磷酸化裙带菜多糖的制备及结构表征和生物活性分析

李 瑶，熊彩明，张佳乐，冯学珍，冯书珍,*

（1.广西科技大学医学部，广西 柳州 545006；2.广西科技大学理学院，广西 柳州 545006）

随着我国海洋药物研究的加速发展和现代提取技术的应用研究，海藻多糖的功能活性及药食两用价值越来越受到关注和重视[1]。裙带菜（Undaria pinnatifidaSuringar）作为我国重要的药用海藻和功能性食品[2]，其多糖已被证实具有自由基清除能力、降血糖等活性[3-4]，但天然海藻多糖本身生物活性相对较弱[5]，常通过化学方法添加修饰以增强多糖活性。多糖化学修饰主要有磷酸化、硫酸化、羧甲基化、乙酰化等方法[6]，其中，磷酸化修饰在增强多糖生物活性方面具有显著优势，如南征[7]研究表明，磷酸化修饰杏鲍菇多糖可显著提高对1,1-二苯基-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、超氧阴离子自由基（·）、羟自由基（·OH）的清除能力，与硫酸化、羧甲基化、乙酰化修饰相比，清除能力分别增加72.46%～96.93%、18.64%～20.64%和3.40%～55.63%。

磷酸化修饰可以通过改变多糖结构，包括分子质量、空间构象、分支度、糖苷键等，进而改变多糖生物活性[8-9]，但结构特征对其生物活性的影响却不尽相同。如王帅等[10]发现，分子质量较小的香菇多糖具有较强的自由基清除能力，但Deng Jie等[11]则发现，铁皮石斛多糖的分子质量与其·OH和·清除能力之间无对应关系；陈玥彤等[12]研究发现，黑木耳多糖经磷酸化修饰后出现三股螺旋结构，能够显著增强其生物活性。目前，关于药食两用海藻多糖的磷酸化修饰研究处于初级阶段，仅Jiang Nanfang等[13]对孔石莼多糖进行磷酸化修饰，发现修饰后的多糖自由基清除能力显著提高，其多糖结构如单糖组成发生改变。磷酸化修饰对裙带菜多糖生物活性的影响及其伴随的结构变化尚不明确。

本研究采用微波辅助酶法提取裙带菜多糖，经离子交换柱层析和凝胶柱层析分离纯化后进行磷酸化修饰，综合运用紫外吸收光谱、傅里叶变换红外光谱、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）、高碘酸氧化及Smith降解法、刚果红实验、β-消去反应、碘-碘化钾实验对磷酸化裙带菜多糖进行结构表征，评价其修饰前后自由基清除能力和降血糖活性及其相关性，以期为裙带菜多糖构效关系研究提供理论依据和数据支撑，并为裙带菜功能性食品的开发和利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

裙带菜于2022 年11 月采自广西北部湾海域（20°54 ′10 ″～21°40 ′30 ″ N，109°05′20″～109°11′35″E）。用清水冲洗除去泥沙、盐分等杂质，静置至干燥后，研磨密封备用。

透析袋（截留分子质量为8～140 kDa）广州雍仪生物科技有限公司；中性蛋白酶（50 U/mg）、葡萄糖标准品（纯度99%）、甘油、赤藓醇、NaBH4（分析纯）、阿卡波糖（纯度99%）、对硝基苯基-α-D-吡喃葡糖苷（4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，pNPG）（纯度98%）、α-葡萄糖苷酶（100 U/mg）美国Sigma公司；三聚磷酸钠、三偏磷酸钠、VC、钼酸铵、过氧化氢、磷酸二氢钾、2,5-二羟基苯甲酸、乙腈、六水氯化镁、三羟甲基氨基甲烷、高碘酸钠、碘酸钠、三氟乙酸、乙二醇、乙酸、刚果红溶液、碘-碘化钾试剂等其他试剂与单糖（均为分析纯）国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

SCIENTZ-10N冷冻干燥机 宁波新芝科技生物有限公司；N-1100旋转蒸发仪 日本Eyela公司；DEAE-Cellulose 52离子交换柱（2 cm×20 cm）美国Whatman 公司；Sephadex G-100凝胶色谱柱（2 cm×20 cm）美国Pharmacia公司；UV-2600紫外分光光度计、GC2014气相色谱仪 日本Shimadzu公司；Multiskan GO全波长扫描酶标仪 美国Thermo Fisher公司；Nicolet 6700傅里叶变换红外光谱仪上海莱睿科学仪器有限公司；Autoflex speed TOF/TOF MALDI-TOF-MS仪 德国布鲁克公司。

