多糖的精制及环磷酰胺减毒增效机制研究进展

张彩璇，淑 英，李 杨，黄 磊，郭明珠

（河北农业大学食品科技学院，河北 保定 071000）

癌症已成为全球第3大死因，严重威胁人类身体健康和生命财产安全[1]。回顾2012—2020年癌症数据，人口老龄化加剧、社会经济迅猛发展促使我国及全球癌症负担日趋加重。如图1所示，2020年我国癌症新发病例、死亡病例分别占全球总数的24%、30%，位居全球第一[2]。作为临床常用抗癌化疗药物之一，氮芥烷化类药物环磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）具备抗肿瘤、调节免疫、高临床疗效，广泛应用于多种类型肿瘤、自身免疫性疾病和免疫抑制的有效治疗[3-4]。CTX的体内代谢途径有2 条[5]，其中，主要代谢途径中CTX被肝脏中细胞色素P450酶2B6代谢为磷酰胺氮芥和丙烯醛；次要代谢途径中细胞色素P450酶3A4催化CTX转变为2-去氯乙基环磷酰胺和氯乙醛[6-7]。代谢产物磷酰胺氮芥通过碱化细胞核酸抑制癌细胞增殖分裂，从而发挥抗肿瘤功能；然而，丙烯醛和氯乙醛为毒性代谢产物，会损伤机体正常细胞，诱导机体免疫功能低下、氧化应激、肠道屏障及肝肾损伤、生殖抑制等[8-9]。因此，CTX临床化疗应用受到限制，有必要寻找一种安全解毒剂，以减少或消除其毒副作用。

图1 2012—2020年全球及中国的癌症新发病例和死亡病例Fig.1 New cancer incident cases and cancer deaths worldwide and in China between 2012 and 2020

伴随国家对营养与健康研究开展的鼓励，类黄酮、生物碱、皂苷、多糖等多种功能活性因子与化疗药物联合使用以提高抗癌效果成为研究热点[10]。作为天然膳食纤维，多糖因来源广泛及益生元特性优势突出，具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、降血糖血脂、调节免疫平衡、维持胃肠道健康、预防代谢疾病等药理活性，可作抗肿瘤剂、抗氧化剂、免疫抑制剂等[11-13]。研究表明，桑黄多糖在协同CTX抑制肿瘤生长的同时，可以减轻CTX引起的免疫功能衰退；多花黄精多糖增强CTX抑瘤作用，并通过调节炎症因子、平衡免疫系统、缓解肝肾损伤改善不良反应[14-15]。但天然多糖因结构复杂存在精制工艺效率低、难以扩大化生产等问题。

面对多糖产业的迫切问题及CTX临床应用的毒副作用，本文对近年新型多糖提取精制工艺进行归类总结，同时从调节免疫、改善氧化应激、修复肠道屏障，以及保护肝肾、生殖系统等方面系统综述多糖对CTX化疗毒性的减弱作用，并分析多糖促进肿瘤细胞凋亡、抑制新生血管生长、提高免疫系统活性等机制，探讨其与CTX协同抗肿瘤功能。以期为多糖作为CTX辅助剂减轻毒性、协同抗癌提供理论参考，积极推动多糖的食品精准营养与健康产业发展。

1 多糖制备技术

多糖制备技术显著影响提取产率和分子结构，且多糖的分子结构与其生物活性密切相关，故获取高纯度多糖是阐明结构-功能关系的前提[16-17]。热水提取（hot water extraction，HWE）法、碱提取法、酸提取法、酶辅助提取（enzyme-assisted extraction，EAE）法、超声辅助提取（ultrasonic-assisted extraction，UAE）法、热碱提取法提取的6 种火龙果茎多糖中，HWE法制得的火龙果茎多糖产量相对较高、分子质量及葡萄糖含量最高，表现出优异的抗氧化和降血糖活性[18]。故选择合适的提取纯化工艺对于建立多糖构效关系、促进多糖临床药用尤为重要。

1.1 多糖新型提取技术

传统水提醇沉法操作简便且成本低，适合工业规模化提取水溶中性多糖[19]。但对于某些不溶性多糖，如蘑菇中的β-葡聚糖则需要较高提取温度及压力才能实现有效提取[20]。此外，高分子质量多糖黏度高、溶解性差，水提效率较低[21]。因此开发了经济可持续、高效的天然多糖新型提取技术，包括UAE、微波辅助提取（microwave-assisted extraction，MAE）、EAE、超高压提取（ultra-high pressure extraction，UHPE）、亚临界水提取（subcritical water extraction，SWE）、脉冲电场辅助提取（pulsed electric field-assisted extraction，PEFAE）、双水相萃取（aqueous two-phase extraction，ATPE）、高静水压提取（high hydrostatic pressure extraction，HHPE）等（见表1）。

