青香蕉果肉多酚成分鉴定及其对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用

王 倩，王 娟，傅金凤，盛 鸥

（1.华南理工大学食品科学与工程学院，广东 广州 510641；2.广东省农业科学院果树研究所，农业农村部南亚热带果树生物学与遗传资源利用重点实验室，广东省热带亚热带果树研究重点实验室，广东 广州 510640；3.广东省香蕉精深加工与综合利用工程技术研究中心，广东 广州 510641）

香蕉（Musaspp.）为芭蕉科芭蕉属植物，栽培区域广泛[1]，因其果肉香甜、细腻可口，深受消费者青睐。香蕉中含有多种生物活性物质，如多酚、低聚糖、抗性淀粉等[2-4]。多酚种类繁多，结构复杂，是植物体内的次生代谢产物[5]，多酚成分鉴定对明晰其生物活性具有重要意义。多酚是香蕉的重要活性成分，Pongsagon等[6]通过液相色谱-质谱联用技术从香蕉多酚提取物中鉴定出柚皮苷、杨梅素糖苷和芦丁等多酚类化合物。Jimenez等[7]从Plantain香蕉（Musaparadisiaca）果肉中提取得到槲皮素、儿茶素和没食子酸。研究表明，多酚能够预防和治疗代谢相关疾病，如改善糖脂代谢紊乱、降血糖等[8-11]，这可能与多酚对淀粉消化酶的抑制有关（如改变酶的二级结构、疏水相互作用等）[12-13]，通过抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性、减少葡萄糖的产生和吸收等方式控制餐后血糖水平。Bhinge等[14]研究发现，香蕉果肉的乙醇提取物可抑制α-淀粉酶活性及葡萄糖扩散，从而实现降血糖效果。Plantain香蕉的甲醇提取物可降低糖尿病小鼠血糖浓度，且喂食剂量与降血糖效果显著相关，其作用机制可能与机体内的葡萄糖利用有关[15]。同时，傅金凤[16]前期研究发现，青香蕉粉干预能有效降低糖尿病大鼠初期空腹血糖，改善糖尿病症状，而多酚对淀粉消化酶的抑制作用可能是青香蕉降血糖的作用途径之一。

为了解香蕉多酚的组成，初步探究其在青香蕉降血糖功能方面的作用，本研究采用大孔吸附树脂纯化香蕉果肉多酚，再通过超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱联用（ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole-Exactive Orbitrap-mass spectrometry，UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS）技术鉴定其多酚组成，然后以阿卡波糖为阳性对照，分析香蕉果肉多酚对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用和抑制类型。旨在提供香蕉果肉多酚组成的基础数据，了解其对淀粉消化酶的影响，为香蕉资源的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

青香蕉（Musaspp.Dajiao ABB group）购于广东省广州市农贸市场。青香蕉用乙烯利催熟，在黑暗密封环境中放置，按催熟时间取样，以催熟当天为第0天，连续取样7 d。经实验测定，发现第3天的果肉多酚含量最高，因此取催熟后第3天的香蕉果肉为实验材料，取果肉，液氮冷冻打粉，-80 ℃保存备用。

H-60大孔吸附树脂 江苏和成新材料科技有限公司；福林-酚试剂、α-淀粉酶（3 700 U/g）、3,5-二硝基水杨酸显色剂 北京索莱宝科技有限公司；α-葡萄糖苷酶（50 U/mg）、对硝基苯-α-D-葡萄糖苷（纯度≥98%）、对硝基苯酚 上海麦克林生物试剂有限公司；D(+)-无水葡萄糖（纯度≥98%）上海源叶生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

KQ-300DE超声波清洗机 昆山市超声仪器有限公司；RE-52AA旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；721可见分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司；Citation 5酶标仪 美国BioTek公司；LGJ冷冻干燥机 北京松源华兴科技有限公司；UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS仪美国赛默飞世尔科技公司。

1.3 方法

1.3.1 香蕉果肉多酚提取

香蕉果肉多酚提取及分离纯化：超声辅助乙醇法提取→旋转蒸发浓缩→粗提物→大孔吸附树脂纯化→旋转蒸发浓缩→冷冻干燥→纯化样品

超声辅助乙醇提取香蕉多酚，提取条件为乙醇体积分数70%、料液比（g/mL）1∶30、提取温度20 ℃、提取时间10 min，提取液真空抽滤，滤液经减压浓缩除去乙醇，收集得到多酚粗提液。采用大孔吸附树脂对多酚粗提液进行纯化，收集得到多酚纯化液，经减压浓缩后冷冻干燥，得到香蕉果肉多酚纯化样品。

