微生物源示踪技术在食品链中进行污染源追溯的研究进展

樊丽华，王江雪，欧宗沅，张艳茹，张璐瑶，刘诗艺，周自梅，李国梁

（陕西科技大学食品科学与工程学院，陕西 西安 710021）

随着人口快速增长和畜牧养殖业发展，粪便污染问题备受关注。人与动物的粪便通常含有多种肠道病原菌，如甲肝病毒、弧菌、沙门氏菌[1]。而未经处理的人类排泄物和畜禽养殖粪便在任意堆积和排放后，经雨水冲刷、地表径流、地下径流等途径最终会进入湖泊和海洋，从而导致全球水域污染[2]。水体中粪便污染致使每年全球范围内有大量海滩和水产养殖区倒闭、造成食物腐烂、给人类健康造成严重威胁，并带来巨大的经济损失[3]。另外，在发展中国家，很多人将带有病原菌的河流和湖泊作为灌溉水，并将未经处理的粪便作为农业用肥，最终导致直接污染食品原材料[4]。因此，粪便污染是造成从农场到餐桌整个食品链污染的重要因素，直接威胁食品安全。

为监测和控制粪便污染情况发展并及时采取相应干涉措施，传统上会利用与粪便污染具有紧密关联的粪便指示菌，如粪大肠菌、大肠埃希氏杆菌、肠球菌属等指示污染，但这些传统粪便指示物仅能反映环境受粪便污染的程度，并不能判别粪便污染的确切来源，亦不能评价各个污染源的污染贡献率[5]。“治病治其根，治污需溯源”，因此，需要了解粪便污染的源头，以对健康风险进行评估并及时采取相应干涉措施。水体粪便污染主要分为点源污染和非点源污染。点源污染是指粪便污染来源相对比较明确、通过源定位容易控制的污染，主要污染途径有生活与工业污水排放、污水处理厂污水泄漏等[4]。相对于点源污染，非点源污染没有固定排污地点，例如农业化肥、野生动物排泄等[3]。非点源污染因其随机性、散在性、广泛性和多样性等特点给管理和监控造成巨大困难，目前已成为全球水环境、近岸海域及水产品安全监管的瓶颈[6]。为弥补传统粪便污染监测方法的不足，一种识别粪便污染源的新技术，即微生物源示踪（microbial source tracking，MST）技术，已成为近年研究的关注点[7]。MST技术利用指示微生物本身或其特有的基因指纹或宿主特异性分子标记作为污染源的示踪指示物，通过比较受污染样品与可疑粪便源中指示物的差异或其生物指示物的有无判断是否与可疑污染源存在关联，从而确定污染来源。MST技术不仅能识别粪便污染来源，也能评价单一污染源的污染贡献率，为评价水体污染风险、控制最大排放量和制定相关政策提供依据与数据支持[8]。目前，发展中国家在非点源污染的MST领域研究甚少，对于筛选宿主特异性分子标记作为粪便污染源的原创性研究更是几乎空白。从世界范围看，欧美等发达国家在污染源追踪方面的技术均比较先进，其中细菌源追踪技术较成熟。目前为止，MST技术的应用大部分集中在水体中粪便污染源的追溯，但其他方面也有更加广泛的应用，尤其在食源性致病菌的污染源示踪和保证食品安全方面。

本文简要介绍MST的分类，着重阐述非依赖数据库型方法（library-independent methods，LIMs）和分类及基于特异性分子标记物的MST方法在食品链中的应用。还对MST技术进行了展望，以期在应用研究中保证溯源结果更准确。

1 MST的方法

MST技术能高效、快速地识别粪便污染源并及时干预，减少危害的发生[9]。其优势主要体现在：1）将分子生物学、生态学、生物信息学、统计学等学科有机地结合在一起，准确识别环境水域中非点源污染，特别是粪便污染的来源；2）可有效鉴定水体中细菌污染源种类的百分比，判定其来源；3）正确评估非点源污染水体的污染贡献率；4）明确各已知污染源与病原微生物和污染危害之间的相关性；5）用于预测各已知污染源污染物的迁移规律和扩散途径；6）鉴于MST的精确性，其分析结果有助于公共健康的风险管理。MST可分为依赖数据库型方法（library-dependent methods，LDMs）和LIMs 2 类[10]。

