原发性肝癌大鼠造模的文献研究现状与评价

徐 亮, 王雅琪, 乔建梁

作者单位：内蒙古医科大学附属医院肝胆外科,呼和浩特 010000

原发性肝癌(primary hepatocellular carcinoma,PHC)是原发于肝细胞或肝内胆管细胞的恶性肿瘤,以肝区疼痛、发热、黄疸等为主要临床表现,现已是全球性的健康问题。动物模型具有周期短、干扰因素少等优点,是医学研究的重要方法之一[1-2]。与PHC相关动物模型包括自发性、诱发性和移植性肝癌大鼠模型。诱发性肝癌大鼠模型具有成本低廉、操作简单、造模周期短等优点,且可诱发出与人类PHC相似度高的模型,故应用最为广泛。目前,研究造模大鼠品系、造模药物种类繁多,造模方法各式各样,造模周期长短不一,因此,研究者常常会感到困惑[3-5]。鉴于此,笔者查阅了大量关于PHC大鼠造模的相关文献,本文对实验大鼠品系、造模方法、药物种类、药物剂量、造模周期、造模结果评价等进行了归纳总结,为研究者了解目前PHC大鼠造模方法提供参考,有助于建立标准化的PHC大鼠模型。

1 资料与方法

1.1研究资料 以“原发性肝癌”“大鼠模型”为关键词检索中国知网(China National Knowledge Infrastructure,CNKI)、万方数据库文献,检索时限为1996年1月至2021年12月。共检索到302篇文献,除去主题词偏差文献、不相关文献、重复文献,以及动物造模方法关键环节缺失、数据缺失的文献,最终纳入115篇文献进行分析,其发表年份分布见图1。

图1 115篇文献的发表年份分布图

1.2研究方法 针对纳入的115篇文献,进行详细阅读,对文献中实验大鼠种类、诱导剂、造模方法、造模周期、造模成功率及评价方法进行整理、总结并分析。

2 结果

2.1实验大鼠 所纳入文献中,60篇(52.2%)为Wistar大鼠,52篇(45.2%)为Sprague-Dawley(SD)大鼠,2篇(1.7%)为Fisher 344大鼠,1篇(0.9%)文献未说明所用大鼠品系。98篇(85.2%)文献所用大鼠性别为雌性,7篇(6.1%)文献所用大鼠为雄性,6篇(5.2%)文献所用大鼠为雌、雄参半,另有4篇(3.5%)文献未具体说明所用大鼠性别。115篇文献中有106篇(92.2%)对大鼠的体重进行了描述,质量为120～180(156.56±8.25)g。55篇(47.8%)文献对大鼠的年龄进行了描述,年龄为5～8周龄,平均6.5周。8篇仅描述为“成年大鼠”。

2.2造模药物 所纳入文献中,PHC大鼠造模所用诱导剂主要分为7种。73篇(63.5%)采用二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine,DEN)配制的水溶液;13篇(11.3%)采用DEN+灭菌食用水混合配制;8篇(7.0%)采用DEN+四氯化碳(CCL4)混合配制;6篇(5.2%)采用DEN+生理盐水混合配制;3篇(2.6%)采用DEN+标准饲料混合配制;4篇(3.5%)采用二乙酰氨基芴(2-acetylaminofluorene,2-AAF)直接配制;1篇(0.9%)为黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)直接配制;7篇(6.1%)未做系统描述,见表1。

表1 115篇文献造模药物使用情况

2.3造模方法 所纳入文献中,PHC大鼠造模方法主要有6种。41篇(35.7%)采用自由饮用法;34篇(29.6%)采用腹腔注射法;7篇(6.1%)采用腹腔注射+自由饮用法;11篇(9.6%)采用灌胃法;7篇(6.1%)采用皮下注射+自由饮用法;3篇(2.6%)采用腹腔注射+灌胃法;其余12篇(10.4%)未说明造模方法,见表2。

表2 115篇文献造模方法情况

2.4造模评价方法 115篇文献中,41篇(35.7%)采用主观评价法来评价造模是否成功,55篇(47.8%)采用客观评价法,有10篇(8.7%)采用超声影像学评价法;其余9篇(7.8%)未说明评价方法,见表3。

表3 115篇文献造模评价方法情况

2.5造模周期及造模成功率 在纳入文献中,采用自由饮用法约需18周可观察到造模结果,成功率为87.5%;采用腹腔注射法约需16周可观察到造模结果,成功率为90.0%;采用腹腔注射+自由饮用法约需16周可观察到造模结果,成功率为60.0%;采用灌胃法约需18周可观察到造模结果,成功率达100.0%;采用皮下注射+自由饮用法约需12周可观察到造模结果,成功率达100.0%;采用腹腔注射+灌胃法约需18周可观察到造模结果,成功率为80.0%,见表4。