表1 多糖的新型提取方法Table 1 Novel extraction methods for polysaccharides

此外，超声-微波辅助提取[31]、超声-酶辅助提取[32]、超声辅助-双水相提取[33]、亚临界水-多频超声-双水相提取[34]等联用技术促进优势互补，不仅提取效率高、溶剂消耗少，且以最大限度保护多糖的生物活性。

1.2 多糖精制技术

粗多糖中可能存在色素、蛋白质、无机小分子等杂质，需分离富集多糖以便后续纯化及构效关系鉴定[35]。目前常使用Sevag法、三氯乙酸法、酶法去除多糖中的蛋白质，阴离子交换大孔树脂、H2O2溶液去除色素及无机小分子[36]。而精制方法具体分为物理纯化、化学沉淀和柱层析（表2）。

表2 多糖的精制方法Table 2 Refining methods for polysaccharides

然而，仅使用单一方法难以获得高纯度多糖，实际操作中通常将多种纯化技术相结合以提高多糖的纯度及产率。此外，柱层析法是植物多糖最常用纯化方法，膜分离、盐析、季铵盐沉淀等方法也具有工业应用潜力。Liu Liu等[45]研究发现，柱层析法纯化金福菇多糖组分耗时8 d，而季铵盐沉淀-超滤方法（quaternary ammonium salt precipitation-ultrafiltration，QASP-UF）只需2 d则可处理至少100 g样品，并且QASP-UF的多糖得率比柱层析法高66.7%，具有消耗低、效率高、与后续研究灵活兼容的显著优势，更适合工业应用。由图2可知，植物、动物、微生物、藻类等原材料经过提取、纯化2 个循序递进工艺后得到精制多糖。

图2 多糖提取、分离和精制的一般流程图Fig.2 General flow chart of extraction,separation,and purification of polysaccharides

2 多糖对CTX的减毒作用

CTX代谢产物丙烯醛、氯乙醛因不能有效区分正常细胞与肿瘤细胞，通常会抑制淋巴细胞稳态增殖和自然杀伤（natural killer，NK）细胞杀伤活力，致使细胞因子生成减少，诱导免疫功能低下[46]。丙烯醛进入细胞后激活自由基和活性氧（reactive oxygen species，ROS）产生氧化应激，导致脂质过氧化、蛋白质羰基化、DNA氧化损伤，而过量的自由基又破坏免疫和炎症相关信号通路，这可能导致机体正常细胞损伤和凋亡、器官功能下降[47]。此外，CTX可能会损害胃肠道黏膜，导致肠道通透性和潜在致病菌增加，破坏肠道稳态[48]。

2.1 调节免疫减毒

人体免疫应答包括先天性免疫和适应性免疫，并依赖于胸腺和脾脏等重要免疫器官，以及巨噬细胞、淋巴细胞、NK细胞等免疫细胞，其功能紊乱导致自身免疫性疾病、炎症性疾病甚至癌症[49-50]。天然活性多糖通过调节免疫减轻CTX毒副作用的机制及靶点见表3。

表3 多糖通过调节免疫减轻CTX毒副作用的机制及靶点Table 3 Mechanisms of action and targets of polysaccharides in reducing toxic side effects of CTX by regulating immune function

据报道，富含葡萄糖（glucose，Glu）、甘露糖（mannose，Man）、半乳糖（galactose，Gal）、阿拉伯糖（arabinose，Ara）、果糖（fructose，Fru）的多糖易被免疫细胞上的补体受体3、甘露糖受体、Toll样受体（toll like receptor，TLR）4、TLR2等模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR）识别，随后刺激分泌细胞因子，以增强宿主防御功能[56]。而天然活性多糖通常由Glu、Man、Gal、Ara等组成，因此鉴于多糖的构效关系，其免疫调节机制可能涉及多糖与PRR相互作用，触发相应信号通路、诱导基因转录、促进细胞因子及Igs表达，进而发挥免疫功能。此外，从金银花分离出的酸性多糖组分对CTX治疗小鼠的细胞因子、Igs、巨噬细胞吞噬作用、NK细胞毒性的免疫调节作用显著高于中性多糖组分，这可能归因于酸性多糖组分的分子质量及糖醛酸含量较高[57]。目前关于多糖通过调节免疫活性减轻CTX毒性的作用机制仍有待深入研究，且多糖的免疫活性与其结构特征密切相关，需进一步探讨“多糖分子结构-免疫调节活性-减轻CTX毒副作用”三者关系。