1.3.2 香蕉果肉多酚成分鉴定

参照Li Wenfeng等[17]的方法，取10 mg香蕉果肉多酚纯化样品冻干粉末，制得1 mg/mL样品液于4 ℃条件下8 000 r/min离心10 min，上清液过0.22 µm有机微孔滤膜。UPLC条件：Agilent PoroShell HPH-C18色谱柱（2.1 mm×150 mm，4 µm），流动相A为超纯水（含1‰甲酸），流动相B为乙腈（含1‰甲酸），流速0.3 mL/min，柱温30 ℃，进样体积5 µL；梯度洗脱，程序如表1所示。

表1 洗脱程序Table 1 Elution program

MS条件：负离子模式下运行的电喷雾电离源，保护气（N2）压力30 arb，辅助气（N2）压力10 arb，毛细管电压3 200 V，毛细管温度320 ℃，扫描范围100～1 500m/z。

1.3.3 香蕉果肉多酚对α-淀粉酶的抑制作用分析

1.3.3.1 对α-淀粉酶活性的抑制作用

按照潘玥等[18]方法稍作修改，依次移取50 µL不同质量浓度（0.125、0.250、0.500、1.000、2.000 mg/mL）香蕉果肉多酚样品溶液、50 μg/mLα-淀粉酶溶液、磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）共100 µL于10 mL试管中，混匀后在37 ℃水浴锅中水浴10 min，加入100 µL 10 mg/mL可溶性淀粉溶液，再次水浴10 min后加入150 µL 3,5-二硝基水杨酸显色剂，沸水浴10 min后加入5 mL蒸馏水稀释，在540 nm波长处测定吸光度。以阿卡波糖（与香蕉果肉多酚样品液质量浓度一致）为阳性对照，以不加PBS的反应体系为实验组（α-淀粉酶溶液50 µL+香蕉多酚样品溶液50 µL+PBS 0 µL，反应体系共100 µL，其他组以此类推），不加酶的反应体系为背景组，不加抑制剂的反应体系为阴性对照组，不加酶和抑制剂的反应体系为空白组，按式（1）[19]计算抑制率，根据抑制曲线计算得到半抑制质量浓度（half inhibitory concentration，IC50）。

式中：A1为实验组吸光度；A2为背景组吸光度；A3为阴性对照组吸光度；A4为空白组吸光度。

1.3.3.2 对α-淀粉酶的抑制类型及抑制常数测定

参考赵一灵[20]的方法并作适当修改，以确定香蕉果肉多酚对α-淀粉酶的抑制类型和抑制常数。设置香蕉果肉多酚溶液质量浓度为0.0～2.0 mg/mL，可溶性淀粉溶液质量浓度为1.25～15.00 mg/mL，以1.3.3.1节中实验组为反应体系测定吸光度。配制0.125～8.000 mg/mL葡萄糖标准溶液，以质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得到标准曲线回归方程为y＝0.183 5x+0.014 6（R2＝0.999 1）。将反应体系吸光度代入标准曲线计算葡萄糖产生量，按式（2）[21]计算酶促反应初速率。

式中：v0为酶促反应初速率/（mg/（mL·min））；t为反应时间/min；c为反应体系中反应产物质量浓度/（mg/mL）。

以1/v0为纵坐标，底物浓度的倒数1/[S]为横坐标，绘制Lineweaver-Burk双倒数曲线，确定α-淀粉酶抑制反应类型，通过米氏方程（3）和双倒数方程（4）分别计算α-淀粉酶的米氏常数（Km）及最大反应速率（vm）[22]。

式中：vm为最大反应速率/（mg/（mL·min））；[S]为底物质量浓度/（mg/mL）；Km为米氏常数/（mg/mL）。

根据中间复合物假说，利用Lineweaver-Burk双倒数作图法，将米氏方程两边取倒数，可以得到方程式（4）。

采用混合型抑制Dixon方程（5）[23]进一步验证抑制类型并确定抑制剂对酶的解离常数（KI）与抑制剂对酶-底物复合物的解离常数（KIS）。

式中：I为抑制剂浓度/（mg/mL）。

1.3.4 香蕉果肉多酚对α-葡萄糖苷酶的抑制作用分析

1.3.4.1 对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

参考辛相余[24]的方法并稍作更改。移取40 µL不同质量浓度（5、10、20、40、80、160、320 µg/mL）香蕉多酚样品溶液、0.4 U/mLα-葡萄糖苷酶溶液、PBS共80 µL于96 孔板中，混匀后在37 ℃水浴锅中水浴10 min，加入80 µL 6 mmol/L对硝基苯-α-D-葡萄糖苷溶液，5 min后于酶标仪中测定405 nm波长处吸光度，实验分组及抑制率计算公式与1.3.3.1节一致，并绘制抑制率折线图。

