牛樟树水提物中促进樟芝无性产孢的效应物鉴定及其添加量优化

李华祥，戴嘉宁，王娟娟，刘泊伶，吉 丹，罗志珊，陆震鸣，杨振泉,*

（1.扬州大学食品科学与工程学院，江苏 扬州 225127；2.江南大学生物工程学院，工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122；3.江南大学 粮食发酵与食品生物制造国家工程研究中心，江苏 无锡 214122）

樟芝（Antrodia cinnamomea），又名牛樟芝或牛樟菇，是一种珍稀药食两用真菌，隶属于担子菌门（Basidiomycetes）、多孔菌科（Polyporaceae）、薄孔菌属（Antrodia）[1-2]，具有保肝护肝[3]、抗癌、抗肿瘤[4]、降血糖、降血压、抗病毒[5]、抑菌[6]、调节免疫及调节肠道菌群[7-8]等多种功效。目前，樟芝的人工培养方式主要有椴木栽培、平皿培养、固态发酵和液态发酵（又称深层发酵）[9]。其中，采用樟芝深层发酵所产生的无性孢子（即节孢子）接种取代传统菌丝接种的樟芝深层发酵工艺由于具有接种量及种子质量可控、批次稳定性好、发酵周期短、活性物质产量高及易于规模化等优点，已成为目前最高效、最受欢迎的樟芝人工培养方式[9-11]。但是，该发酵工艺仍然存在不足，尤其是作为接种物的樟芝无性孢子产量较低，进而导致种子制备过程繁琐耗时，并大幅增加了生产成本[12-13]。因此，提高樟芝深层发酵产孢量对提高樟芝深层发酵生产效益及促进樟芝大规模工业化生产的发展至关重要。基于此，本团队前期也对促进樟芝深层发酵无性产孢效应因子筛选及其作用机制进行了大量研究[12-16]。

牛樟树（Cinnamomum kanehiraeHay）是樟属植物的一种，也是野生牛樟芝唯一的天然寄主，通常生长在气候温暖湿润及土壤肥沃的高海拔地区[17-18]。牛樟树本身具有抑菌、防腐、抗癌等功效[18-20]。此外，Zhang Zhang等[21]发现，在平皿培养樟芝时添加牛樟树枝匀浆，可提高樟芝菌丝体中的三萜含量。转录组学分析发现，牛樟树匀浆通过调节参与三萜生物合成的关键基因HMGR和SQS的表达来促进三萜合成；Zeng Wenwen等[22]发现，在固态发酵樟芝时添加牛樟树叶乙醇提取物可有效促进樟芝菌丝体的生长及酚类化合物的合成；同时，Hsu等[23]发现，香樟树枝水提物中的多糖类物质显著促进樟芝菌丝体生长；Lu Zhenming等[24]发现，低质量浓度（0.05 g/L）的香樟树枝石油醚提取物显著促进樟芝深层发酵菌丝生长及三萜类物质的合成。以上研究证明，牛樟树或其他樟属植物中存在一些促进樟芝生长、繁殖或活性产物合成的物质。目前已从牛樟树的树干或树叶中分离到香豆素、类固醇、木脂素、芝麻素、芫花素、苯甲酸-2-甲基丙酯等物质[20,25-26]。

本团队前期研究了牛樟树木屑的4 种溶剂（水、甲醇、乙酸乙酯及石油醚）提取物对樟芝深层发酵无性产孢的影响，结果表明，只有牛樟树水提物（aqueous extract ofC.kanehiraeHay，CWE）显著促进樟芝无性产孢，且在最佳质量浓度（60 μg/mL）下使樟芝产孢量较对照组（不添加CWE）提高58%左右[27]。但前期研究未对CWE中促进樟芝无性产孢效应物进行分离及鉴定等深入研究。因此，为了进一步完善上述研究，本研究采用液相色谱-质谱联用（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）分析法对CWE的不同有机溶剂萃取物进行成分分析，并对相关化合物促进樟芝无性产孢的效果进行验证，最终明确CWE中促进樟芝无性产孢的物质并优化其最佳添加量，为进一步提高樟芝深层发酵无性孢子产量及促进樟芝深层发酵工业化生产提供理论依据和实践基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