1.1 LDMs

LDMs是指纹识别相匹配的过程，主要以微生物抗性指纹或基因多样性指纹图谱建立的指纹图谱库作为判别粪便污染来源的依据。将实际检测得到的未知指纹与已建立图谱库进行对比，最终判断宿主的确切来源。LDMs的关键是建立具有代表性和稳定性的数据库，其质量主要取决于数据库样本量大小、所选用的微生物种类、数据库的代表性及均衡性。

LDMs主要有2 类数据库方法，分别以表现型与基因型为基础。以表现型为基础的数据库方法主要包括微生物抗生素抗性指纹分析[10]、脂肪酸甲酯分析[11]及碳源利用[12]等；以基因型为基础的数据库方法主要包括核酸印迹法、脉冲电场凝胶电泳、扩增片断长度多态性分析、重复序列扩增法、多位点序列分型法、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱等[13]，利用这些方法判别粪便污染来源。

以常用判别分析法的同源相似率作为评价指纹图谱库代表性和准确性的指标[14]。LDMs的优势在于可以对污染源及其污染贡献率进行分析，然而，由于建立数据库需要大量样本，相对比较耗时，且耗费大量人力和物力，导致LDMs的应用受到制约[15]。

1.2 LIMs

LIMs通过检测某一宿主源特异性标志物的有无判别污染存在与否[16]。相比LDMs，LIMs因无需建立数据库且简便快速、精确度高而受到推崇。

LIMs分为依赖培养型方法和非依赖培养型方法2 种（图1），可以根据源特异性菌群进行选择性检测。

图1 基于原核生物核酸检测的LIMs分类Fig.1 LIMs classification based on the detection of nucleic acid in prokaryotes

1.2.1 依赖培养型方法

依赖培养型方法效果直接受培养基的选取及培养条件等因素影响，因此标准化培养条件及相应技术是产生可重复结果的前提[17]。以粪便指示菌为基础的方法利用水样中粪大肠菌类与链球菌的比值（FC/FS）区别人与动物源粪便污染。然而，由于环境中粪大肠菌类与链球菌存活率的不同，FC/FS虽然可以在一定程度上反映粪便污染，但对判别污染源无明显意义。此外，也有部分研究基于选择性培养肠球菌，通过宿主特异性PCR实验对分离的物种进行鉴定以此识别污染。然而，仍没有一种单一的肠球菌能够特异性指示污染源，而基于富集肠球菌后的多重PCR也只能在一定程度上识别污染源[18]；山梨糖醇发酵型双歧杆菌（sorbitol-fermenting bifidobacteria，SFB）方法利用人类修饰型山梨糖醇琼脂培养基，从样品中选择性培养SFB，以此对污染进行识别，此方法被认为是一种非常有前景的人类特异性MST方法并得到广泛应用，然而Bonjoch等[19]指出，SFB在高温和低碱性的水环境中仅能存活很短时间，且对样品的采集要求较高，导致此方法应用受限。嗜粪红球菌法是一种能够对栖息在食草动物粪便中的源指示菌嗜粪红球菌进行选择性富集培养并分析以确定污染源的方法。然而，研究发现该指示菌虽具有较高的宿主粪便特异性且在环境中存活时间较长，但它在粪便中含量较低、培养过程耗时较长，因此该方法在MST实际应用中受到限制。

1.2.2 非依赖培养型方法

与依赖培养型方法不同，非依赖培养型方法主要是通过从样品中提取核酸，进而筛选富集目的片段（大部分为16S rRNA或基因组序列）而建立的方法[20-21]。目前此方法所涉及到的特异性粪便源指示菌主要有拟杆菌群、产甲烷杆菌属、红球菌属、粪杆菌、致病菌肠球菌、埃希氏杆菌属及双歧杆菌等（表1）。