2.2 缓解氧化应激损伤减毒

CTX毒性代谢产物丙烯醛通过氧化应激途径损伤机体氧化与抗氧化平衡系统，破坏内外环境稳态[58]。多糖可通过改善这一途径达到减毒作用，具体机制及靶点如表4所示。

表4 多糖通过缓解氧化应激损伤减毒的作用机制及靶点Table 4 Mechanisms of action and targets of polysaccharides in reducing toxicity by alleviating oxidative stress damage

总结来看，多糖调节氧化应激多与Nrf2通路相关，Nrf2为靶向氧化应激的关键转录因子，与Keap1蛋白结合以非活性状态稳定于细胞质中，并通过不断的泛素-蛋白酶体途径降解，维持低转录活性[65]。选择性自噬蛋白p62通过磷酸化与Keap1蛋白竞争性结合释放Nrf2，调节Keap/Nrf2通路[63]。多糖通过下调Keap1蛋白表达或上调p62蛋白磷酸化水平，直接或间接抑制Nrf2与Keap1蛋白的结合，促进游离Nrf2转位入核，并识别抗氧化反应元件（antioxident response element，ARE），调控下游关键基因转录，最终影响NQO1、SOD、CAT、GSH-Px、HO-1等抗氧化酶的翻译水平，缓解由CTX引起的氧化应激损伤。此外，线粒体凋亡途径也被发现参与多糖的这一调控过程。多糖可通过上调抗凋亡蛋白Bcl-2与促凋亡蛋白Bax的比例，抑制细胞凋亡，降低氧化应激水平。具体作用机制如图3所示。

图3 多糖对CTX诱导氧化应激损伤的改善机制Fig.3 Mechanisms of action of polysaccharides in improving oxidative stress injury induced by CTX

2.3 通过修复肠道屏障减毒

高剂量CTX治疗会损伤肠道黏膜屏障功能，增加炎症性肠病患病概率[66]。天然多糖在唾液、胃液和肠液中几乎不被消化，而被肠道菌群编码的碳水化合物活性酶类降解成单糖或低聚糖，并进一步消化发酵为短链脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）[67]。表5总结了多糖通过修复肠道屏障减毒的作用机制及靶点。

表5 多糖通过修复肠道屏障减毒的作用机制及靶点Table 5 Mechanisms of action and targets of polysaccharides in reducing toxicity by repairing the intestinal barrier

肠道屏障包括机械、生物、化学和免疫屏障，防止病原体和内毒素进入血液、其他组织和器官[68]。而SCFAs作为肠道菌群发酵多糖的主要最终产物，可促进紧密连接蛋白的表达以改善机械屏障，调节肠腔pH值抑制病原菌增殖和促进有益菌生长平衡肠道菌群以加强生物屏障，并维持肠黏膜免疫稳态，进而修复肠道屏障系统。综上所述，多糖通过肠道菌群代谢为SCFAs，从而调控相关肠道屏障，恢复CTX处理小鼠的肠道损伤。因此基于多糖的益生作用，探究多糖与肠道菌群的相互作用，对于减轻化疗药物CTX毒性、促进机体健康具有指导意义。多糖对CTX诱导小鼠的肠道保护作用机制如图4所示。此外研究表明，具有表面多孔结构、高分子质量以及2 种特定糖苷键（α-Araf-(1→和→5)-α-Araf-(1→）的多糖具有较强肠道保护作用[74]。但目前缺乏关于多糖结构-肠道屏障保护作用的系统研究，未来应重点关注二者关联机制，为靶向筛选具有肠道屏障保护活性的多糖提供理论依据。

图4 多糖对CTX诱导小鼠的肠道保护作用机制Fig.4 Mechanisms of action of polysaccharides in protecting against CTX-induced intestinal injury in mice

2.4 通过保肝保肾减毒

肝脏和肾脏是哺乳动物重要的代谢解毒器官，对于维持体内代谢平衡发挥着至关重要的作用[75]。而CTX的肝肾毒性主要与氧化应激、炎症反应、细胞凋亡有关。

真菌多糖因优异的保肝解毒功效而备受关注[76]。Fan Songtao等[77]分析冬虫夏草多糖、灵芝多糖、复合真菌多糖对CTX诱导肝毒性的保护作用机制，发现3 种多糖均能降低谷草转氨酶、谷丙转氨酶、碱性磷酸酶等肝损伤标志酶含量，且抑制肝脏肿大，其中复合真菌多糖具有显著肝脏保护作用。进一步研究发现，真菌多糖保肝作用与上调过氧化物酶体增殖物激活受体α、下调TLR9和促炎因子、增强抗氧化酶活性、调节细胞凋亡有关。由于肠道与肝脏通过肠-肝轴相互联系，Hong Yuzhen等[66]以肠道菌群为靶点，发现凉粉草多糖对CTX诱导肝脏损伤的改善机制可能是通过增加产SCFAs的瘤胃球菌科丰度、减少产内毒素的拟杆菌属丰度，从而抑制肝脏炎症。