1.3.4.2 对α-葡萄糖苷酶的抑制类型及抑制常数测定

实验方法与1.3.4.1节一致，以实验组为反应体系测定吸光度，设置香蕉果肉多酚质量浓度为20～80 µg/mL，对硝基苯-α-D-葡萄糖苷质量浓度为0.5～8.0 mmol/L。以50～400 µmol/L对硝基苯酚标准溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得到标准曲线为y＝0.009 4x+0.068 6（R2＝0.999 3）。通过绘制反应体系的Lineweaver-Burk双倒数曲线确定对α-葡萄糖苷酶抑制反应类型，各抑制动力学参数按式（2）～（5）计算。

1.4 数据处理

采用SPSS 13.0软件中的LSD检验进行显著性分析，采用Xcalibur 4.2软件处理质谱数据，采用ChemDraw软件绘制化学结构式。

2 结果与分析

2.1 香蕉果肉多酚组成

香蕉多酚提取物在负离子模式下的色谱峰分布如图1所示，按出峰前后标注出28 个色谱峰，根据保留时间、一级碎片和二级碎片离子信息对化合物进行定性分析，经与标准品库、文献和人类代谢组数据库比对，碎片信息和初步鉴定的单体组成见表2。

图1 香蕉多酚提取物总离子流图Fig.1 Total ion current chromatogram of polyphenols extracted from banana pulp

表2 香蕉多酚提取物成分分析Table 2 Compositional analysis of polyphenols extracted from banana pulp

通过与标准品比对保留时间、母离子和二级碎片离子m/z鉴定出16 种化合物，包括苯甲酸、柠檬酸、香兰素和13 种多酚类化合物。以化合物16为例，该化合物在图1中的保留时间为9.26 min，有母离子m/z463[M-H]-，丢失糖基碎片m/z162，产生苷元碎片m/z301 [A-H]-和m/z301 [A-2H]-，与金丝桃苷标准品的数据[25-26]相符，因此确定化合物16为金丝桃苷。以同样方式鉴定出13 种多酚，包括酚酸类化合物（没食子酸、原儿茶酸、丁香酸、对羟基肉桂酸和异阿魏酸）和黄酮类化合物（秦皮乙素、芦丁、丁香醛、金丝桃苷、紫云英苷、柚皮苷、橙皮苷和没食子儿茶素）。此外，鉴定出的苯甲酸是酚酸化合物（苯甲酸衍生物）的母体结构。