表1 不同宿主的分子标记汇总Table 1 Summary of host-specific markers

1.2.2.1 菌群分析法

非依赖培养型方法主要是利用不同动物宿主粪便中的微生物菌群结构的不同，通过对菌群结构分析判断粪便样品来源。非依赖培养型菌群分析方法根据分析目标分为表型法和基因型方法2 种。

最常用的表型方法是磷脂脂肪酸（phospholipid fatty acids，PLFAs）分析法，该方法的靶标物PLFAs是细胞膜的成分，且大多情况下PLFAs决定着微生物分类。在数据分析中，通常将环境中所有的PLFAs作为整体生物信息源，将特定物种的全部PLFAs或者特定PLFAs所占比例作为目标微生物或环境胁迫的指标来进行污染分析。例如，一些PLFAs可作为具有硫酸盐还原功能菌体的分子标记物，另一些特定脂肪酸还可以指示重度金属污染。

基因型方法是通过宏基因组分析方法对从环境样品中提取的DNA进行直接分析或利用PCR方法从菌群DNA中扩增特异性的分子标记，随后通过对PCR扩增产物进行如克隆测序（构建基因文库）、长度多态性分析（T-RFLP、片段多态性分析、核糖体DNA限制性酶切分析、长度多态片段、自动化的核糖体基因间的间隔分析等）、探针杂交（基因芯片、微阵列等）、DNA变性（DGGE、温度梯度凝胶电泳、单构象链多态）等，从而进行菌群结构分析[36]。基因型方法主要是以16S rRNA为目标建立相应的数据库，且目前已形成了丰富的序列数据及大量数据库，如核糖体数据库项目[37]、绿色基因数据库（greengenes.lbl.gov）。随着计算生物学及生物信息学的发展，可使用的数据库已迅速发展并成为数据处理中一种崭新的工具，且很多基因设备能为菌群分析提供所需特定工具和专业技术知识，为此检测方法的发展奠定了基础[38]。然而该分析方法也存在一定缺陷，如在使用时需考虑DNA提取效率、PCR抑制及测序准确性和综合性。

1.2.2.2 与宿主有关的分子标记方法

目前，获取宿主特异性分子标记的基本方法共有2 种。第1种是从源指示菌中筛选出能在一定程度上指示宿主特异性的基因，根据基因序列设计引物，并对样品粪便DNA进行PCR扩增，最终通过产物序列的分析比对进行宿主来源判断[39]。在这种方法中，目标微生物及其基因和具有代表性的功能基因都是已知的，其中研究最普遍的是16S rRNA基因[40]。相比之下，第2种方法中目标基因未知，通过将宿主与非宿主的粪便DNA进行序列对比分析，挖掘出具有宿主特异性潜力的基因，其中一些基因的功能可能未知。

目前在基于宿主特异性分子标记的LIMs中，研究最多且应用较为广泛的是利用16S rRNA作为分子标记来识别污染源。这些特异性分子标记物主要来自拟杆菌类、双歧杆菌类、普拉梭菌及红球菌属等（表1），其中拟杆菌类的16S rRNA居多[41]。另外，在动物肠道微生物中也存在一些宿主特异性的宿主-微生物互作基因，这些基因已被用于追溯粪便污染源。例如，Shanks等[42]从牛肠道拟杆菌类基因中筛选出宿主-微生物互作基因，能够将牛科粪便污染与其他反刍类动物粪便污染准确区分。这些功能基因被认为与和膜有关的分泌蛋白基因序列存在一定同源性，基于该功能基因所建立检测方法的效果远超过以16S rRNA基因为标记物所建立的方法。类似地，Fan Lihua等[43]利用宏基组学方法，富集筛选出宿主-微生物基因对猪粪便有较高的宿主特异性，以此为分子标记物建立的检测方法能够高灵敏、高特异性地判别和检出污染源。因多型拟杆菌（Bacteroides thetaiotaomicron）在人类肠道中含量丰富且与宿主存在一定程度的共生，因此也具有指示宿主特异性的潜力。Xu Jian等[44]利用B.thetaiotaomicron中参与互作反应的α-1,6-甘露聚糖酶基因作为分子标记用于识别人类粪便污染。一些互作基因是从其他菌群（如大肠杆菌（Escherichia coli））中筛选出[45]。尽管类似于宿主-微生物互作的功能基因表现出较高的宿主特异性，但是相对16S rRNA基因而言互作基因含量相对较低，意味着该基因在MST应用过程中敏感性较差，有待进一步的研究。

