分子动力学结合拉曼光谱评价乳液界面蛋白结构变化

何冬雪，冯紫蓝，申铉日，裴志胜,,3,*

（1.海南大学食品科学与工程学院，海南 海口 570228；2.海南热带海洋学院食品科学与工程学院，海南 三亚 572022；3.海南热带海洋学院 海南省院士团队创新中心，海南省海洋食品工程技术研究中心，海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心，海南 三亚 572022）

罗非鱼是我国重要的淡水养殖品种鱼之一，也是我国主要的养殖经济鱼类，有繁殖速度快、产量高、营养丰富等特点，但其加工形式单一、附加值低，仍具有很大发展潜力[1]。罗非鱼肌肉中的主要成分之一是肌原纤维蛋白（myofibrillar protein，MP），MP含量占蛋白质总量的50%～70%[2]。MP因同时具有亲水和亲油性，在乳化过程中能够自发吸附到油-水界面，降低界面张力并为乳液提供物理及化学稳定性，是良好的乳化剂和稳定剂[3]。

乳液是由一种或多种物质分散在一种液体中所形成的分散体，通常由分散相和连续相组成，分散相为油相，连续相为水相[4]。乳液的稳定性取决于吸附在油-水界面上的乳化剂，主要与吸附剂颗粒的物理化学性质和界面层的黏弹性行为有关[5]。有研究表明，蛋白质是食品中的生物大分子物质，能够吸附在油-水界面，形成界面膜稳定油滴，在稳定乳液中起到重要作用[6]。油-水界面上蛋白质的物理、化学和结构特征决定了乳液表面活性，同时与产品最终的稳定性紧密相关[7-8]。

目前，越来越多研究人员致力于研究蛋白质吸附到油-水界面后结构变化与乳液稳定性之间的联系。离心、悬滴分析、蛋白质光谱分析等方法已经被应用于界面吸附蛋白质浓度和结构变化的研究[9]。每种方法都有其对应特点，但都不能适用于所有样品体系。为此，研究人员不断探索新型技术，以更深入、全面地了解蛋白质结构。近年来，随着科学技术的高速发展，科学家们开始借助计算机科学技术对蛋白质构象进行更深层次的动态模拟分析。分子动力学（molecular dynamics，MD）模拟是使用计算机模拟并观察蛋白质大分子或小分子及其体系相互作用的一种方法。MD模拟不仅可以从分子水平上对蛋白质进行整体结构观察，还可以揭示蛋白质分子在时间尺度上的动态变化[10]。蛋白质MD模拟突出了分子在体系中的变化，可以用来识别蛋白质分子在乳液形成过程中空间构象变化[11]。

在最近一项研究中，肌球蛋白模型被用于计算机MD模拟，以探究油的极性对乳液界面MP构象和乳液稳定性的影响，得到的结果与实验结果一致[12]。Ferrari等[13]提出油-水界面系统的分子模型，并对油-水界面上的蛋白质结构变化进行探究，结果表明，MD模拟能够正确描述蛋白质在油-水界面的行为。此外，Wang Haitang[14]、Wu Zhicheng[15]、Dong Ming[16]等均使用肌球蛋白模型进行了MD模拟，探究MP在不同条件和不同体系中的结构变化，说明在MD模拟中，肌球蛋白模型可以用来研究MP结构。这些研究中虽研究体系不统一，但方法和结果也适用于食品乳液体系。

目前，已有吸附到油-水界面后蛋白质分布、结构相关研究，但使用MD模拟对油-水界面蛋白质结构的相关研究仍然有限。本课题前期研究结果显示，水相中MP质量分数为1.5%时，当油相体积分数为68%时，能够有效包裹油滴，并抑制油滴的聚结和破裂，形成稳定的水包油乳液，具有良好的界面稳定性；当油相体积分数大于70%时，乳液界面平衡接近临界点，观察到明显油水分离，此时蛋白质膜几乎无法保持完整[17]。在此基础上，本研究使用罗非鱼MP和玉米油制备乳液，以界面蛋白质作为研究对象，探究其结构变化与乳液界面层稳定性的关系。首先使用同源建模获得肌球蛋白模型，然后利用MD模拟乳液形成过程中表面肌球蛋白从初始到最终3D结构构象的变化。最后结合拉曼光谱分析MP二级结构及其侧链微环境变化，获得更准确的乳化过程油-水界面MP结构与乳液界面层稳定性的关系。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