樟芝菌株购自美国菌种保藏中心，编号为ATCC200183。

野生牛樟树枯木 福建皓天生物科技有限公司；赤藓糖醇（纯度98%）、甜菜碱（纯度98%）北京索莱宝科技有限公司；正丁醇、乙酸乙酯、氯仿、葡萄糖、酵母粉、硫酸镁及磷酸二氢钾等常规试剂（均为分析纯）国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

BSA124S电子天平 苏州江东精密仪器有限公司；YXQ-50SII高压蒸汽灭菌锅 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；XSP-18A显微镜 上海彼爱姆光学仪器制造有限公司；QT-3多功能摇床 上海琪特分析仪器有限公司；TG-16WS高速离心机 湖南湘仪离心机仪器有限公司；RE-52B旋转蒸发仪 上海雅蓉生物仪器设备有限公司；DGX-9053B-2烘箱 上海福玛实验设备有限公司；Dionex Ultimate 3000 LC-MS仪 美国赛默飞世尔科技公司。

1.3 方法

1.3.1 CWE的制备

准确称取20 g牛樟树木屑，加入400 mL去离子水，90 ℃水浴提取3 h后，用4 层纱布过滤并收集滤液。重复提取3 次，合并滤液并离心（6 000 r/min、10 min、4 ℃）收集上清，再用旋转蒸发仪将上清浓缩至黏稠状后，75 ℃烘干并称质量，即得CWE。用去离子水复溶CWE并使其最终质量浓度为10 mg/mL，即得CWE母液，分装成10 mL每管后保存于-20 ℃冰箱中备用[27]。

1.3.2 CWE醇沉及萃取

1.3.2.1 CWE醇沉

取10 mL CWE母液，加入30 mL无水乙醇，混匀后于4 ℃冰箱静置过夜，8 000 r/min离心10 min（4 ℃），分别收集上清和沉淀部分。其中，上清液部分置于75 ℃烘箱中浓缩至10 mL（若体积不足则用去离子水定容），即得CWE醇沉上清液；沉淀部分置于75 ℃烘箱中干燥后用去离子水复溶并定容至10 mL，即得CWE醇沉沉淀溶液。将CWE醇沉上清液和沉淀溶液保存于4 ℃冰箱中备用。

1.3.2.2 上清液分级萃取

将10 mL上清液与10 mL正丁醇振荡（200 r/min）混合30 min后，加入分液漏斗中静置分层，收集上层正丁醇萃取相，75 ℃烘干后即得上清液正丁醇萃取物DCE；再将下层水相与乙酸乙酯等体积振荡（200 r/min）混合30 min后，加入分液漏斗中静置分层，收集上层乙酸乙酯萃取相，75 ℃烘干后即得上清液乙酸乙酯萃取物YZE；下层水相继续与氯仿等体积振荡（200 r/min）混合30 min，分液漏斗分层后，收集下层氯仿萃取相，75 ℃烘干后即得上清液氯仿萃取物LFE；上层水相浓缩烘干后，即为上清液萃取剩余物WTE。

1.3.3 上清液萃取物LC-MS检测分析

将上述DCE、YZE、LFE及WTE分别用去离子水配制成质量浓度为20 mg/L的溶液，用0.22 μm微孔滤膜过滤后，取适量滤液加入检测瓶进行LC-MS检测分析，检测条件[28]为：色谱条件：色谱柱：

ACQUITY UPLC®HSS T3（2.1×150 mm，1.8 µm）；自动进样器温度8 ℃；流速0.25 mL/min；柱温40 ℃；进样量2 μL；流动相：正离子0.1%甲酸溶液（C）-0.1%甲酸-乙腈（D），负离子5 mmol/L甲酸铵溶 液（A ）-乙腈（B ）；梯度洗脱程序：0～1 min，2% B/D；1～9 min，2%～50% B/D；9～12 min，50%～98% B/D；12～13.5 min，98% B/D；13.5～14 min，9 8%～2% B/D；14～20 min，2% D（正模式）（14～17 min，2% B（负模式））。质谱条件：仪器使用电喷雾离子源，正负离子电离模式，正离子喷雾电压为3.50 kV，负离子喷雾电压为2.50 kV，鞘气压力30 arb，辅助气压力10 arb。毛细管温度325 ℃，以分辨率60 000进行全扫描，扫描范围m/z81～1 000，并采用高能碰撞解离进行二级裂解，碰撞能为30 eV，同时采用动态排除去除无必要的MS/MS信息。