有研究指出，致病性E.coli中存在一些毒基因与宿主特异性有关[26]，如腹泻性E.coli的毒性基因，包括牛热不稳定蛋白毒基因IIA（LTIIa）和猪热稳定蛋白毒基因II（STII）、人致病性E.coli的热稳定肠毒素基因（STIb）及屎肠球菌的表面蛋白基因（esp）等。利用上述毒基因为特异性分子标记能分别识别牛[30]、猪[31]及人类粪便[32]污染来源（表1）。也有部分研究利用腹泻E.coli的毒基因建立PCR检测方法以鉴定兔（ralG）、狗（papG III）、鸟（tsh）的粪便污染，但是针对这些宿主所建立的方法在特异性及灵敏性方面还需进一步提高（表1）。

除此之外，还有其他基因存在宿主粪便特异性，并可以作为分子标记进行相应的MST研究[46]。例如，Ram等[47]对β-葡萄糖醛缩酶基因（uidA）片段进行序列分析发现，其中一些等位基因对人类及鸟类粪便表现出一定的特异性，并以此基因作为分子标记开展了相应的微生物溯源研究。古生菌中的产甲烷杆菌也存在一些宿主特异性基因可用于微生物溯源，如基于人类特异性的史氏甲烷短杆菌中的nifH基因、反刍动物特异性的胃瘤甲烷短杆菌中的nifH基因及不能培养的猪粪便特异性产甲烷杆菌mcrA基因[48]（表1）。此外，因各个宿主的消化系统、基因型及饮食结构的不同，一些代谢相关基因也存在一定宿主特异性，然而由于技术问题，以此类基因为目标进行宿主粪便污染的研究相对较少。

2 基于特异性分子标记物的MST方法在食品链中的应用

2.1 基于特异性分子标记物的MST方法在食品淡水源中的应用

灌溉水可作为农业用水，从根本上污染食品原材料。已有研究从灌溉水及其沉积物中分离出多种粪便污染物及病原菌E.coli、沙门氏菌属（Salmonellaspp.）、李斯特菌属（Listeriaspp.）、霍乱弧菌（Vibrio cholerae）及假单胞菌属（Pseudomonasspp.）等[49]。在部分发展中国家，即便有相关法律规定未经严格处理的污水不可用于农业灌溉，但该现象仍十分普遍。因此，识别灌溉水中微生物污染源，对干预并治理污染，从而确保粮食和生鲜果蔬等食品原材料的质量安全有重要意义。Martellini等[50]利用线粒体作为分子标记的MST方法评估所研究地区的农田地表水受粪便污染情况，结果发现，该地区水体在一定程度上受到了人类和动物粪便的污染。García-Aljaro等[51]利用宿主特异性的拟杆菌分子标记建立MST方法，成功区分了人类和反刍动物粪便源，同时将该方法与水质监测模型结合，综合湖中拟杆菌分子标记和病原体（病毒、隐性孢子）的浓度，对因水质污染产生的地方病和流行病发可能性进行了评估。Fan Lihua等[22]利用已建立猪粪便特异性分子1～38和3～53对长江三角洲地区水域进行污染调查，结果发现，部分水域存在粪便污染，且出现了如E.coliO157:H7，沙门氏菌属和弯曲杆菌属（Campylobacterspp.）等病原菌，同时表明，与传统指示菌方法相比，以特异性分子1～38和3～53建立的MST方法能更好指示病原菌污染。类似地，Gomi等[52]利用肠道微生物E.coli中的宿主特异性基因（W_nqrC和W_clsA_2）作为分子标记，用于调查废水微生物质量，结果发现，这2 种分子标记的检测特异性达98.9%，检测结果优于先前以人类肠道微生物E.coli为特异性分子标记物（E.coliH8和E.coliH12）得到的结果[53]。另外，使用未经处理的水源冲洗食品生产设备及接触面也会造成食品污染。Prince-Guerra等[54]采用以拟杆菌16S rRNA为标记物的MST方法对操作人员经水洗涤和消毒后的手部微生物污染效果进行对比分析，结果发现，2 组操作人员受微生物污染的手部残留特异性病原菌无显著差异，即洗涤或消毒对粪便污染的干预效果基本一样。