冷冻罗非鱼片（（150±10）g）海南翔泰渔业有限公司；金龙鱼玉米胚芽油（不饱和脂肪酸质量分数为80%～85%）益海嘉里（武汉）粮油工业有限公司；氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠（均为分析纯）上海麦克林生化科技有限公司。

1.2 仪器与设备

XHF-DY高速分散器 宁波新芝生物科技股份有限公司；DXR2拉曼光谱仪 美国Thermo Fisher公司；B302光学显微镜 重庆奥特光学仪器有限责任公司；T6紫外-可见分光光度计 北京普析通用公司。

1.3 方法

1.3.1 MP提取

使用本实验室提供的方法提取罗非鱼MP[17]。将罗非鱼片解冻后切成小块，打碎至无颗粒状，加入等质量低盐磷酸盐缓冲液（0.05 mol/L NaCl、3.38 mmol/L NaH2PO4·2H2O、15.5 mmol/L Na2HPO4·12H2O、pH 7.5），在4 000 r/min、4 ℃、10 min条件下离心，去除上清液，以上步骤重复3 次，去除血水等杂质。然后与3 倍质量高盐磷酸盐缓冲液（0.6 mol/L NaCl、3.38 mmol/L NaH2PO4·2H2O、15.5 mmol/L Na2HPO4·12H2O、pH 7.5）混合均匀，置于4 ℃条件下反应过夜。最后加入5 倍鱼肉质量的清水，在10 000 r/min、4 ℃条件下离心25 min，去除大部分水分和水溶性杂质后得到MP湿样品。使用双缩脲法测定蛋白质含量[18]，确保得到的蛋白质量分数为10%～11%。样品应于24 h内使用完毕。

1.3.2 乳液制备

将MP溶解在5 g超纯水中，混合均匀，制备MP质量分数1.5%的溶液。然后将不同质量的玉米油加入MP溶液，于7 000 r/min均质2 min，得到油相体积分数为0%、10%、68%、70%的乳液。根据本课题组前期研究结果[17]，对乳液体系界面蛋白结构变化进行研究。

1.3.3 微观结构观察

将乳液滴于载玻片上，用盖玻片压住样品，排出多余气泡，置于光学显微镜的载物台上，用40 倍物镜对样品进行观察和拍照。

1.3.4 MD模拟

蛋白质建模：从UniProt数据库中获取罗非鱼肌球蛋白序列，工具检索目标结构模板使用NCBI PSI-BLAST算法[19]。根据物种、序列覆盖率/概率、E值和序列同一性百分比等质量参数的计算结果，获得最佳模板（PDB ID：2BKI）。肌球蛋白的3D模型使用AllHModel模式进行100 次建模，重复10 次循环直到molpdf＞1×106。每个模型都先经过优化，然后分别使用MD和模拟退火算法进行细化[20]。最后再使用算法对最优模型进行精修，使用MD模拟程序在373.15 K和1.0 bar条件下进行100 ns模拟，得到肌球蛋白乳液蛋白模型。

油水混合的罗非鱼肌球蛋白体系搭建和MD模拟：从PubChem数据库下载玉米油中主要不饱和脂肪酸（亚油酸和油酸）的3D结构。为保证模型的准确性，使用Avogadro程序对油相分子的3D结构进行几何优化。然后使用Packmol程序构建油水混合的罗非鱼肌球蛋白体系模型（油相体积分数分别为10%、68%、70%），得到对应的模型用于后续MD模拟。

使用GROMACS 21.3软件分析MD模拟过程蛋白分子二级结构的变化。首先使能量最小化（1 000.0 kJ/（mol·nm），然后采用共轭梯度优化（100.0 kJ/（mol·nm））进行第2次能量最小化。随后，使用正则系综（1 ns）和等温等压系综（1 ss）相继对系统进行预平衡。所有系统均采用100 ns MD模拟。时间步长为2 fs，每1.0 ps收集一次快照。MD模拟后，使用GROMACS 19.6分析轨迹变化。最后，选取80～100 ns的结果对肌球蛋白二级结构变化进行计算和分析，使用DSSP程序和VMD程序对肌球蛋白进行构象变化和可视化分析。