1.3.4 樟芝深层发酵培养

将樟芝无性孢子按1.0×106个/mL接种到装有100 mL液体培养基（含葡萄糖20 g/L、酵母粉2 g/L、MgSO4•7H2O 3 g/L、KH2PO43 g/L，pH 4.5）的500 mL锥形瓶中，于摇床中26 ℃、150 r/min培养11 d[29]。

1.3.5 CWE不同组分对樟芝深层发酵产孢量的影响

1.3.5.1 不同醇沉组分对产孢量的影响

将1.3.1节制备的CWE母液及1.3.2.1节CWE醇沉上清液和沉淀溶液用0.45 µm无菌微孔滤膜过滤除菌后，分别吸取600 µL加入100 mL灭菌冷却后的液体培养基中（各组分终质量浓度均为60 µg/mL），再按1.3.4节方法进行接种和发酵培养，从第6天开始每日定时取样检测产孢量，以添加等体积（600 µL）去离子水作为空白对照。

1.3.5.2 不同上清液萃取组分对产孢量的影响

将1.3.2.2节CWE分级萃取后的4 个组分（DCE、YZE、LFE及WTE）分别用去离子水配制成质量浓度为10 mg/mL的母液，用0.45 µm无菌微孔滤膜过滤除菌后，分别吸取100、300、500 µL加入100 mL灭菌冷却后的液体培养基中（各组分终质量浓度分别为10、30、50 µg/mL），再按1.3.4节方法进行接种和发酵培养，从第6天开始每日定时取样检测产孢量，以添加500 µL去离子水作为空白对照。

1.3.6 甜菜碱和赤藓糖醇对樟芝深层发酵产孢量的影响

1.3.6.1 不同质量浓度的甜菜碱对樟芝产孢量的影响

将甜菜碱用去离子水配制成质量浓度为5 mg/mL的原液，再用去离子水分别稀释至原液质量浓度的1/5及1/25，将原液和所有稀释液用0.45 µm微孔滤膜过滤除菌后，分别吸取100 µL加入100 mL灭菌冷却后的液体培养基中（甜菜碱终质量浓度分别为0.2、1.0、5.0 µg/mL），再按1.3.4节方法进行接种和发酵培养，从第6天开始每日定时取样检测产孢量，以添加等体积（100 µL）去离子水作为空白对照。

1.3.6.2 不同质量浓度的赤藓糖醇对樟芝深层发酵的影响

将赤藓糖醇用去离子水配制成质量浓度为5 mg/mL的原液，再用去离子水分别稀释至原液质量浓度的1/2、1/5、1/10及1/20，将原液和所有稀释液用0.45 µm微孔滤膜过滤除菌后，分别吸取200 µL加入100 mL灭菌冷却后的液体培养基中（赤藓糖醇终质量浓度分别为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 µg/mL），再按1.3.4节方法进行接种和发酵培养，以添加等体积（200 µL）去离子水作为空白对照。从第6天开始每日定时取样检测产孢量。发酵结束（11 d）后，检测对照组和赤藓糖醇最佳添加质量浓度组的生物量、胞内多糖产量及总三萜产量等指标。

1.3.7 樟芝深层发酵相关指标测定

1.3.7.1 产孢量和生物量测定

发酵结束后的发酵液用4 层纱布过滤，取适量滤液用血球计数板于光学显微镜下对樟芝节孢子进行计数并计算产孢量，单位为个/mL；同时，滤渣（即樟芝菌丝体）用去离子水冲洗3 遍后，放入75 ℃烘箱中烘干并称质量，计算生物量，单位为g/L[27]。