2.2 基于特异性分子标记物的MST方法在生鲜农产品中的应用

近几十年来，越来越多的食源性疾病与最低限度加工的农产品有关。大多数与生鲜农产品相关的病原菌起源于肠道（粪便）污染，且从农场到餐桌链的任何环节中都有可能发生。目前关于基于特异性分子标记物的MST方法在生鲜农产品中的应用研究多集中在国外，国内几乎处于空白。为调查果蔬类农产品受粪便污染情况，Ravaliya等[55]利用以拟杆菌16S rRNA基因建立的MST方法对生鲜果蔬中潜在的粪便污染进行识别及溯源，结果发现，在174 个样本中，39%的通用拟杆菌标记物（AllBac）呈阳性，其中66%样本来自哈密瓜农场、31%样本来自番茄农场、18%样本来自墨西哥胡椒农场。在68 个AllBac阳性样本中，46%与人类粪便污染有关，与牛粪便无关；同时，该研究结果表明，拟杆菌属标记可作为新鲜农产品生产中粪便污染的替代指标，进而用于确定一般污染和源自人类宿主的污染。隐孢子虫可在多种脊椎动物宿主中引起肠胃炎，Ahlinder等[56]基于传统疾病爆发调查方法与宏基因组分析方法相结合，研究莴苣中小隐孢子虫污染情况和来源。结果表明，基于PCR分型的MST方法在2/3的样本中检测到了小隐孢子虫，且结合MST技术结果认为种植过程中使用的污水是造成莴苣污染的重要来源。类似地，Lee等[57]将分别以人类特异性标记分子（HF183和gyrB）和猪（PF163）、鸡（CP3-49）、牛（BoBac）等动物类特异性标记分子建立的MST方法用于识别生鲜果蔬中粪便污染，结果表明，所有real-time PCR检测都能对受污染的生菜进行可靠检测。该项研究对追溯生鲜果蔬中粪便污染的来源和改善农业操作行为起到重要作用。

研究证明很多乳源性病原菌，如弯曲杆菌属、志贺大肠杆菌、李斯特产单胞菌、沙门氏菌属、耶尔森氏菌等均出现在农场牛乳中[58]。Altalhi等[59]通过E.coli为指示菌以及从E.coli分离菌中筛选的功能性毒基因作为标记物分析沙特阿拉伯西部Taif地区原料乳来源的细菌质量和安全性，从而达到检测粪大肠菌群和E.coli的自然污染情况的目的。虽然特定来源拟杆菌属微生物源追踪标记已被提议作为水体粪便污染评估的替代指标，但尚未被用于评估动物源性食品中粪便污染情况。为调查牛乳和含乳婴幼儿食品受微生物污染的情况，Tsai等[60]利用特定来源的拟杆菌属分析从肯尼亚地区部分供应商手中取得的394 份样品，结果发现，护理人员手工准备的乳中多次检出标记物，而乳制品中标记物检出频率较低。此外，基于拟杆菌属的MST技术在检测乳制品中肠道病原菌方面的敏感性低于传统基于肠杆菌科的检测方法。尽管基于拟杆菌属的MST技术能提供一些关于食品粪便微生物污染的信息，但却无法预测肠道病原菌污染来源。