1.3.5 拉曼光谱测定

参考王正雯等[21]的方法，稍作修改。将乳液样品置于载玻片上，盖上盖玻片进行测定。使用20 倍聚焦镜头，在激光器波长532 nm、激发功率10 mW、狭缝孔径50 μm、曝光时间10 s和扫描范围400～3 500 cm-1条件下对样品进行测定，每个样品取3 个不同位点扫描。使用配套软件对拉曼光谱进行基线校正和内标（苯丙氨基酸残基（1 004±2）cm-1）归一化处理。最后使用Peakfit 4.12软件计算样品拉曼光谱峰面积，以确定蛋白质结构特征。

1.4 数据处理

所有实验均进行3 次平行测定，结果以平均值±标准差表示。使用Origin 2018软件绘图，使用SPSS 22.0软件对数据进行显著性分析，P＜0.05表示样品间具有显著差异。

2 结果与分析

2.1 MD模拟结果分析

2.1.1 模型质量评估结果

建模获得的肌球蛋白乳液蛋白模型可以使用拉氏图和Verify 3D评价结果来评估其准确性和合理性[22]。罗非鱼肌球蛋白氨基酸序列与建模获得的肌球蛋白乳液蛋白模型的氨基酸序列对比如图1A所示，对模型进行评估得到的拉氏图如图1B所示，有666 个（89.0%）氨基酸残基处于红色区域，71 个（9.5%）氨基酸残基处于黄色区域，9 个（1.2%）氨基酸残基处于浅黄色区域，处于白色区域的氨基酸残基只有2 个，占全部氨基酸残基的0.3%。通常认为允许区（包括红色核心最适区、黄色最大允许区和浅黄色一般允许区）内的氨基酸残基含量大于90%即可认为该氨基酸具有良好的构象。可见，该肌球蛋白的空间构象模型具有一定准确性且合理。有研究者对PSE（pale,soft and exudative）鸡肉MP的肌球蛋白进行同源建模，模型中97.8%的氨基酸残基位于允许区，与本研究结果相近，说明本研究中同源建模结果具有准确性[23]。此外，Verify 3D检验要求至少80%氨基酸残基的平均3D-1D分值不小于0.2[24]，图1C显示，肌球蛋白模型中有88.59%氨基酸残基平均3D-1D值≥0.2，Verify 3D检验通过。综上所述，肌球蛋白建模的拉氏图和Verify 3D指标评价合理，因此，可以认为该肌球蛋白模型结构合理，可以进行分子对接。

图1 肌球蛋白模型的质量评估结果Fig.1 Quality evaluation results of myosin model

2.1.2 MD乳液蛋白空间构象变化分析

通过可视化得到肌球蛋白3D结构图像，由图2、3可知，α-螺旋构象贯穿整个蛋白质分子，起主干作用，是蛋白质结构的重要组成部分，有利于蛋白质保水性和凝胶性。β-折叠穿插于主干中间部分，其他结构则无规则、不定量随机分布在整个蛋白质分子内部及周围。不同油相体积分数乳液界面肌球蛋白在0～100 ns模拟期间不停运动，蛋白质大分子构象转变和空间结构变化发生了明显活动轨迹。蛋白质分子在不同构象之间转化较少，但是在空间位置上有比较明显的变化。肌球蛋白从初始构象到最终构象变化的位置大致相同，主要分布在蛋白质分子顶端、右端和连接尾部位置。主要变化位置观察到大部分是由β-折叠、β-转角转变为无规卷曲，显示出较少α-螺旋结构变化，说明界面蛋白质具有稳定的主链结构。有研究表明，无规卷曲结构数量增多对蛋白质吸附于油-水界面起到积极作用[9]，说明MD模拟的肌球蛋白结构变化与乳液形成过程蛋白质结构倾向变化相符。

图2 不同油相体积分数乳液体系的微观结构及其对应的肌球蛋白3D结构Fig.2 Microstructure of emulsion systems with different proportions of oil phase and 3D structure of myosin in them

图3 不同油相体积分数乳液体系中肌球蛋白最终构象与起始构象叠合和局部放大图Fig.3 Superposition and local zoom-in of final and initial conformation of myosin in emulsion systems with different proportions of oil phase