表4 115篇文献造模周期及造模成功率情况

3 讨论

3.1本研究通过对1996—2021年发表的关于PHC大鼠造模的相关文献进行检索,并对纳入文献中的大鼠品系、诱癌药物、造模方法、造模周期以及评价方法等进行整理、总结、分析,发现PHC大鼠造模研究仍存在以下不足:(1)造模大鼠种类。研究者更倾向于选用Wistar大鼠和SD大鼠[6],但对于大鼠的性别、体质量,各文献无统一标准,且研究者大多选用年龄较小,体质量在120～180 g的大鼠,而不少文献对大鼠的年龄和体质量更无具体描述[7-8]。这些因素是否会对造模成功有影响,暂无相关数据支持。(2)诱导剂。构建PHC大鼠模型所选取的诱导剂与造模方法密切相关,不同种类的诱导剂,甚至是同一诱导剂的相同浓度下,不同给药时间仍会导致造模成功率存在差异。王金娥和姜慧杰[9]以0.01% DEN按照不同给药时间构建PHC模型,当予0.01% DEN饮用水饮用12周,则可诱导出用于肝硬化-肝癌影像学研究的PHC大鼠模型,可观察到肝脏癌前病变演变的过程;当予0.01% DEN饮用水饮用14周,则可诱导出用于MR增强观察肝硬化-癌变情况的PHC大鼠模型;当予0.01% DEN饮用水饮用15周,则可稳定诱导出与人类肝癌发展过程相似的PHC模型,且此方法造模后期肿瘤体积较大,对肝癌的早期影像诊断以及肿瘤径线的测量都具有重要意义。(3)造模方法。本研究纳入文献以DEN自由饮用法与DEN腹腔注射法使用居多,此类方法操作方便,成本低,诱癌成功率较高。值得注意的是,皮下注射+自由饮用法以及灌胃法诱癌成功率高达100.0%。皮下注射+自由饮用法由于皮下注射CCL4浓度不同,会导致其作用部位不同,且由于CCL4具有易挥发性,故在实验室中使用不多。而灌胃法由于造模周期长,长期灌胃对大鼠机体有一定损害,易导致口腔和消化道感染等,在实验研究中亦使用较少。皮下注射+自由饮用法使用CCL4联合DEN诱癌,操作难度较低,造模周期短,模型稳定性高,可重复性强,是广泛使用的造模方法。灌胃法较自由饮用法具有给药易控制、死亡率低、诱癌率高等优点,建议作为药物干预和疗效分析的造模方法。(4)造模评价。在纳入的文献中,主要采用了主观评价法和客观评价法对造模结果进行评价。主观评价法[10-11]:随着实验进行,实验大鼠会逐渐出现毛色晦暗、精神萎靡、活动减少、食欲减退、消化不良、体质量下降等表现。在造模过程中观察实验大鼠相关症状出现时间并称取其肝脏的重量,症状出现的时间越早,肝脏的重量越重,则造模成功率越高。该评价方法操作简单、层次清晰,但一些具体细节尚未能统一标准,包括无具体的观察时间点及所需观察时长等。关于病理学评价,陈波和何生[12]通过CCL4+DEN法诱癌,在给药后12周左右解剖大鼠腹部,可见其肝脏明显肿大,肝脏表面可见约0.3 cm大小的结节;通过取肝脏组织制作病理切片,证实为肝硬化-肝癌。该评价方法层次清晰、逻辑分明,可信度高,但操作较繁琐,所需时间较长,成本较高。关于超声影像学评价方法,有研究通过大鼠肝脏超声进行观察,腹部脱毛后予凝胶外涂,通过腹壁获取肝脏及邻近结构的冠状面和矢状面图像,可探及肿瘤,表现为圆形或类似圆形的低回声结节,未见包膜,边界清楚,有明显的声晕,内部回声略不均匀,当肿瘤内部出现坏死时,可表现低回声或无回声[13-15]。该评价方法可动态研究大鼠肝癌模型的形成过程,可以在图像中显示大鼠模型肝癌病变的程度以及范围,对于肝癌的早期研究具有一定帮助。但该评价方法对操作者要求较高,需具备一定的影像学理论基础及操作经验。

3.2各文献评价方法的观察时间点、时长以及大鼠出现症状程度目前无统一标准,笔者建议可采用主观、客观联合评价的方法来对造模结果进行评价,即在诱发大鼠肝癌模型前期(10周之内)主要采用主观评价,间断性对实验大鼠进行称重,观察它们的食欲、毛发、活动以及对外界的刺激等[16];而在造模后第3、6、9周随机挑选大鼠,处死后观察肝脏大小、外形、表面颜色、质地以及病灶情况等以进行客观评价[17-18]。在造模10周后联合影像学方法进行辅助评价,早期可观察到病灶,并显示病灶的部位及大小。在造模晚期(16～18周)开始处死大鼠,取其肝脏观察病变部位并通过病理检查确证PHC大鼠模型的构建结果[19-21]。

综上所述,对于PHC大鼠造模,研究者采用不同的大鼠种类、诱导剂及造模方法,会出现不同的临床症状及病理学特点,造模成功率亦有所差异,可根据研究需求来选择合适的PHC大鼠造模方法。