2.3 基于特异性分子标记物的MST方法在海产品及其养殖环境中的应用

水产养殖环境对水产品质量与安全有重要影响。然而，目前全球范围的非点源污染（主要指人类和动物排泄物）已成为影响水体环境质量、破坏海洋生态以及导致水产品重大安全隐患的主要原因。美国约13%的天然水资源中能检测到来自人类和动物粪便的大量肠道指示菌污染，每年仅由于肠道病原引起的水产品食物中毒事件占食源性疾病的10%以上；而我国仅来自畜禽养殖粪便的污染就占水体污染总量的53%，因肠道致病菌（副溶血性弧菌、沙门氏菌、霍乱弧菌、弯曲杆菌、甲肝病毒、诺如病毒等）引起的水产品食物中毒事件更是屡见不鲜[60-61]。为评估水产养殖环境质量，Liu Rulong等[62]采用限制性片段多态性分析方法将8 个不同宿主（人、牛、猪、马、猫、狗、兔子、鼠）的肠道拟杆菌群16S rRNA基因序列分成6 个宿主特异性末端限制性片段（terminal restriction fragments，TRFs），利用这6 个TRFs建立MST方法，并将其用于香港地区海水中人、牛及猪等粪便污染的调查。结果表明，这6 个TRFs能作为宿主特异性分子标记判别污染来源。此外，近年来采用宿主特异性分子标记方法对水体和软体贝类中人源和动物源粪便进行区分的研究还有很多[63-65]，这些研究一般为基于拟杆菌16S rRNA基因、F特异性RNA噬菌体（F-specific RNA bacteriophages，F+RNA噬菌体）、F+RNA大肠杆菌噬菌体所建立的方法。例如，Gourmelon等[27]采用基于拟杆菌16S rRNA基因的real-time PCR方法和基于特异性F+噬菌体基因分型2 种方法检测海水和贝类中的粪便污染，结果发现，这2 种方法具有较高的特异性和检测灵敏度，是检测沿海地区水域和贝类中粪便污染的有效手段之一。Gyawali等[23]利用3 种特异性分子标记物，包括交叉装配噬菌体（crAssphage）、F+RNA噬菌体基因组II（F+RNA噬菌体GII）和胡椒轻斑驳病毒（PMMoV）对牡蛎和贻贝中的F+RNA噬菌体和诺如病毒污染情况进行调查，发现crAssphage和PMMoV能准确、灵敏地预测诺如病毒污染，然而，相比crAssphage和PMMoV，F+RNA噬菌体GII具有更高的预测特异性。因此，该团队认为crAssphage和F+RNA噬菌体GII结合分析可以对贝类中人粪便和诺如病毒的污染提供可靠的预测。目前还有一些研究是以人和动物肠道病毒基因为标记物进行贝类收获地区粪便污染的检测[24,65]。

3 结论

MST技术是一种能在环境或食品样品中高精度判别不同宿主污染源的粪便指示菌或食源性病原菌的工具，尚处于发展阶段。目前MST方法已得到广泛应用，如用于制定相关法规、管理污染及评估风险。这些应用有助于减少与食品和水质有关的疾病发生，并改善社会公共健康。然而，尽管许多MST方法在实际应用过程中取得了良好的效果，却仍未找到一种最有效的方法，其面临的共同挑战大致可以分为：1）方法本身的局限性，例如，只在一定的地理范围内对污染样品具有较高灵敏性和特异性；2）方法的实际应用性，如稀释样品的灵敏性低、存在抑制物、环境样品中DNA扩增效率低；3）综合信息缺乏，如关于生物体的生态学知识、特异性标记物在环境中持续时间及环境中粪便指示菌与病原菌的关联性等。

为克服以上局限，接下来的微生物溯源研究应更加注重杂交技术、基因测序技术及其他技术之间的相互结合，筛选并开发出具有灵敏性高、特异性强、无交叉反应性等特点的宿主特异性标记物，保证MST技术在实际应用中结果的精确有效。此外，目前大部分MST应用研究均利用单一的宿主特异性标记物对水体或食品链中特定物种进行污染识别和溯源，所建立方法的灵敏度和特异性较低。联合使用多种宿主特异性标记物构建多因子预测模型可明显提高检测的灵敏性和特异性，因此构建高精确度、可以用来判别不同宿主污染来源的预测模型可成为今后研究的重点。