绿豆球蛋白淀粉样纤维的形成、结构表征及乳化特性

白 露，李志明，张 舒，冯玉超，富天昕，刘宇航，王长远,2,*

（1.黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江 大庆 163319；2.国家杂粮工程技术研究中心，黑龙江 大庆 163319）

绿豆蛋白是一种优质膳食蛋白，是绿豆的重要组分（占24%～28%），芳香族氨基酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的含量与联合国粮农组织/世界卫生组织参考蛋白相当[1]，极具开发潜力。绿豆球蛋白（mung bean globulin，MBG）是绿豆蛋白的主要储藏蛋白质，占比达60%，按照不同的重量沉降系数，MBG分为7S、8S和11S球蛋白[2]。MBG具有优良的溶解性、乳化性、凝胶性等特性，在食品工业中应用较为广泛[3]。其中，MBG的乳化性能可与大豆蛋白相媲美，Liu Hong等[4]研究表明，MBG的乳化活性指数（emulsifying activity index，EAI）和乳化稳定性指数（emulsifying stability index，ESI）分别为3.38 m2/g和77.23%，综合乳化能力优于大豆7S球蛋白（EAI和ESI分别为4.87 m2/g和57.50%），可作为一种高效的天然乳化剂。然而，MBG独特的分子构造及柔性不足等局限[4]制约了其高值化利用。通过有效的改性手段实现MBG的功能（尤其是乳化性）增效极具现实意义。

食源性蛋白质淀粉样纤维是由食品蛋白质在酸性（pH 2～3）、高温（80～90 ℃）和低离子浓度下获得的一种富含交叉β-折叠的蛋白聚集体[5]。蛋白质淀粉样纤维是一种高度有序、无支链、分子尺寸为纳米级的大分子结构[6]，具有天然的高刚度、极高的长宽比，在乳液中表现出优异的不可逆界面吸附能力和抗聚集性能，是良好的乳化剂[7]。米糠蛋白[8]、大豆蛋白[9]、乳清蛋白[10]等食品蛋白质在淀粉样纤维化后乳化和界面性能均得到显著提升。因此，蛋白质淀粉样纤维化被认为是一种提升食源蛋白质乳化性能的新方法。已有报道显示，酸热加工能够使MBG具有形成淀粉样纤维的潜能，如Liu Jing等[11]研究发现，MBG在pH 2.0、85 ℃条件下加热24 h能形成大量短棒状形态的纤维聚集体。绿豆8S球蛋白与β-伴大豆球蛋白（即大豆7S球蛋白）结构相似；Tang Chuanhe等[12]发现，β-伴大豆球蛋白在蛋白含量1%、pH 2.0条件下加热12 h，形成轮廓长度为600～800 nm、高度为1.4～1.8 nm的蠕虫状淀粉样纤维。因此，应用MBG制备淀粉样纤维具有可行性。虽然已有相关研究报道MBG在酸热环境下会出现纤维化聚集行为，但其纤维化的动力学特征和分子机制尚不清晰，绿豆球蛋白淀粉样纤维（mung bean globulin amyloid fibrils，MBGFs）的乳化性能也有待探究。

基于此，本研究拟先对MBG进行0～24 h的酸热处理（pH 2.0、95 ℃），然后对不同阶段形成的MBGFs进行结构分析，明晰其纤维化过程中的结构演变规律；同时利用MBGFs构建乳液体系，探究不同酸热处理时间对MBGFs乳化特性的影响，旨在揭示MBGFs的形成机理，为MBG源乳化剂的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

绿豆购自山西东方亮生命科技股份有限公司；金龙鱼大豆油购自黑龙江省大庆市北京华联生活超市。

十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）凝胶制备试剂盒、蛋白Marker（SM0431）、牛血清蛋白 北京索莱宝科技有限公司；考马斯亮蓝G250、溴化钾、硫磺素T（thioflavin T，ThT）、8-苯胺基-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）上海麦克林生化科技有限公司；以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