1.3.7.2 胞内多糖和总三萜产量测定

将测完生物量的樟芝菌丝体粉碎后，准确称取2 g加入10 mL蒸馏水，95 ℃水浴提取2 h，收集上清。重复提取3 次并合并上清，用旋转蒸发仪浓缩至10 mL左右，再加入3 倍体积的无水乙醇，混匀后放入4 ℃冰箱中静置过夜，8 000 r/min离心10 min（4 ℃），收集沉淀并置于75 ℃烘箱中烘干，称质量并计算胞内多糖产量[27]。同时，采用香草醛-高氯酸法测定樟芝菌丝体中总三萜含量。总三萜用甲醇提取，采用分光光度计在550 nm波长处检测吸光度，以齐墩果酸为标准品绘制标准曲线，根据标准曲线及生物量计算总三萜产量[27]。

1.4 数据处理

每组实验均设置3 个生物重复，所有数据均采用平均值±标准差表示，采用Origin Pro 8.5软件进行绘图，采用SPSS 22.0软件及单因素方差分析法进行差异显著性分析，差异显著水平为P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 牛樟树水提物醇沉上清和沉淀对樟芝产孢量的影响

前期研究发现，在培养基中添加60 μg/mL的CWE可显著促进樟芝深层发酵无性产孢，产孢量较对照组提高58%左右[27]。由图1可知，CWE醇沉沉淀对樟芝产孢量无明显影响，而CWE醇沉上清明显促进樟芝无性产孢且促进效果与CWE相当。可见，CWE中的效应物主要存在于CWE醇沉上清中。

图1 CWE不同醇沉组分对樟芝产孢量的影响Fig.1 Effects of different fractions obtained from CWE by alcohol precipitation on the sporulation of A.cinnamomea

2.2 牛樟树水提物醇沉上清萃取物对樟芝产孢量的影响

由图2可知，10～50 μg/mL WTE对樟芝无性产孢均无任何促进效果，说明效应物已被萃取到有机溶剂中，在萃取剩余物中已无残留或残留量甚微；添加10～50 μg/mL的DCE对樟芝产孢亦无任何促进效果，相反，高质量浓度（50 μg/mL）的DEC明显抑制樟芝产孢，说明DCE中几乎不含效应物，甚至含有抑制樟芝无性产孢的物质；添加10～50 μg/mL的YZE和LFE均明显促进樟芝无性产孢，且LFE的促进效果优于YZE。其中，YZE的最佳添加质量浓度为50 μg/mL，此时樟芝最大产孢量（6.33×107个/mL）较对照组提高35.35%；LFE的最佳添加质量浓度为30 μg/mL，此时樟芝最大产孢量（7.10×107个/mL）较对照组提高52.02%。上述结果表明，效应物主要存在于YZE和LFE中，且在LFE中的含量（质量分数）明显高于YZE。

图2 不同质量浓度的DCE（A）、YZE（B）、LFE（C）及WTE（D）对樟芝产孢量的影响Fig.2 Effects of different concentrations of DCE (A),YZE (B),LFE (C)and WTE (D) on the sporulation of A.cinnamomea

2.3 上清液分级萃取组分LC-MS分析

为明确CWE中促进樟芝无性产孢的主要效应物，对CWE醇沉上清的4 个萃取组分进行LC-MS检测分析，每个组分中质量分数排名前10的物质信息见表1。

表1 CWE醇沉上清液分级萃取组分中含量排名前10的物质Table 1 Top 10 most abundant compounds in different fractions obtained from the supernatant after alcohol precipitation of CWE

综合表1和图2的结果可知，LFE和YZE均明显促进樟芝无性产孢，而LFE中质量分数较高（10%以上）的物质分别为赤藓糖醇和7-甲氧基香豆素，YZE中质量分数较高（6%以上）的物质分别为甲吡唑、赤藓糖醇和甜菜碱。因此，效应物应为赤藓糖醇、7-甲氧基香豆素、甲吡唑和甜菜碱中的一种或几种。DCE和WTE均无任何促樟芝无性产孢效果，而DCE和WTE中质量分数最高（13%以上）的物质均为甲吡唑，因此，可以确定甲吡唑并非效应物。同时，高质量浓度的DCE明显抑制樟芝无性产孢（图2），可见甲吡唑对樟芝无性产孢可能有抑制作用。此外，YZE中质量分数最高的物质也是甲吡唑，而LFE中甲吡唑的质量分数相对较低（排名第6），这解释了LFE促进樟芝无性产孢的效果明显优于YZE的原因。YZE中质量分数排名前10的物质并无7-甲氧基香豆素，LC-MS检测7-甲氧基香豆素在YZE中的质量分数仅为0.37%。可见，7-甲氧基香豆素并非效应物。在促进樟芝无性产孢效果最好的LFE中，质量分数最高的物质为赤藓糖醇，达12.78%。在促进樟芝无性产孢效果仅次于LFE的YZE中，赤藓糖醇的质量分数排名第2，为6.78%。此外，有文献报道，以赤藓糖醇为碳源可以显著促进哈茨木霉（Trichoderma harzianum）和棘孢木霉（Trichoderma asperellum）分生孢子的产生[30]。因此，赤藓糖醇可能为CWE中促进樟芝深层发酵无性产孢的主要效应物；甜菜碱在YZE中的质量分数与赤藓糖醇相当，均为6%以上。在LFE中，甜菜碱的质量分数也在3%以上。因此，甜菜碱亦可能为效应物之一，但尚需进一步验证。

