酿酒酵母对浓香型白酒发酵过程中微生物群落演替的影响机制

王双慧，马世源，李子健,2，宋 川，代汉聪，邵 燕，黄 丹,2，罗惠波,2,*

（1.四川轻化工大学生物工程学院，四川 自贡 643000；2.酿酒生物技术及应用四川省重点实验室，四川 自贡 643000；3.四川省泸州市泸州老窖股份有限公司，四川 泸州 646699）

浓香型白酒是传统的固态发酵蒸馏酒，在其独特的酿造系统中，非生物变化结合生物因素驱动微生物组装、演替和自我驯化，最终形成稳定的、具有酿造功能的特殊微生物群落[1]。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是白酒酿造重要的功能菌，具有产醇、产酯等多种功能[2]，缺乏酿酒酵母会导致微生物群落的紊乱，扰动生态系统[3]，最终影响微生物的自然演替。

在长期的白酒酿造过程中，酒醅微生物经历了高度动态的演替变化，包括物种扩散、物种相互作用、物种相对丰度变化和新物种的进化等[4]，形成内外部的动态平衡。然而，环境条件发生变化会破坏原有的微生态平衡，导致微生物群落生态位结构发生变化[5]。通过生物扰动实现环境条件的改变是目前常用的方法，并在描述微生物群落演替及其相互作用方面取得了显著进展[6]。例如，He Guiqiang等[7]发现，添加芽孢杆菌能够提高浓香型白酒微生物系统种间相互作用的多样性和复杂性，Mu Yu等[8]发现微生物的聚集格局和生态位宽度密切相关。然而，微生物群落演替发生变化的机制尚不清楚。研究表明，确定性过程（如生物选择和非生物选择）以及随机性过程（如扩散和漂变）都决定着微生物群落的聚集[9]，对微生物组装过程的分析将有助于对微生物群落演替变化的认识。例如，马静等[10]发现土壤微生物群落组装以确定性过程为主导，同质性选择贡献最大。而决定微生物群落组装的主要驱动力为生态位宽度[11]，生态位宽度是指一个种群（或其他生物单位）在一个群落中所利用的各种不同资源的总和，是影响群落中物种分类相对重要性的关键特征[12]。因此，对于微生物生态位宽度的研究将有助于理解群落演替规律。以往的研究多是关于浓香型白酒中不同的功能微生物对白酒风味等的影响，然而关于酿酒酵母如何影响微生物群落生态位结构而导致群落演替发生变化的研究较少。

本研究以酒醅微生物群落为研究对象，在实验室构建添加酿酒酵母浓香型白酒酿造的多菌共酵体系，采用扩增子测序技术探究对照组和实验组的微生物群落结构变化，利用生物信息统计学分析探究酿酒酵母对微生物群落生态位的影响，从而了解酿酒酵母如何影响微生物群落演替，以期提高对浓香型白酒酿造微生物群落生态系统的认识。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酿酒酵母从浓香型白酒酒醅中筛选得到。入窖酒醅、黄水 四川省某酒厂。

磷酸氢二钾、磷酸二氢钾 成都市科隆化学品有限公司；异丙醇 北京索莱宝科技有限公司；所用试剂均为分析纯；E.Z.N.A.Soil DNA Kit 美国Omega BioTek公司。

1.2 仪器与设备

LYNX 6000高速冷冻离心机、UV-1200紫外分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；PR224ZH电子天平上海奥豪斯仪器有限公司；DZKW-4恒温水浴锅 北京中兴伟业世纪仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 发酵实验

取酒厂的入窖糟醅，分装至灭菌后的磨口瓶中，装瓶量为0.5 kg，加入3%的黄水。将实验组（experiment group，EG）加入质量分数1%糟醅、浓度107CFU/mL的酿酒酵母菌液，空白组（control group，CG）用水补足，分别混合均匀。CG组15 瓶，EG组15 瓶，密封后放入培养箱中发酵。参考生产中酒醅温度变化进行培养，30～33 ℃发酵3 d，33～35 ℃发酵5 d，35～38 ℃发酵15 d，38 ℃发酵至第40天。取发酵0、8、16、23、40 d的样品进行检测和后续分析，样品保存于-80 ℃。