DS-101S集热式恒温加热磁力搅拌器 上海力辰邦西仪器科技有限公司；RF-6000荧光光谱仪 上海滴冠实业有限公司；TENSOR II傅里叶变换红外光谱（Fouriertransform infrared spectroscopy，FTIR）仪 天津市金贝尔科技有限公司；ZEN3700纳米粒度电位仪 英国Malvern公司；FJ300-SH实验室数显高速剪切均质机上海沪析实业有限公司；JEM-1200EX透射电子显微镜（transmission electron microscopy，TEM）日本电子株式会社；MARS60流变仪 上海珩泽科技有限公司；BX53F显微镜 山东因斯绰科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 MBG及MBGFs的制备

MBG的制备：首先将脱脂绿豆粉与氯化钠溶液（0.5 mol/mL）按照料液比1∶10配制成混合溶液，用HCl溶液调整混合溶液pH值至3.5，室温搅拌2 h后，取悬浮液离心（4 ℃、7 500×g、25 min），上清液与蒸馏水按1∶3的体积比混合，在冰水浴中静置2 h后离心取沉淀，然后将沉淀进行透析（24 h），重复3 次后冷冻干燥备用。

MBGFs 的制备参考Liu Jing 等[11]的方法。将1 g/100 mL的MBG分散于去离子水中，室温搅拌2 h使其充分水化，并将溶液pH值调整至2.0，磁力搅拌20 min后过滤膜（0.45 μm），将滤液于油浴锅中95 ℃加热0、2、4、6、8、10、12、16、20、24 h后取出，立即冰水浴20 min，冷冻干燥后获得MBGFs样品。

1.3.2 MBGFs的结构表征

1.3.2.1 TEM形态分析

MBGFs用水稀释至1 mg/mL，超声使样品分散，取10 μL样品滴在铜网上静置10 min后吸除多余样品，再滴10 μL负染液在原铜网上2 min后吸除多余染液，晾干后用TEM观察。加速电压100 kV，分辨率1.60 nm。

1.3.2.2 SDS-PAGE测定

参考梁征等[13]的方法。用0.1 mol/L NaOH溶液配制样品混合液（0.5 mg/mL），加入等量的上样缓冲液后沸水浴5 min。5%浓缩胶，12%分离胶，上样量10 μL，电压80～120 V。当条带移动至胶最底端后停止加压，结束后对胶面依次进行染色和脱色，并拍照观察。

1.3.2.3 ThT荧光光谱测定

参考Wang Yajuan 等[6]的方法并稍作修改，用10 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.0，含150 mmol/L NaCl）配制质量浓度8 mg/mL的ThT浓缩液，过滤膜后得到ThT储备液。实验前，用上述磷酸盐缓冲液将浓缩液稀释50 倍，将50 μL 1 g/100 mL待测样品溶液与5 mL ThT稀释液混合，混匀后静置2 min，使用荧光光谱仪测定荧光强度（激发波长430 nm，发射波长450～600 nm，缝隙5 mm，扫描速率200 nm/min）。

1.3.2.4 FTIR测定

参考Xiang Ning等[14]的方法并作一定修改。取2 mg MBGFs和200 mg KBr混合后研磨、压片。在400～4 000 cm-1范围内进行扫描，分辨率4 cm-1，波数精度0.01 cm-1，扫描次数64。使用Peakfit 4.12软件对光谱中酰胺I带进行基线校正、平滑、去卷积和二阶导数拟合等处理，计算每个亚峰面积，获得二级结构的相对含量。

1.3.2.5 粒径分析

用pH 7.0、0.01 mol/L磷酸盐缓冲液溶解样品至质量浓度为1 mg/mL。采用粒度仪测定MBGFs粒径，所有样品均在25 ℃下进行测定。

1.3.2.6 表面疏水性（H0）测定

参考Zhang Shu等[15]的方法并稍作修改，配制1 mg/mL样品溶液（溶剂为pH 7.0、0.01 mol/L磷酸盐缓冲液），10 744×g离心10 min后取上清液进行梯度稀释，将稀释液与8 mmol/L ANS溶液以体积比100∶1混合，3 min后测定荧光强度，激发波长为390 nm，发射波长为468 nm。以荧光强度-蛋白质质量浓度作图，所得直线斜率为H0。