已有研究报道岩藻多糖可治疗急性、慢性肾衰竭、糖尿病、肾病等多种肾脏疾病[78]。岩藻多糖降低尿素和肌酐等肾损伤标志物的含量，缓解CTX诱导小鼠的肾脏毒性，其减毒作用机制可能是通过上调Nrf2/ARE途径激活抗氧化酶，抑制NF-κB途径降低炎症因子水平，进而改善肾脏损伤[79]。构效关系表明，分子质量、单糖组成、硫酸基团位置影响岩藻多糖的肾脏保护活性。因此需进一步探索岩藻多糖结构与缓解CTX肾脏毒性的关系。

2.5 通过保护生殖系统减毒

抗癌药物CTX具有一定生殖系统毒性，严重时可能造成育龄患者不孕。CTX诱导的氧化应激导致女性癌症患者卵泡中的颗粒细胞凋亡，孕酮和雌激素水平降低，卵巢功能障碍和纤维化[80]。过量ROS损伤精子DNA，影响精子形态、存活率及活力。多糖通过保护生殖系统减毒的作用机制及靶点见表6。

表6 多糖通过保护生殖系统减毒的作用机制及靶点Table 6 Mechanisms of action and targets of polysaccharides in reducing toxicity by protecting the reproductive system

氧化应激产生过量ROS，引起细胞过度自噬，导致部分正常细胞死亡。PI3K/Akt是经典的细胞抗凋亡信号传导途径，其活化后调控下游Bax、Bcl-2等靶标蛋白，从而清除细胞内多余ROS[85]。因此，海洋动物来源多糖可能通过启动Keap1/Nrf2/ARE及PI3K/AKT信号通路以增强抗氧化性，平衡细胞自噬水平，从而改善氧化应激损伤，减轻CTX生殖系统毒性。

3 多糖对CTX的协同增效作用

CTX代谢产物磷酰胺氮芥与肿瘤细胞DNA发生烷基化反应，形成链内和链间DNA交联，阻断DNA复制，从而抑制肿瘤细胞的生长繁殖[86]。CTX还可活化巨噬细胞、NK细胞、淋巴细胞，改善树突状细胞抗原呈递能力，激活免疫受体，调节免疫信号通路[87]。

多种天然活性多糖也对肝癌、胃癌、肺癌、肉瘤等实体肿瘤具有特异抑制杀伤作用。赵妙惠等[14]利用肝癌腹水荷瘤小鼠发现，CTX组、桑黄多糖组、桑黄多糖联合CTX组的抑瘤率分别为60.29%、42.81%、71.03%，表明桑黄多糖与CTX组合使用显著抑制肿瘤增殖和侵袭，发挥协同增效作用。多糖与CTX协同增效的常见机制包括诱导细胞凋亡直接抑制肿瘤细胞，或通过抑制新生血管生长、提高机体免疫功能等间接发挥肿瘤抑制活性。

3.1 促进肿瘤细胞凋亡

细胞凋亡是去除感染或受损细胞以保护细胞稳态和组织完整性的重要机制[88]。多糖联合CTX治疗肿瘤主要涉及内源性线粒体途径和外源性死亡受体途径2 种信号通路。灵芝多糖与CTX联合处理后的抑瘤率较单独CTX处理显著提高17%，并可激活线粒体途径Bax和Bcl-2，促进线粒体细胞色素C的释放，刺激Caspase-3、Caspase-9诱导小鼠体内S180肉瘤细胞凋亡[89]。粒毛盘菌胞外多糖通过脂肪酸合成酶/凋亡相关因子配体（fatty acid synthase/factor-related apoptosis ligand，Fas/FasL）介导的Caspase依赖性途径，与CTX协同作用于H22肝癌细胞，具有显著抗肿瘤作用，Fas是调节细胞凋亡的关键因子，与FasL结合后募集Fas相关死亡域蛋白，激活Caspase-8引发下游Caspase级联反应，启动凋亡信号，诱导肿瘤细胞凋亡，且Fas/FasL死亡受体途径与线粒体途径通过BH3结构域凋亡诱导蛋白相互联系，共同参与抗肿瘤[90]。研究表明，多糖还可通过阻滞细胞周期、诱发细胞自噬、降低细胞活力等机制直接发挥抗肿瘤作用[91]。而多糖与CTX的联合增效研究局限于细胞凋亡，未来可深入探讨其他直接靶向抑制肿瘤细胞机制。