1.3.2 酒醅DNA的提取和测序

称取7 g样品于50 mL离心管中（每个样品称取3 份），加入28 mL磷酸盐缓冲液洗涤后涡旋振荡5 min，室温下100 r/min离心3 min，转移上清液至新的50 mL离心管中，重复洗涤1 次。将转移的上清液于室温下10 000 r/min离心5 min，弃上清液保留沉淀。将沉淀根据E.Z.N.A.Soil DNA Kit的操作说明提取各样品中的DNA。以酒醅总基因组DNA为模板，分别以引物对338F（5′-ACTCCTACGGGA GGCAGCA-3′）、806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）对细菌16S rRNA基因序列中的V3～V4可变区进行扩增[13]，引物对ITS5F（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）、ITS1R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）对真菌ITS1区进行扩增。由上海美吉生物科技有限公司在Illumina MiSeq 2500平台上进行双端测序。

1.4 数据处理

采用Microsoft Office Excel 2016软件进行数据计算，Wilcoxon test对微生物进行显著性分析，零模型分析群落组装机制，使用Cytoscape 3.7.1软件进行网络图绘制，其他数据可视化均使用R语言（V4.2.2）软件和Origin 2021软件完成。

2 结果与分析

2.1 酿酒酵母对酒醅微生物群落结构的影响

2.1.1 酿酒酵母对酒醅微生物多样性的影响

通过多样性指数和主坐标分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）了解酿酒酵母对微生物群落α多样性和β多样性的影响。由图1A、B可知，在发酵过程中，真菌多样性指数变化较小，总体呈逐渐增加后平稳趋势，细菌多样性变化较大，在发酵第8天显著降低，后期逐渐升高趋于平稳。EG的细菌和真菌多样性均低于CG，酿酒酵母降低微生物群落的多样性。由图1C、D可知，PCoA显示EG和CG发酵醅的真菌和细菌群落均有明显分离，差异显著（P＜0.05），其中真菌的差异极显著（P＜0.01），说明酿酒酵母对微生物群落结构组成造成差异，特别是对真菌群落多样性的影响大于细菌群落。微生物多样性和组成在发酵过程中发生很大变化，表明在浓香型白酒发酵过程中酿酒酵母的相对含量会对群落多样性造成影响。

图1 酒醅发酵过程中CG和EG的微生物群落多样性Fig.1 Microbial community diversity in CG and EG during the fermentation of fermented grains

2.1.2 酿酒酵母对酒醅微生物群落相对组成的影响

由图2A可知，从微生物群落组成来看，占比最高的优势真菌物种为子囊菌门（Ascomycota），其次为担子菌门（Basidiomycota），CG和EG的Ascomycota相对丰度无明显差异，但Basidiomycota在EG中的相对丰度较CG稍低。由图2B可知，优势细菌物种为乳酸杆菌（Lactobacillus）、类芽孢杆菌（Paenibacillus）和醋酸杆菌（Acetobacter）。其中，EGLactobacillus相对丰度大于CG，在发酵第8天时相对丰度超过99%，但Paenibacillus在CG中的相对丰度大于EG。由图2C、D可知，发酵过程中，EG和CG共有真菌197 种、细菌243 种，CG的细菌和真菌物种数量均高于EG，表明酿酒酵母降低浓香型白酒发酵过程物种多样性。

图2 酒醅发酵过程中CG和EG的微生物群落组成Fig.2 Microbial community composition in CG and EG during the fermentation of fermented grains

酿酒酵母对微生物群落物种组成造成影响，基于组间差异检验方法（Wilcoxon秩和检验）获得组间具有显著差异的物种信息。CG和EG的差异真菌共15 种，极显著差异真菌有10 种，包括伊萨酵母属（Issatchenkia）、曲霉属（Aspergillus）、酵母属（Saccharomyces）和孢圆酵母属（Torulaspora）等，其中除酿酒酵母外其他极显著差异真菌的相对丰度均为CG高于EG（图3A）。由图3B可知，CG和EG中极显著差异细菌共5 种，包括Acetobacter、湖沉积杆菌属（Limnobacter）、嗜氨菌（Ammoniphilus）、短芽孢杆菌属（Brevibacillus）和unclassified_f__Micrococcaceae，差异细菌的相对丰度均为EG高于CG。结果表明，酿酒酵母会降低浓香型白酒发酵过程中一些物种的相对丰度，使其成为CG和EG的显著差异微生物。酿酒酵母添加后产乙醇和产酸菌等发生显著差异，这可能会导致酒醅群落结构发生变化，对发酵过程中群落生态结构造成影响。