1.3.3 乳液的制备及性能测定

1.3.3.1 乳液的制备及EAI和ESI测定

参照刘兴丽等[16]的方法并修改，向15 mL 1 g/100 mL MBGFs溶液中缓慢加入5 mL大豆油，使用高速剪切均质机12 000 r/min均质2 min，形成乳液，立即吸取乳液底部液体50 μL，并置于5 mL 1 g/100 mL SDS溶液中，混匀后立即在650 nm波长处测定其吸光度（A0），间隔10 min后重复操作测定吸光度（A10）。EAI和ESI分别按式（1）、（2）计算。

式中：ρ为样品质量浓度/（g/L）；φ为油相体积分数；n为稀释倍数。

1.3.3.2 蛋白吸附率和界面蛋白吸附量测定

参照王可心等[17]方法并作一定的修改，吸取一定量乳液13 200×g离心30 min，缓慢吸取少量下层清液稀释后于650 nm波长处测定其吸光度，代入牛血清蛋白标准曲线中计算其蛋白质量浓度，蛋白吸附率和界面蛋白吸附量分别按式（3）、（4）计算。

式中：ρ0为乳液中总蛋白质量浓度/（mg/mL）；ρf为下层清液中蛋白质量浓度/（mg/mL）；φ为油相体积分数；D3,2为乳液表面积平均粒径/nm。

1.3.3.3 光学显微镜观察

取少量乳液置于载玻片上，缓慢盖上盖玻片，此过程防止气泡产生，然后于光学显微镜下观察其微观形态并选择标尺进行拍照。

1.3.3.4 流变学特性测定

利用流变仪对MBGFs乳液的表观黏度、储能模量（G′）和损耗模量（G″）进行测定。吸取适量样品于样品台上，转子下降后擦净多余的样品，设置间隙0.048 mm，温度25 ℃，测定样品在0.1～10.0 s-1剪切速率范围内的表观黏度。G′和G″的测定参数为：间隙0.048 mm，温度25 ℃，频率扫描范围0～16 Hz。

1.4 数据处理

所得数据利用IBM SPSS Statistics 22.0软件进行方差分析，采用Duncan’s模式比较组间差异显著性（P＜0.05），并用Origin 8.0软件制作图表。

2 结果与分析

2.1 MBGFs的形成和结构表征

2.1.1 MBGFs形态分析

如图1所示，MBG主要由大小不均一、不规则的球状纳米颗粒组成（图1A）。在pH 2.0环境下，MBG（0 h）发生了一定程度的聚集，但没有线性聚集体存在（图1B）。加热2 h后，球状结构消失，转化为中间粗两端细的絮状纤维丝，表明在此阶段构建单元（蛋白或多肽）已开始进行有序的聚集排序，形成MBGFs初始形态。在4～12 h内，MBGFs逐渐成熟，纤维呈现细直、柔性的长条状，并且长短不一的纤维共存在同一体系。相较于其他处理组，加热12 h形成的淀粉样纤维体系中单个MBGFs间距较大，分布更为均匀。而酸热处理24 h后重新出现絮状纤维形貌，说明过度酸热处理导致成熟MBGFs被破坏，这种现象与Wang Yajuan等[6]的研究结果一致。

图1 加热处理过程中MBGFs的TEM图（×50 000）Fig.1 TEM images of MBGFs at different heating times (× 50 000)