3.2 抑制肿瘤新生血管生长

新生血管在肿瘤增殖和转移的过程中起着关键作用，其生长主要受血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和碱性成纤维细胞生长因子（basic fibrobast growth factor，bFGF）调控[92]。桑黄多糖和CTX联合处理可通过降低小鼠肝癌组织中VEGF含量发挥潜在抗血管生成作用，从而抑制肿瘤生长[14]。粒毛盘菌胞外多糖与CTX的协同增效机制涉及信号传导和转录激活因子3/缺氧诱导因子1α（signal transducer and activator of transcription 3/hypoxia inducible factor 1α，STAT3/HIF-1α）信号通路[90]。STAT3是一种促癌转录因子，可调控VEGF、bFGF、基质金属蛋白酶（matrix metalloprotein，MMP）2、MMP-9等表达，其中MMP-2和MMP-9可降解细胞外基质，促进血管生成，调节肿瘤的生长、黏附及运动[93]。因此，靶向STAT3信号通路减少VEGF、bFGF、MMP-2、MMP-9的表达，抑制新生血管形成、阻止肿瘤浸润和迁移，可作为癌症早期阶段的有效治疗策略。

3.3 提高免疫系统活性

肿瘤微环境中调节性T细胞、调节性B细胞、肿瘤相关巨噬细胞等免疫抑制性细胞会分泌转化生长因子-β、IL-10、TNF-α等细胞因子，增强免疫耐受性和免疫逃逸能力，促进肿瘤生长、侵袭和转移[94-95]。多糖增强CTX抗肿瘤作用的免疫调节机制如表7所示。

表7 多糖通过提高免疫活性增强CTX抗肿瘤作用Table 7 Polysaccharides enhance the antitumor effect of CTX by increasing immune activity

多糖与CTX联合处理后抑瘤率整体提升，通过促进巨噬细胞吞噬作用和NK细胞活性、活化T/B淋巴细胞、调节Th1/Th2细胞平衡，激活机体细胞免疫与体液免疫，降低免疫抑制性细胞因子水平，重塑免疫微环境，联合靶向免疫系统提高机体抗肿瘤活性。多糖与CTX协同抗肿瘤作用机制包括促进肿瘤细胞凋亡、抑制新生血管生长、提高免疫系统活性，如图5所示。

图5 多糖协同CTX抗肿瘤机制Fig.5 Synergistic antitumor mechanisms of polysaccharides and CTX

此外，肿瘤与抗癌药物CTX相互作用过程中可能产生耐药性，严重影响肿瘤临床治疗。而目前多糖的协同抗肿瘤研究主要集中在诱导肿瘤细胞凋亡、改善肿瘤微环境方面，缺乏逆转多药耐药性作用研究，进一步探索肿瘤复杂耐药机制能为多糖与CTX联合治疗癌症提供新视角。

4 结语

CTX作为非特异性广谱抗癌药物的临床免疫系统毒性、氧化应激毒性、肠道黏膜毒性、肝肾毒性和生殖系统等毒性问题逐渐被重视。天然活性多糖以多途径、多靶点的优势与CTX联用发挥减毒及增效作用，契合“健康中国”战略要求和人类日益增长的营养理念。此外，天然多糖对CTX的减毒增效作用与其单糖组成、糖苷键连接方式等基础结构密切相关，但具体构效关系尚不完全清晰。针对不同结构与生理特性的多糖建立绿色、经济、高效、完善的精制技术，并深层挖掘多糖结构基础与对CTX减毒增效作用的内在关联，是未来的研究方向。机体各器官相互关联、多向交流，而目前多糖的减毒增效研究仅限于单方面阐明，缺乏多层次研究，故多维度探究其减毒增效机制十分必要。近年，多糖被报道通过调节肠道菌群保护肠道屏障、平衡体内能量摄入、调节机体免疫状态，达到局部和远端抗肿瘤作用。因此，未来可基于肠道菌群结构分析，充分探索天然活性多糖在缓解CTX毒性、增强抗肿瘤活性方面的应用，促进天然活性多糖营养强化型特殊医学用途食品或药品的研发，以满足临床需求，实现减毒增效多糖的商业化应用。