通过与文献、数据库比对，鉴定出其他12 种化合物。化合物3在m/z145处有[M-H]-母离子峰、碎片离子m/z101，二者与郝元元[27]对香豆素的鉴定结果一致，因此推测化合物3为香豆素。化合物5有母离子m/z137[M-H]-，产生碎片离子m/z93 [M-H-CO2]-，与杨婉等[28]鉴定出的对羟基苯甲酸碎片一致，因此推测化合物5为对羟基苯甲酸。化合物7在负离子模式下产生母离子m/z289，碎片离子m/z245 [M-H-CO2]-，与白芍药[29]中儿茶素的质谱信息相符，因此推测化合物7为儿茶素。化合物13母离子[M-H]-m/z为385，失去1 个己糖苷（m/z162）得到碎片离子m/z223，是芥子酸苷元碎片，与Xavier等[30]鉴定的芥子酸-己糖苷结果一致，因此推测化合物13为芥子酸-己糖苷。化合物14在m/z639处有[M-H]-母离子，产生碎片离子m/z331、m/z315，与文献[31]中3′-甲基-杨梅素-3-O-芸香糖苷的碎片相符，其中m/z331是甲基杨梅素特征母离子，m/z316[A-CH3]-为杨梅素特征母离子，因此推测化合物14为3′-甲基-杨梅素-3-O-芸香糖苷。化合物17（m/z259 [M-H]-）、24（m/z243 [M-H]-）、28（m/z277 [M-H]-）的相关碎片离子信息与金丹等[32]对安石榴苷代谢产物的研究结果一致，因此分别被鉴定为尿石素D、尿石素C和尿石素A。化合物18母离子为m/z593，失去1 个m/z309的中性片段，产生m/z285的二级碎片离子[M-H-308]-，为山柰酚苷元离子[33]，根据相对分子质量初步判断m/z308中性片段为芸香糖苷[34]，再结合文献[35]对高羊茅中山柰酚-3-O芸香苷的质谱分析结果，推测化合物18为山柰酚-3-O-芸香苷。化合物19在m/z623处有[M-H]-母离子，产生碎片离子m/z477、m/z315，与文献[36]报道的荷花花瓣中的异鼠李素-3-O-芸香苷碎片信息相符，其中m/z315为异鼠李素苷元碎片，m/z477 [M-H-146]-为母离子丢失鼠李糖基中性片段产生的碎片离子，因此推测化合物19为异鼠李素-3-O-芸香糖苷化合物。化合物26 [M-H]-的m/z为301，碎片离子m/z为227，通过与文献[32]中鞣花酸的质谱结果比对，被鉴定为鞣花酸。化合物27在图1中峰面积最大，二级质谱图（图2A）及可能的裂解途径如图2B所示，母离子m/z329[M-H]-，碎片离子m/z311由母离子脱去1 个水分子得到，继续脱去1 个水分子得到m/z293碎片离子，进而失去1 个酯基和2 个甲基产生碎片离子m/z229，与文献[32,37]报道的二甲基鞣花酸质谱结果相符，因此推测化合物27为二甲基鞣花酸。

图2 二甲基鞣花酸质谱图Fig.2 Mass spectrum of dimethylellagic acid

与文献及数据库比对鉴定出的12 种化合物包括鞣花酸代谢产物（尿石素D、尿石素C和尿石素A）、香豆素和8 种多酚类化合物。多酚类化合物包括酚酸类化合物（对羟基苯甲酸、芥子酸-己糖苷）、黄酮类化合物（3′-甲基-杨梅素-3-O-芸香糖苷、山柰酚-3-O-芸香苷、异鼠李素-3-O-芸香糖苷），以及单宁类化合物（儿茶素、鞣花酸、二甲基-鞣花酸）。香豆素是多酚类化合物中香豆素衍生物的母体结构。尿石素D、尿石素C和尿石素A属于鞣花酸的代谢产物。

二甲基鞣花酸属于单宁，尿石素A是鞣花单宁的代谢产物，二者为香蕉多酚提取物的主要色谱峰，说明香蕉多酚中含有丰富的单宁类化合物。单宁类化合物常见于未成熟的柿子、红葡萄和石榴[38-40]等水果中，具有涩味。本研究中，青蕉果肉中丰富的单宁类化合物可能是令其产生涩味的原因[41]，随着果实的成熟，单宁类化合物发生变化，涩味也逐渐消失。

综上所述，利用UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS技术在香蕉果肉多酚提取物中共鉴定出28 种化合物。通过美国化学文摘数据库CA检索发现，香蕉果肉中曾鉴定出没食子酸[42]、橙皮苷[43]、奎宁酸[44]、柚皮苷、芦丁[6]、对羟基苯甲酸、异阿魏酸、原儿茶酸、丁香酸[45]、儿茶素、槲皮素[46]等多酚类化合物，而秦皮乙素、金丝桃苷、紫云英苷3 种多酚的报道较少。

2.2 香蕉果肉多酚对淀粉消化酶的抑制作用

α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶是能量吸收的关键酶，作用于淀粉的α-1,4糖苷键，前者随机水解，后者顺序水解，释放葡萄糖为产物，引起机体血糖升高[47]。糖尿病是一种以高血糖为特征的代谢性疾病，临床上检测药物对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用是初步判断药物是否具有降糖效果的常用方法[48]。

2.2.1 对α-淀粉酶的抑制作用

香蕉果肉多酚提取物（以下简称香蕉多酚）对α-淀粉酶的抑制效果如图3A所示，随着质量浓度的增加，香蕉多酚对α-淀粉酶的抑制率呈现先升高后平缓的趋势，在质量浓度0.125～2.000 mg/mL范围内，阿卡波糖对α-淀粉酶的抑制率高于香蕉多酚，IC50分别为0.15、0.53 mg/mL。香蕉多酚对α-淀粉酶活性的抑制作用弱于阿卡波糖，但抑制剂质量浓度为1.0 mg/mL时，二者抑制率差异不显著，分别为（76.25±3.79）%和（82.75±2.29）%，因此，香蕉多酚对α-淀粉酶具有较好的抑制效果，可作为潜在的α-淀粉酶抑制剂。