溶液体系的pH值对MBGFs形成起关键作用。本研究中溶液体系pH 2.0，为后续MBG的纤维化聚集提供两方面影响：一是促MBG去折叠，释放大量易诱发纤维化聚集的肽片段[18]；二是通过改变MBG电离状况，暴露疏水基团，为MGB纤维化聚集提供驱动力[19]。酸热处理2 h后，出现大量长度不一但取向相同、细小的MBGFs，其汇聚后形成了相对粗大、延长状的淀粉样纤维聚集中间体。在2 h酸热处理初期，初始MBGFs发生典型的成核聚合反应，释放肽片段，这些纤维化聚集态的多肽在溶液体系中达到阈值水平后，会为组装更长、更柔性的MBGFs提供物质基础[20]。12 h MBGFs的形貌与现有报道存在差异，Liu Jing等[11]研究发现，MBG在含量0.5%、pH 2.0、85 ℃条件下处理12 h后会形成短棒状纤维聚集体，而本研究得到的是细直的长纤维，这可能与制备时蛋白质含量和温度的不同有关[21]。综上，在整个酸热处理过程中（0～24 h），MBGFs呈现“纤维前体形成→组装→延伸→成熟→重新解离”的形成规律。

2.1.2 加热处理过程中MBG的降解

由图2可知，MBG泳道的条带分布符合MBG亚基组成特征（60、48、32、26 kDa）[4]。由于将溶液体系pH值调至2.0，MBG变性的同时发生聚集反应，出现高分子质量的亚基[22]，如出现多条＞66.2 kDa的新条带。2 h的谱图变化不明显，但也出现了14.4～25.0 kDa的肽段。研究表明，在初始酸热水解阶段（2 h以内），2 h时MBG的水解程度高于一般谷物蛋白，如米谷蛋白[23]和芸豆球蛋白[11]，这与MBG高含量的天冬氨酸（占比10.1%～12.3%）有关[24]，这种快速水解产生的MBG多肽片段有助于快速积累足够数量的MBGFs结构单元。4～12 h是MBGFs形成的主要构建期，＜14.4 kDa的肽片段不断积累，期间随着纤维单元含量的不断提升，MBGFs淀粉样纤维化程度不断提高[25]。上述分析表明，2～12 h是MBG成淀粉样纤维化关键时段，与TEM的结果相对应。然而酸热处理16～24 h时，大部分大分子质量亚基已水解成＜14.4 kDa的肽片段，提示长时间酸热处理可能会导致前一阶段生成的多肽类淀粉样纤维单元遭到破坏，并影响纤维特性[26]。

图2 加热过程中MBGFs的SDS-PAGE图Fig.2 SDS-PAGE patterns of MBGFs at different heating times

2.1.3 ThT荧光光谱

与未处理的蛋白质相比，成熟蛋白质淀粉样纤维有更多的β-折叠构型，能被ThT特异性结合，结合后荧光强度会增加多个数量级，所以用该方法可有效监测食源蛋白质淀粉样纤维化的进程[27]。由图3可知，加热2 h后，ThT荧光强度相较于MBG显著增强，有明显的交叉β-折叠结构形成，表明MBG的自组装纤维化已被触发，符合MBG自组装纤维化聚集的特点[11]，即水解与纤维化同步进行。2～12 h内，ThT荧光强度持续上升，表明MBGFs在有序形成，结构趋于稳定，并于12 h时ThT荧光强度最大，纤维化程度最高。已有报道表明，蛋白质淀粉样纤维的形成包括滞后期、生长期和固定期，呈现“S”型的生长模式[28]，本研究发现MBGFs形成过程中并未出现滞后期，初始时期（0～6 h）的ThT荧光强度迅速上升，这可能与MBG发生去折叠导致大量的β-折叠结构暴露有关。ThT荧光强度在16～24 h持续下降，说明长时间的酸热处理导致MBGFs的β-折叠结构被破坏。目前研究发现蛋白质淀粉样纤维的生长动力学曲线在固定阶段出现2 种不同的现象，一种是ThT荧光强度逐渐平稳，另一种情况是成熟的淀粉样纤维结构发生解离，ThT荧光强度发生衰退。例如，大豆蛋白质淀粉样纤维[6]和β-乳球蛋白淀粉样纤维[29]在长时间（＞12 h）酸热处理后，ThT荧光强度降低，而芸豆蛋白淀粉样纤维[11]却没有发生这一现象。这可能是蛋白质来源和制备条件不同导致蛋白质淀粉样纤维的热稳定性存在差异，具体机理还需进一步探讨。