图3 酒醅发酵过程中CG和EG的微生物群落物种差异分析Fig.3 Analysis of differential microbial community species between CG and EG during the fermentation of fermented grains

2.2 酿酒酵母对酒醅微生物生态位的影响

2.2.1 酿酒酵母对酒醅微生物群落生态位宽度的影响

生态位宽度是细菌和真菌群落聚集的主要驱动力[11]，酿酒酵母对浓香型白酒发酵过程中的微生物群落生态位宽度具有影响。由图4可知，CG的真菌和细菌生态位宽度均高于EG，说明酿酒酵母会降低微生物群落的生态位宽度，酿酒酵母对发酵过程中真菌和细菌生态位宽度具有不同程度的影响。其中真菌的生态位宽度高于细菌，并且酿酒酵母明显降低了真菌的生态位宽度。真菌生态位宽度的变化大于细菌，说明酿酒酵母对真菌群落的影响大于细菌。生态位宽度具有显著差异表明其对环境变化具有更高的适应性和抵抗力[8]，并且细菌生态位宽度比真菌窄，说明真菌可以更广泛地利用有效资源[14]。

图4 酿酒酵母对微生物群落生态位宽度变化的影响Fig.4 Effect of Saccharomyces cerevisiae on the change in niche breadth of microbial community

造成生态位宽度降低的原因可能为环境中的可利用资源变丰富，微生物有选择性地利用资源[15]。EG和CG的群落生态位发生变化，EG微生物生态位宽度降低，说明酿酒酵母对群落构建的影响表现在使群落物种间的物种分布相对集中且数量减少，竞争能力变弱，物种对环境变化的敏感度降低[16]，环境耐受性的变化使物种生态位发生变化[17]。这些结果表明，浓香型白酒发酵过程中，微生物受酿酒酵母的影响，生态位宽度发生变化，对环境的敏感程度也发生变化，酿酒酵母的添加扰动微生物的群落构建。

2.2.2 酿酒酵母对酒醅微生物不同生态位宽度类群的影响

微生物物种可根据其适应不同生态位的能力划分为不同的生态类群[18]。为进一步研究生态位宽度的变化，分别研究酿酒酵母对不同生态位宽度类群微生物的影响。将生态位宽度大于3的物种划分为泛化种，生态位宽度小于1.5的物种划分为特化种，其他划分为普通种[19]。

由图5A可知，酿酒酵母影响不同生态位宽度的微生物相对丰度，真菌的泛化种相对丰度由94.4%降低至84.1%，而特化种相对丰度由0.8%增加至3.1%。由图5B可知，细菌的泛化种相对丰度由95.6%降低至82.7%，而特化种相对丰度由1.4%增加至2.7%。由图5C可知，不同类别物种的相对丰度变化也直观地表明EG的普通种含量增加，泛化种的含量减少。群落生态位宽度会直接影响物种丰富度[20]，微生物多样性的变化可能与生态位的变化有关[21]。

图5 酿酒酵母对微生物群落生态位的影响Fig.5 Effect of Saccharomyces cerevisiae on the niche of microbial community

2.2.3 酿酒酵母对酒醅不同生态位宽度类群微生物群落网络结构的影响

特定生态位内微生物会形成复杂的相互作用网络[22]，为多方面研究酿酒酵母与群落中的泛化种、普通种和特化种之间的关系，构建微生物网络。网络分析是量化微生物相互作用的稳健、有效方法[23]，基于Spearman相关性系数的网络包括泛化种、普通种和特化种（P＜0.05，|r|＞0.6）。

