坯中的蜡样芽孢杆菌数上升到8.6×106 CFU·g-1。腐乳盐坯经过毛坯固态发酵后，毛坯中的蜡样芽孢杆菌数迅速上升到6.5×107 CFU·g-1，具有食品安全隐患。因此，酸水引入蜡样芽孢杆菌及蜡样芽孢杆菌在毛霉固态发酵时期的增殖可能是造成蜡样芽孢杆菌在腐乳中含量偏高的主要原因。

2.2 后发酵过程中蜡样芽孢杆菌生长规律

腐乳后发酵是一个复杂的发酵过程，微生物不断进行自身代谢产物的合成和释放，同时释放的酶类不断分解腐乳坯中的蛋白质、糖类、脂肪酸[4]等，复杂的发酵过程使得腐乳形成独特的风味及营养品质。如表2所示，白腐乳后发酵过程开始（0 d）至发酵成熟（90 d），菌落总数总体呈现下降趋势，但并未发生显著性变化（P＞0.05），放置180 d和270 d的成品腐乳菌落总数也维持在相对稳定的水平，这与腐乳作为发酵食品的特性有关。后发酵过程中微生物群落结构与风味物质的形成具有相关性[5]，丰富的菌群能够为腐乳发酵带来积极的作用。

蜡样芽孢杆菌数量随着发酵时间的延长呈现下降趋势。后发酵结束的腐乳（90 d）中蜡样芽孢杆菌含量为1.6×103 CFU·g-1，低于蜡样芽孢杆菌的出口标准105 CFU·g-1，这可能与发酵过程中高含量食盐及酒精的抑制作用有关。成品腐乳（180 d及270 d）中蜡样芽孢杆菌含量也维持在103 CFU·g-1左右，达到出口标准的要求，但为了降低食品安全隐患，应尽量将蜡样芽孢杆菌的含量控制在较低水平。

2.3 主要生产器具中菌落总数及蜡样芽孢杆菌测定

蜡样芽孢杆菌具有较强的环境适应性，能够产生致密的生物膜黏并附于器具表面[5]，污染接触的食品。胶架和纱布用于腐乳的固态发酵，能够直接接触坯乳。胶架通常使用热水冲洗和蒸汽灭菌，作用时间短，效果有限。由图2可以看出，胶架清洗后能显著降低菌落总数，但对蜡样芽孢杆菌并无影响。纱布通常采用湿热灭菌处理，清洗后菌落总数及蜡样芽孢杆菌数都显著降低，表明清洗能够去除大部分细菌，但对于耐热性和粘附性较强的蜡样芽孢杆菌，高温高压的湿热灭菌法效果更好。因此，胶架的清洁情况需要格外注重。

2.4 车间洁净度的监测

2.4.1 不同生产车间的沉降菌

对不同生产车间进行空气采样，包括豆腐生产车间、腌制车间、发酵房、泡乳间、内包装组以及装瓶车间等。如表3所示，内包装车间空气中菌落总数为102 CFU/皿，达到轻度污染，内包装车间是腐乳添加辅料的工作车间，人员流动大；豆腐生产车间严重污染，主要是因为豆腐生产车间环境开放，工作内容包括喷洒毛霉接种，因此空气污染程度高。蜡样芽孢杆菌含量在豆腐生产车间达到最高，为19 CFU/皿；而洁净度较高的发酵房中含量较低。因此，豆腐生产车间及内包装车间空气污染程度较高，极易污染食品原料。

2.4.2 空气洁净度的监测

在食品生产过程中，空气中的微生物和杂质可能会导致食品受到污染，影响食品的质量和安全。通过保持空气的洁净度，可以减少微生物和有害物质的存在，降低食品受到污染的风险，而洁净室及相关受控环境受到多种因素的影响。因此，可通过测定腐乳生产车间的空气沉降菌、温度、湿度及静压差等指标来监测加工环境的洁净度，以确保食品生产的环境卫生和质量稳定[6-7]。

从图3（a）可以看出，连续15 d内空气中菌落总数和蜡样芽孢杆菌数表现出相同的趋势，当空气污染严重时，菌落总数增加，空气中蜡样芽孢杆菌的数量也增加。其中，菌落总数大于75 CFU/皿的天数有5 d，达到轻度污染程度。从图3（b）可以看出，15 d内温湿度的变化相对稳定，平均温度为（29.8±1.0）℃，平均湿度为（89.4±3.7）%RH。蜡样芽孢杆菌的适宜生长温度为30 ℃，较高的湿度也能为微生物生长提供水分。因此，应合理控制生产车间的温湿度。如图3（c）所示，第5天时压差达到最小，为66.7 Pa。《洁净厂房设计规范》（GB 50073—2013）规定，洁净室与室外的压差应不小于10 Pa，该车间的压差满足洁净室设计规范，对保持车间内较高的洁净度起到了积极作用。

3 结论

本文对不同加工环节白腐乳样品中的菌落总数和蜡样芽孢杆菌含量进行测定，并对生产车间空气洁净度进行监测。实验结果表明，白腐乳生产加工过程中，酸水的加入使得豆浆中菌落总数及蜡样芽孢杆菌数骤升，毛坯发酵阶段蜡样芽孢杆菌也大量滋生，说明酸水加入及固态发酵时期是控制腐乳中蜡样芽孢杆菌数量的关键环节。菌落总数和蜡样芽孢杆菌数在后发酵过程呈下降趋势，满足出口标准。通过对各生产车间及主要器具进行检测，发现胶架的卫生及车间空气的洁净度需要格外注重。综上所述，腐乳中蜡样芽孢杆菌数量的控制可以从控制生产环节和生产环境入手，通过加强原辅料管理并对生产车间和器具进行定期清洁与消毒，可以有效控制腐乳中蜡样芽孢杆菌的污染。此外，建立健全的微生物测定和空气洁净度监测程序，对于监测和预防腐乳中蜡样芽孢杆菌的污染十分重要。

参考文献

[1]杨春晖，王文平，续丹丹.腐乳及其生产过程中蜡样芽孢杆菌的防控及检测方法研究进展[J].中国调味品，2023，48（9）：214-220.

[2]吴楠，祖元刚，王微.大蒜精油抗菌活性研究（英文）[J].食品科学，2008（3）：103-105.

[3]孙冰玉，邹丽宏，刘颖，等.克东腐乳生产过程中酶活力的变化[J].中国食品学报，2015，15（6）：226-230.

[4]阙云飞，杨昌彪，朱平，等.腐乳发酵过程中微生物种群结构研究进展[J].食品安全质量检测学报，2022，13（5）：1582-1587.

[5]黄韵霖.腐乳风味与后酵微生物的相关性研究[D].广州：华南理工大学，2022.

[6]孟庆磊，贾伟娟，郗珊珊，等.蜡样芽胞杆菌生物膜形成的调控及其去除方法的研究进展[J].中国病理生理杂志，2023，39（6）：1127-1135.

[7]黄伟，季大伟.百家药品生产企业洁净检测结果分析[J].中国药品标准，2023，24（2）：134-137.

作者简介：袁玉华（1966—），男，湖北荆门人，硕士。研究方向：食品发酵。

通信作者：孙伟（1998—），女，河南信阳人，硕士在读。研究方向：食品安全与控制。E-mail：2950658141@qq.com。