图3 加热过程中MBGFs的ThT荧光强度及最大ThT荧光强度（λ＝485 nm）Fig.3 ThT fluorescence intensity of MBGFs at different heating times (λ=485 nm)

2.1.4 FTIR光谱

由表1可知，在酸热处理的0～12 h，MBGFs的有序结构不断形成，并趋于稳定，表现为α-螺旋和β-折叠相对含量逐渐增大。其中β-折叠相对含量在12 h达到最大，为（53.61±1.15）%，表明β-折叠在MBGFs的淀粉样纤维化进程中大量存在，有助于MBGFs的形成[30]，与ThT荧光检测结果相一致。已有报道均显示出这类现象，即蛋白质淀粉样纤维的形成涉及二级结构的破坏和重组，最明显的特征是在淀粉样纤维成熟时β-折叠结构大量出现，而更具有灵活性和无重复的二级结构（β-转角和无规卷曲）减少[30]。在酸热处理后期（16～24 h），α-螺旋和β-折叠相对含量显著下降，β-转角和无规卷曲相对含量显著上升（P＜0.05）。研究表明，蛋白质中的α-螺旋构型含量高有利于其纤维化聚集，对纤维长度的延伸起重要作用[31-32]。这些结果均证实，在MBGFs整个的纤维化进程中，MBGFs结构呈现先有序后无序的变化。

表1 加热过程中MBGFs的二级结构相对含量
Table 1 Relative contents of secondary structures in MBGFs at different heating times %

注：同列小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。

2.1.5 粒径分布

由图4A可知，颗粒粒径大小呈现先上升后急剧下降的趋势，其中12 h最大，为（226.90±7.95）nm；16～24 h粒径减小。在酸热处理0～12 h，颗粒粒径增大主要是由于构建体如蛋白单元或多肽单元的水解释放，同时进行积极的纤维化聚集，这个阶段称之为“纤颤准备阶段”；在长时间加热后（16～24 h），已成型的纤维化聚集体因持续酸水解而出现降解，致使粒径减小[26]，称为“纤颤逆转阶段”。同时，随着加热时间的延长，MBG粒径的分布状态由三峰逐步转变为双峰，且吸收强度明显提升，粒径分布更宽，分布峰向粒径较大的方向偏移（图4B），表明酸热加工下的纤维化聚集反应引起蛋白质或多肽等构建单元粒径的增大，MBGFs的形态趋于规则且分布均匀。

图4 加热过程中MBGFs的平均粒径（A）及粒径分布（B）Fig.4 Average particle sizes (A) and particle size distribution (B) at different heating times

2.1.6H0分析

作为蛋白质纤维化聚集的主要驱动力，酸热处理下MBG会在疏水相互作用、静电相互作用和氢键的影响下发生成核聚合反应，有序聚集的肽片段首尾相接形成具有高长宽比的淀粉样纤维[5]。因此，H0提升有助于MBGFs的形成[33]。由图5可知，随加热时间延长，H0呈现先上升后下降的趋势，6 h达到最大。表明0～6 h是MBGFs快速形成的关键阶段。H0的增大可能是由于酸热处理使MBG水解而产生低分子肽，暴露了蛋白质分子内疏水基团，同时这些疏水基团可作为MBG聚集的活性结合位点[34-35]。当加热时间大于6 h后，H0逐渐下降，这可能是由于持续加热后蛋白质或多肽单元发生了更为剧烈的纤维化聚集，期间以自发成核的聚集反应为主，使得暴露的疏水基团被掩埋在纤维化聚集体中，造成H0下降[36]，这与Pang Shuxian等[8]的研究结果相一致。