值得注意的是，在不同油相体系中，蛋白质在连接尾部位置表现出明显的不同构象变化。在油相体积分数为68%的乳液体系中，会发生α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲之间的相互转变。从微观结构可以看出，蛋白吸附到油-水界面可以形成蛋白质膜将液滴包裹，此时乳液体系的液滴粒径较均匀（图2B）。MD模拟显示该蛋白质含有较多的色氨酸（tryptophan，Trp）和酪氨酸（tyrosine，Tyr）残基，乳液体系也相对稳定。在油相体积分数70%乳液体系中，蛋白结构中只有少量α-螺旋结构和无规卷曲结构发生转换。此时观察到乳液为破乳状态，这是由于蛋白质界面遭到破坏，油脂溢出形成大油滴、乳液结构被破坏。油-水界面完全被破坏，油滴大量聚集，乳液失去稳定性，可能由该部位氨基酸残基变化引起的蛋白质构象变化导致。由图4可知，油相体积分数为70%乳液中，界面蛋白氨基酸残基的均方根波动（root mean square fluctuation，RMSF）变化最大，且位于395～410位的氨基酸残基RMSF变化最大，说明蛋白质柔性不稳定[25]。此外，乳化剂能够乳化的油脂有限，当油相体积分数较高时，可能会导致油滴增大，进一步导致界面膜解吸和塌陷，降低乳液稳定性，也会产生破乳现象[17,26]。Wu Longkun等[27]研究结果显示，油滴粒径增大、蛋白质膜被破坏，会导致液滴聚集。

图4 不同油相体积分数乳液体系中肌球蛋白氨基酸残基的RMSFFig.4 Root mean square fluctuation values of amino acid residues of myosin in emulsion systems with different proportions of oil phase

2.1.3 MD乳液蛋白二级结构含量变化分析

图5反映了0～100 ns时间内肌球蛋白二级结构随模拟时间的变化。分子模型预测的肌球蛋白在80～100 ns内的二级结构含量如表1所示。MD模型中80～100 ns期间，在不同油相体积分数乳液中罗非鱼肌球蛋白α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲相对含量存在一定差异，这可能会导致不同油相体积分数乳液体系中存在不同数量的化学键和作用力。

表1 基于分子模型预测的80～100 ns肌球蛋白二级结构相对含量Table 1 Relative contents of secondary structures in myosin during 80–100 ns based on molecular model prediction %

图5 MD模拟0～100 ns肌球蛋白结构分布Fig.5 MD simulation of the distribution of myosin conformation in 0–100 ns

MD模拟显示，每个体系在80～100 ns的轨迹变化中，α-螺旋结构在油相体积分数为68%时相对含量最低（P＜0.05），在70%时又有所回升；相反地，β-转角和无规卷曲结构在油相体积分数为68%时相对含量最高（P＜0.05）。β-折叠、β-转角的含量变化可能是由蛋白结构中的共价键和氢键变化导致[28]。油相体积分数变化导致乳液体系中β-折叠/转角结构相对含量稍微上升或下降，但变化范围不大，氢键数量随模拟时间的变化（图6A）也印证了这一结果。β-折叠和β-转角结构相对含量变化说明在乳液体系中蛋白结构处于比较松散的状态。研究表明，β-折叠和β-转角结构与蛋白的聚集状态有关，其比例越高，代表蛋白聚集度越高，反之则说明结构越松散[29]。研究显示，适度松散的蛋白质结构可以促进疏水基团暴露，对蛋白质油脂乳化具有积极作用[30]。同时，分子模型模拟轨迹预测结果显示，油相体积分数为68%时，肌球蛋白α-螺旋存在结构解离，使疏水性氨基酸残基暴露，疏水性增加，这与溶剂可及表面积（solvent accessible surface area，SASA）的结果一致（图6B）。

图6 模拟时间80～100 ns的氢键数量（A）和SASA（B）变化Fig.6 Changes of hydrogen bond (A) and SASA (B) for 80–100 ns simulation

在油-水界面，不同大小的蛋白质聚集体的形成会使表面疏水性、巯基、氢键含量等发生不同的变化，从而导致蛋白质结构发生变化[31]。蛋白质结构变化导致其乳化性质变化，进一步影响乳液的形成和稳定。由图6B可知，在乳液体系中，SASA均显著高于纯蛋白质（P＜0.05）。当油相体积分数为68%时，蛋白质SASA达到最高，氢键数量没有明显下降。说明在适当的水相和油相环境中，埋藏的疏水性残基暴露在极性溶剂表面，使蛋白质结构发生正向变化，这对肌球蛋白乳液体系的稳定性具有促进作用。在相似研究中，SASA被用来分析猪肉MP的疏水性，结果表明，SASA越大，对应MP的疏水性越强[14]。