图3 香蕉多酚对α-淀粉酶的抑制作用Fig.3 Inhibitory effect of banana polyphenols on α-amylase

在不同质量浓度香蕉多酚的双倒数图中（图3B），各直线相交于第3象限。文献报道，随着抑制剂质量浓度的增加，vm和Km均减小，为反竞争性-非竞争性混合抑制作用特征[49]。香蕉多酚对α-淀粉酶的抑制作用与上述特征相符，推断为反竞争性-非竞争性混合抑制。以Lineweaver-Burk方程（表3）的纵截距（1/vm）和斜率（Km/vm）对香蕉多酚质量浓度作图（图3C、D），结合公式（5）计算得到香蕉多酚对酶-底物复合物的解离常数（KIS）及对α-淀粉酶的解离常数（KI）分别为0.705、2.823 mg/mL。研究表明，解离常数越小，复合物的结合越紧密[22]，本研究中香蕉多酚KIS＜KI，说明香蕉多酚对酶-底物复合物的亲和力强于对游离α-淀粉酶的亲和力，能够通过与酶-底物复合物结合阻止淀粉分解为葡萄糖，从而产生降血糖效果。

表3 不同质量浓度香蕉多酚对α-淀粉酶抑制作用的Lineweaver-Burk方程Table 3 Lineweaver-Burk equation for the inhibition effect of banana polyphenols at different mass concentration on α-amylase

2.2.2 对α-葡萄糖苷酶的抑制作用

香蕉多酚对α-葡萄糖苷酶的抑制效果如图4A所示，随着质量浓度的增加，香蕉多酚对α-葡萄糖苷酶的抑制率呈先上升后平缓的趋势，当质量浓度相同时，阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制率高于香蕉多酚，但随着质量浓度继续增加，二者差距逐渐减小。经计算，阿卡波糖和香蕉多酚的IC50分别为3.41、35.76 µg/mL，阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制能力优于香蕉多酚，但质量浓度为160 µg/mL时，二者抑制率分别为（96.59±0.01）%和（92.54±0.69）%，无显著差异，因此，香蕉多酚是潜在的α-葡萄糖苷酶抑制剂。

图4 香蕉多酚对α-葡萄糖苷酶的抑制作用Fig.4 Inhibitory effect of banana polyphenols on α-glucosidase

随着抑制剂质量浓度的升高，Km升高，而vm降低，各浓度的抑制直线相交于第2象限，为竞争性-非竞争性混合抑制的典型特征[50]，香蕉多酚对α-葡萄糖苷酶的抑制曲线符合该特征（图4B），由此推测为竞争性-非竞争性混合抑制。香蕉多酚抑制α-葡萄糖苷酶的Lineweaver-Burk方程见表4，以Km/vm和1/vm对抑制剂浓度作图，得到图4C、D，并计算得到相关解离常数。香蕉多酚对α-葡萄糖苷酶的解离常数KI为29.89 µg/mL，对酶-底物复合物的抑制常数KIS为44.20 µg/mL，该抑制体系中KI＜KIS表明香蕉多酚对游离α-葡萄糖苷酶的亲和力大于对酶-底物复合物的亲和力，通过与酶紧密结合减少酶促反应的发生。

表4 不同质量浓度香蕉多酚对α-葡萄糖苷酶抑制作用的Lineweaver-Burk方程Table 4 Lineweaver-Burk equation for the inhibition effect of banana polyphenols at different mass concentrations on α-glucosidase

3 结论

在青香蕉果肉多酚提取物中共鉴定出21 种多酚类化合物，包含7 种酚酸类化合物、11 种黄酮类化合物和3 种单宁类化合物。其中，单宁是青香蕉多酚的重要组成部分，并检测出秦皮乙素、金丝桃苷、紫云英苷3 种多酚类化合物。香蕉多酚对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制效果良好，对α-淀粉酶为反竞争性-非竞争性混合抑制，IC50为0.53 mg/mL；对α-葡萄糖苷酶为竞争性-非竞争性混合抑制，IC50为35.76 µg/mL。香蕉多酚对淀粉消化酶的抑制作用说明其可能是青香蕉降血糖功能的活性成分之一。