图5 加热过程中MBGFs的H0Fig.5 H0 of MBGFs at different heating times

2.2 MBGFs乳化特性

2.2.1 MBGFs乳液的EAI及ESI

如图6所示，将加工环境的pH值调整至2.0（0 h），MBG的EAI和ESI显著提升（P＜0.05）。MBG的等电点在pH 5.0左右[37]，偏离等电点时表面静电荷含量提升，溶解性增大，最终改善了MBG的EAI和ESI[38]。在酸热处理中（2～24 h），MBGFs的EAI和ESI均显著高于MBG（P＜0.05），表明淀粉样纤维化提升了MBG的乳化性能，这得益于MBGFs在油-水界面优异的不可逆界面吸附和抗聚集性能[7]。另外，随酸热处理时间延长，EAI和ESI呈现先上升后下降的趋势，4 h MBGFs的EAI和ESI均达到最大，与MBG相比分别提高160.80%和103.07%。且4 h MBGFs的乳化性能显著优于12 h MBGFs，这可能是由于4 h MBGFs的柔韧性强于12 h MBGFs（图1），使其易于附着在油滴表面；同时，持续酸热处理后（6～12 h），数量更多、成熟度更高的MBGFs在乳液中发生絮凝，导致乳化性能的下降，这种现象同样出现在了Pang Shuxian等[8]的研究中。综上，适度的纤维化（4 h MBGFs）有助于最大程度地提升MBG的EAI及ESI。

图6 MBGFs乳液的EAI及ESIFig.6 EAI and ESI of emulsions stabilized by MBGFs

2.2.2 MBGFs乳液的蛋白吸附率和界面蛋白吸附量

在乳液中，油滴表面吸附蛋白质在降低界面张力的同时可增加相邻油滴间阻力，因此吸附的蛋白质含量高低直接影响油滴的界面形成，最终影响乳液体系稳定性[39-40]。如图7所示，MBG纤维化过程中，MBGFs的蛋白吸附率和界面蛋白吸附量总体呈现先上升后下降的趋势，但始终大于MBG。其中酸热处理4 h时蛋白吸附率和界面蛋白吸附量最高，分别达到（80.03±0.30）%和（0.89±0.01）mg/m2。上述结果表明，淀粉样纤维化能显著提升MBG的蛋白吸附率和界面蛋白吸附量，从而有效降低油滴界面层的界面张力，使乳化体系更加稳定。通常，与天然蛋白质和一些小分子活化剂相比，蛋白质淀粉样纤维在油滴界面具有较高的分离能，吸附形成的界面层弹性强，稳定性高，有助于形成更稳定的乳液[41]。蛋白吸附效果与淀粉样纤维的柔性密切相关，酸热处理4 h时MBGFs已经成型，柔韧性较高（图1），这种形态有助于吸附在油-水界面[42]，从而导致较高的蛋白吸附率和界面蛋白吸附量，与EAI和ESI的实验结果相一致。

图7 MBGFs乳液的蛋白吸附率和界面蛋白吸附量Fig.7 Protein adsorption rates and interfacial protein adsorption quantity of emulsions stabilized by MBGFs

2.2.3 MBGFs乳液的微观形态

如图8所示，MBG乳液油滴体积较大且分布较为无序，这种状态下油滴间发生聚集效应，从而不利于乳液体系的稳定[43]。pH值调至2.0时，絮凝的油滴发生分离，油滴间空隙加大，分散更为均匀。这主要是因为低pH值提升了MBG表面正电荷含量，增加了乳液油滴之间的静电排斥力，导致油滴间的聚集程度下降[38]。随加热时间延长（2～10 h），油滴尺寸减小，分布更加致密有序，尤其是4 h时，油滴体积较小，分布较为松散。由上述分析可知，加热4～6 h后，MBGFs形状更为柔软，在油-水界面的蛋白吸附能力更强，这些情况将有助于乳液更小油滴的形成和更均匀的排布，提升乳液的均匀性和稳定性。Mantovani等[10]的研究显示，在乳清蛋白淀粉样纤维所构建的乳液中，更小的油滴尺寸和更均匀有序的分布有助于改善乳液的稳定性。