2.4 不同质量浓度赤藓糖醇和甜菜碱对樟芝深层发酵的影响

为验证赤藓糖醇和甜菜碱对樟芝深层发酵无性产孢是否具有促进作用，考察不同质量浓度商用赤藓糖醇和甜菜碱对樟芝深层发酵无性产孢量的影响。由图3可知，添加1.0 μg/mL甜菜碱对樟芝深层发酵无性产孢有轻微促进作用，最大产孢量较对照组提高7.36%，但二者之间并无显著差异。可见，甜菜碱对樟芝深层发酵无性产孢无显著促进作用。相反，高质量浓度（5.0 μg/mL）的甜菜碱对樟芝深层发酵无性产孢有明显抑制作用。此外，添加1.0、2.0 μg/mL的赤藓糖醇均明显提高樟芝深层发酵无性孢子产量。其中，添加1.0 μg/mL的赤藓糖醇时，最大产孢量达6.78×107个/mL，较对照组提高55.17%，促进效果较为明显；添加2.0 μg/mL的赤藓糖醇对樟芝无性产孢的促进效果略低于1.0 μg/mL；但当赤藓糖醇的添加质量浓度高于5.0 μg/mL时，则对樟芝无性产孢表现出明显的抑制效果，产孢量大幅下降。

图3 不同质量浓度的赤藓糖醇（A）和甜菜碱（B）对樟芝产孢量的影响Fig.3 Effects of different concentrations of erythritol (A) and betaine (B)on the sporulation of A.cinnamomea

综上所述，赤藓糖醇确为CWE中促进樟芝深层发酵无性产孢的主要效应物，但促进效果具有严重的浓度依赖性。最适添加质量浓度范围为1.0～2.0 μg/mL。当添加质量浓度过低（≤0.5 μg/mL）时，无明显促进效果；当添加质量浓度过高（≥5.0 μg/mL）时，则表现出明显抑制效果。

最后，考察赤藓糖醇在最佳添加质量浓度（1.0 μg/mL）下对樟芝深层发酵生物量、胞内多糖产量及总三萜产量的影响。由表2可知，添加1.0 μg/mL的赤藓糖醇对樟芝深层发酵过程中菌丝体的生长有显著促进作用（P＜0.05），使生物量较对照组提高18.65%。同时，赤藓糖醇对樟芝胞内多糖的合成具有较为显著促进作用（P＜0.05），使胞内多糖产量较对照组提高260.13%，效果极其可观。但是，赤藓糖醇对樟芝深层发酵总三萜的合成及产量无显著影响。

表2 赤藓糖醇对樟芝深层发酵活性物质产量的影响Table 2 Effect of erythritol on the biomass and bioactive substance yield from A.cinnamomea in submerged fermentation

3 结论

CWE中促进樟芝深层发酵无性产孢的主要效应物为赤藓糖醇，其最佳添加质量浓度为1.0 μg/mL，使樟芝产孢量较对照组提高55.17%。此外，1.0 μg/mL的赤藓糖醇还显著促进樟芝深层发酵过程中菌丝体生长及胞内多糖的合成，使胞内多糖产量较对照组提高260.13%，效果较为显著。本研究成果可大幅提高樟芝深层发酵工业化生产过程中种子制备效率及胞内多糖生产效率，对推动樟芝深层发酵工业化生产进程具有重要意义。