2.2 拉曼光谱分析

2.2.1 乳液体系中蛋白质主链特征结构的拉曼光谱分析

拉曼光谱不仅可以提供蛋白质主链二级结构的信息，还可以探索有关蛋白质侧链微环境和化学变化的相关信息[32]。由图7可知，不同乳液体系中，界面MP在1 600～1 700 cm-1区域具有很强烈的酰胺I带吸收峰，这一区域的谱带能够提供丰富的关于蛋白质二级结构的信息。其中1 600～1 640 cm-1表示β-折叠，1 640～1 650 cm-1表示无规卷曲、1 650～1 660 cm-1表示α-螺旋，1 660～1 700 cm-1表示β-转角。通过拉曼光谱酰胺I带高斯曲线拟合以及定量计算特征峰的峰面积得到蛋白质二级结构分布结果如图7B所示。蛋白质二级结构是指多肽主链的局部折叠模式，主要通过N—H和C＝O基团之间的氢键维持稳定[33]。研究表明，蛋白质从水溶液中吸附到油-水界面时，结构可能更倾向于向α-螺旋结构转变[34]。蛋白质高斯拟合图（图7C～E）显示，蛋白质二级结构中α-螺旋结构占据较大比例。图7B显示了相同的结果，这与MD模拟结果（表1和图2）一致。不同的是，油相体积分数为68%时，乳液界面MP结构中α-螺旋结构的比例最大，可能是由于MP中还存在少量的肌动蛋白、原肌球蛋白和肌原蛋白。

图7 不同油相体积分数乳液体系中界面MP的拉曼光谱图（A）、二级结构相对含量（B）及乳液界面蛋白质的高斯拟合图（C～E）Fig.7 Raman spectra (A),secondary structure composition (B),and Gaussian fitting (C–E) of MP adsorbed at the interface of emulsion systems with different proportions of oil phase

此外，β-折叠和β-转角在MP的二级结构中也占据了较大比例，大约为40%，略高于MD模拟结果。导致该现象发生最有可能的原因有2 个：一是计算机和仪器存在不可避免的系统误差；二是油-水界面上蛋白质结构不完全同一，不同部位的界面蛋白可能存在不同的蛋白质结构。由图7B可知，在油相体积分数为68%和70%的乳液体系中，α-螺旋构象相对含量有所上升，同时也导致β-折叠和β-转角结构相对含量下降。这一结果表明，乳液体系中油相体积分数增大，促进了蛋白质解折叠，形成螺旋结构。这一结果与分子模型预测的SASA（图6B）结果相对应。通常情况下，β-折叠和α-螺旋通过蛋白质分子肽链之间的氢键维持稳定，蛋白质聚集改善了疏水环境，促进MP解折叠[35]。但在高油相体积分数的MP乳液体系中，蛋白质发生解折叠的数量差异不大，说明高油相体积分数乳液体系中不同的疏水环境对MP发生解折叠没有起到显著作用。

2.2.2 乳液体系中蛋白质侧链特征结构的拉曼光谱分析

在乳液系统中，蛋白质是很好的乳化剂和稳定剂。这是由于蛋白质具有优良的表面性质，如亲油性、亲水性、高表面活性和疏水性氨基酸[36]。Trp和Tyr是2 种芳香族疏水氨基酸，主要参与水分子膜界面蛋白质的折叠过程[37]。Trp残基是其他氨基酸残基中最大的侧链，分析其在蛋白质拉曼光谱中的强带对蛋白质二级结构解析具有重要意义[33]。Trp残基的微环境变化可在拉曼光谱中760、1 340 cm-1处的特征峰观察到。由图8A可知，在油相体积分数为68%时，760、1 340 cm-1处具有较高的特征峰强度，说明Trp残基环的伸缩振动，离开极性水溶液，被暴露在疏水环境中[38]。Trp残基从极性环境中的包埋状态向疏水环境中的暴露状态转变，疏水性增大。在黄油、猪油和大豆油与MP制备的乳液中观察到形成了具有更稳定乳化层的大豆油乳液[39]。此外，这一结果与分子模型在80～100 ns模拟过程中的SASA（图6B）变化相对应。