图8 MBGFs乳液的微观形态（×200）Fig.8 Microstructures of emulsions stabilized by MBGF (× 200)

2.2.4 MBGFs乳液的表观黏度

如图9所示，不同酸热处理时间MBGFs乳液样品的表观黏度均随着剪切速率的增大而减小，表现出剪切稀化特性（假塑性流体）[44]。0 h时，同一剪切速率下，乳液的表观黏度大于MBG组，原因是极酸性条件下MBG表面水合层被破坏后引起了聚集，最终增大了乳液的黏度[45]。MBGFs乳液的表观黏度明显高于MBG，表明MBG淀粉样纤维化可提升其乳液的黏度，改善乳液稳定性。不同加热时间下MBGFs乳液的表观黏度不同，表现为MBGFs（2～12 h）大于MBG组（尤其是4 h MBGFs），变化规律和EAI及ESI一致，这表明4 h MBGFs有助于乳液网络结构的构建。另外，加热时间为16～24 h的MBGFs乳液表观黏度低于2～12 h，这可能是由于2～12 h处于纤维成型阶段，大量未参与淀粉样纤维构成的纤维单元在乳液中定向聚集，形成了具有较高黏性的蛋白质原纤维，最终乳液黏度增强[46-47]。

2.2.5 MBGFs乳液的黏弹性

如图10所示，所有组别乳液的G′均大于G″，G′和G″未出现交叉点，表明在设定频率范围内（0～16 Hz），乳液表现出了凝胶特性，且结构致密、组成单一、富有弹性[48]。pH 2.0处理下MBG乳液的G′明显增大，可能是调整pH值后MBG分子中的巯基发生氧化反应，形成的二硫键提升了分子间相互作用，并增强了凝胶有序的网络结构，有利于改善G′[49]。与MBG相比，MBGFs乳液的G′和G″明显增大，表明淀粉样纤维化有助于改善乳液的黏弹性，进而提高乳液稳定性。其中4 h MBGFs乳液G′和G″均处于最大值，与上述结果相一致。乳液凝胶黏弹特性与油滴粒径相关，较小的乳液油滴比较大的乳液油滴有更大的G′[50]。与其他组别相比，4 h MBGFs乳液油滴尺寸较小，更多MBGFs被油-水界面吸附，有助于形成均匀、致密的凝胶，从而增强乳液的凝胶性能。

图10 MBGFs乳液的G′（A）和G″（B）Fig.10 G′ (A) and G″ (B) of emulsions stabilized by MBGFs

3 结论

本研究探讨了MBGFs在形成过程中的结构演变规律及乳化特性变化情况。酸热处理下，MBG逐步水解，球状蛋白质分子结构去折叠，并获得大量具有自组装能力的肽片段，期间肽片段发生定向的淀粉样纤维化聚集，在疏水相互作用等驱动力下，形成富含β-折叠构型且“两端细、中间粗”絮状形态的长刚性MBGFs。但同时，长时间的酸热处理（＞12 h）会对MBGFs的结构造成破坏。与MBG相比，MBGFs具有更优异的乳化性能（尤其是4 h MBGFs），4 h MBGFs将EAI、ESI、蛋白吸附率和界面蛋白含量分别提升了168.80%、103.07%、73.79%和61.57%，且4 h MBGFs乳液的油滴粒径更小，分散更加均匀有序，具有更高乳液黏度，更易形成凝胶状的网状结构。本研究为进一步理解MBGFs的形成和结构提供了理论依据，为构建新型、高效的植物蛋白基乳化剂提供了一定的方法指导。