由图6A可知，CG的生态位宽度网络共分为4 个模块、52 个节点、106 条边，模块化系数为0.566。由图6B可知，不同生态位宽度的物种分布在各模块，其中模块2和模块4中全是泛化种，特化种仅在模块1中出现，普通种在模块1和模块3中出现。由图6C可知，EG网络中的主要模块数量增加，共分为6 个主要模块、56 个节点、167 条边，模块化系数为0.497。由图6D可知，泛化种除在模块6中不存在外，在其他模块中均存在，且相对丰度最高，特化种在模块1、模块3和模块6中出现且在模块6中的相对丰度最高，普通种在6 个模块中均存在且在模块3中的相对丰度最高。

图6 不同生态位宽度微生物网络Fig.6 Microbial community networks with different niche widths

CG网络主要模块中以泛化种为主，而EG网络主要模块中特化种的相对丰度明显增加。表明在EG网络结构中，特化种可能在维持生态群落的结构和功能方面发挥作用[24]。这些结果说明，酿酒酵母增强了特化种在微生物网络结构中的功能，降低了网络的模块化程度，使得内部竞争降低，加剧了网络的不稳定性[25]，但网络的复杂性增强。不同生态位宽度的物种在不同模块中的分布具有差异，这种差异主要由发酵醅中酿酒酵母的变化解释。

2.3 酿酒酵母对酒醅微生物群落组装的影响

微生物群落的组成和结构变化受组装机制的影响，因此利用组装机制探究酿酒酵母如何影响微生物群落变化。并且微生物的空间周转和群落聚集受不同生态机制调控，因此有必要分析随机过程和确定性过程对微生物群落组装机制的相对贡献[26]。通过零模型分析，综合评价酿酒酵母对发酵过程中微生物群落组装的影响，利用平均最近分类单元指数（β-nearest taxon index，βNTI）量化酿酒酵母对酒醅群落聚集格局的影响[27]。如图7A所示，随机过程（|βNTI|＜2）和确定性过程（|βNTI|＞2）共同决定了微生物群落的聚集，但主要是随机过程主导。

图7 酒醅发酵过程中CG和EG的微生物群落组装Fig.7 Microbial community assembly in CG and EG during the fermentation of fermented grains

为进一步确定不同生态过程对群落组装的贡献，利用Raup-Crick指数（RCbary值）确定不同生态过程的相对重要性[28]。由图7B、C可知，酿酒酵母对群落生态过程具有影响，生态漂移对群落演替的贡献从58.83%降低为46.15%，均匀质扩散从20.59%降低至10.26%，扩散限制从8.82%增加到20.51%，同质选择从0.00%增加至5.13%，异质选择从11.76%增加至17.95%。酿酒酵母提升了扩散限制、同质选择、异质选择3 种生态过程对群落构建的贡献，但降低了生态漂移和均匀质扩散对群落构建的重要性，表明酿酒酵母促使微生物的群落演替更具确定性[29]。

确定性过程和随机过程可以共同调节微生物群落的聚集，对群落组装的相对贡献随环境条件的变化而变化[30]。而酿酒酵母相对含量的变化使得异质选择从无到有，这可能导致群落之间的结构更加相似[31]。结果表明，酿酒酵母能够改变群落的生存环境，从而造成群落组装机制的差异。同时，这种生态位变化、异质性选择等可能会影响微生物之间的相互作用，造成网络模块的差异[32]。由此可知，酿酒酵母对微生物群落多样性、物种组成等的影响可能是由于群落组装机制的变化。

3 结论

酿酒酵母显著改变浓香型白酒发酵过程中酒醅微生物群落结构，扰动浓香型白酒发酵过程中的群落演替。酿酒酵母相对丰度的变化使微生物群落组成发生变化，不但降低微生物群落的多样性，而且降低微生物生态位宽度。但在微生物网络中，酿酒酵母能够增加特化种在主要模块中的相对丰度，增强网络的复杂性。造成微生物群落演替发生上述变化归因于群落组装的变化。微生物组装主要由随机过程主导，但酿酒酵母通过改变漂移和扩散的重要性使组装过程更具确定性。本研究结果揭示了酿酒酵母对浓香型白酒发酵过程中微生物群落演替的影响，但具体的影响机制还有待进一步探索。