图8 Trp和Tyr残基的特征峰强度（A）和200～600 cm-1的拉曼光谱图（B）Fig.8 Characteristic peak intensities (A) and Raman spectra in the range of 200–600 cm-1 (B) of Trp and Tyr residues

Trp和Tyr残基特征峰强度变化均体现了乳液体系中蛋白质侧链的微环境变化。蛋白分子表面的Tyr残基通常呈暴露状态或包埋状态，处于暴露状态时可以与H2O结合，这与疏水微环境有关。拉曼光谱850、830 cm-1附近的特征峰强度变化体现了Tyr的费米共振，其变化是由于蛋白质侧链微环境发生改变。当I850/I830≥1时，表示Tyr残基在疏水环境中处于暴露状态；当I850/I830＜1时，表示Tyr残基在疏水环境中处于包埋状态。图8A结果显示，所有乳液体系中，I850/I830均大于1，说明MP的Tyr残基在疏水环境中为暴露状态。此时Tyr残基可作为氢键的供体或受体与水结合，从而改善疏水环境。

油相体积分数70%的乳液体系中，Tyr残基同样暴露于疏水环境中，但体系不稳定。疏水性氨基酸残基的变化反映了先前MD模拟分析的结果，存在氢键的断裂和生成，表明蛋白质内部暴露的疏水基团促进了蛋白质结构展开。但疏水性和亲水性之间的相互作用可能会导致I850/I830的显著变化，因此还需要通过其他形式辅助才能更准确地分析蛋白质分子表面Tyr残基变化情况[40]。

500～550 cm-1的拉曼光谱归属于二硫键（S—S）。在此范围内的构象有：500～510 cm-1处为gauche gauche-gauche（g-g-g）构象的S—S 拉伸带，515～525 cm-1处为gauche-gauche-trans（g-g-t）构象的S—S拉伸带，535～545 cm-1处为trans-gauche-trans（t-g-t）构象的S—S拉伸带。g-g-g构象的谱带表明MP中的一些二硫键处于较低势能构象，t-g-t构象的谱带是由于存在胱氨酸残基构象转变或者Trp脂肪族侧链的C—H弯曲振动。由图8B可知，在拉曼光谱中，无法观察到明显属于S—S的特征谱带，这可能是由于水分子存在，放宽谱带掩盖了S—S和C—H键产生的谱带[32]。

3 结论

为更准确研究不同油脂体积分数乳液体系中蛋白质的结构变化，使用MD模拟结合拉曼光谱对乳液体系表面MP的构象变化进行分析。结果显示：α-螺旋结构（相对含量48%左右）是蛋白质二级结构的重要组成部分，β-转角、β-折叠和无规卷曲相对含量均为10%～26%；肌球蛋白3D空间结构显示，最终蛋白构象与初始构象相比，主要体现在空间位置发生变化；此外，不同油脂体积分数体系的蛋白质在相似位置也发生了不同构象变化，差距较大的是界面蛋白在连接尾部位置观察到更多二级结构和空间构象变化，当油相体积分数增大，β-转角和β-折叠数量下降，促进了乳液体系中蛋白质解折叠并向α-螺旋转变。

疏水性氨基酸残基的变化说明蛋白质存在离子键和氢键的合成与断裂，进一步说明蛋白质结构的展开情况以及内部疏水基团的暴露情况。较稳定的乳液体系中，肌球蛋白SASA较大，Trp和Tyr残基暴露程度也大于其他体系，说明MP的Tyr残基暴露于疏水环境，Trp残基从包埋状态转变成暴露状态，疏水相互作用增强，氢键数量增多。但是拉曼光谱中S—S特征峰没有明显谱带，可能是由于蛋白质中含有微量的胱氨酸残基和C—H弯曲振动及水分子的存在。总的来说，MP乳液体系油-水界面蛋白质主要通过改变结构构象和SASA促进Trp和Tyr附近微环境变化，改善内部分子之间的氢键和疏水相互作用，从而提高乳液的稳定性。该研究阐明了MP在乳液界面的结构变化，为使用罗非鱼MP制备稳定乳液及其应用提供了有价值的信息。