1.3 方法

1.3.1 裙带菜多糖的提取、分离与纯化

参照李瑶等[3]的方法，采用微波辅助酶法提取裙带菜多糖，后经30%过氧化氢进行脱色，纯水透析、减压浓缩、冷冻干燥即得裙带菜粗多糖（Undaria pinnatifidaSuringar polysaccharide，UPP）。UPP经DEAE-Cellulose 52型阴离子交换树脂分离，依次用蒸馏水、0.05、0.10、0.25、0.50 mol/L氯化钠溶液进行梯度洗脱，采用苯酚硫酸法绘制洗脱曲线，收集洗脱样品。根据洗脱曲线收集多糖，经旋转蒸发、减压浓缩后，透析2 d，浓缩、冷冻干燥，得到1 个洗脱部分的多糖UPP1。再经Sephadex G-100凝胶色谱柱纯化，用2 mL去离子水洗脱，得到UPP1a。

1.3.2 磷酸化裙带菜多糖的制备

参照Duan Zhen等[14]的方法，略作修改。称取3.5 g三聚磷酸钠和3.5 g三偏磷酸钠溶解于100 mL超纯水中，与1 mL 0.1 g/mL的UPP1a溶液混合，加入0.05 g/mL碳酸钠溶液调节pH值至9.0，在55 ℃条件下反应4.5 h，期间不断搅拌。反应结束后，向混合溶液中加入4 倍体积的95%乙醇反应8 h，将样液置于透析袋中透析48 h，浓缩冻干即得磷酸化裙带菜多糖（UPP1a-P）。

1.3.3 UPP1a-P的结构测定

1.3.3.1 取代度的测定

标准曲线的绘制采用钼蓝比色法[15]：准确称取200 mg六水氯化镁和6 g三羟甲基氨基甲烷溶于300 mL超纯水，用1 mol/L的盐酸调节溶液pH值至7.0，制得Tris缓冲液。量取不同体积的0.1 mg/mL磷酸盐标准溶液于试管中并补充超纯水至5 mL，依次加入3 mL Tris缓冲液和定磷试剂（0.05 mol/L VC水溶液、3 mol/L硫酸溶液和0.03 g/mL钼酸铵溶液），混合均匀，在45 ℃条件下反应30 min，冷却后于580 nm波长处测定吸光度，以磷酸根浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

取0.01 g UPP1a-P于试管中，依次加入1 mL的浓硫酸、浓硝酸，加热至冒烟。冷却后加入1 mL 0.3 g/mL过氧化氢溶液，再缓慢加热，重复上述操作直至不再冒烟。冷却后加入1 mL 6 mol/L盐酸溶液，并用超纯水定容至50 mL。取5 mL定容液根据标准曲线计算样品中磷酸根含量，取代度按照式（1）计算[16]。

式中：P为样品中的磷酸根含量/%。

1.3.3.2 紫外光谱测定

称取一定量的UPP1a与UPP1a-P分别配制成1 mg/mL溶液置于比色皿中，在200～400 nm波长范围内进行紫外扫描[17]。

1.3.3.3 傅里叶变换红外光谱测定

采用溴化钾压片法，在4 000～400 cm-1波数范围内对UPP1a、UPP1a-P进行傅里叶变换红外光谱扫描。

1.3.3.4 相对分子质量测定

采用MALDI-TOF-MS法[18]测定磷酸化前后裙带菜多糖的相对分子质量：向100 μL乙腈-水-三氟乙酸（体积比50∶50∶1）中分别加入1 mg的UPP1a、UPP1a-P、2,5-二羟基苯甲酸，混合均匀，使其溶解，得到10 mg/mL的UPP1a、UPP1a-P、2,5-二羟基苯甲酸基质溶液。分别吸取2 μL样品溶液和基质溶液，充分混匀。取1 μL混合溶液滴加在样品靶上，晾干后，将点样板送入离子源中进行测定，根据扫描信号得到UPP1a及UPP1a-P相对分子质量。

1.3.3.5 高碘酸氧化及Smith降解反应

高碘酸氧化反应参照陈光静[19]的方法，略作修改。将30 mmol/L高碘酸钠和碘酸钠溶液按照不同的比例混合，取0.2 mL混合液，稀释到50 mL后于紫外分光光度计223 nm波长处测定吸光度。以混合后的高碘酸钠浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制高碘酸钠标准曲线。取15 mg UPP1a-P，溶于30 mmol/mL高碘酸溶液中，混合均匀后于4 ℃下避光反应，间歇振荡，当吸光度基本保持不变时，计算高碘酸钠的消耗量。加入2 mL乙二醇停止反应，于25 ℃下反应30 min。取2 mL反应液，加入0.01 g/mL酚酞溶液，用0.066 mol/mL氢氧化钠溶液滴定，计算甲酸生成量。

Smith降解反应参照Liao Wenzhen等[20]的方法，略作修改。取上述高碘酸氧化产物置于试管中，加入4 mL 2 mol/L三氟乙酸溶解，120 ℃水解2 h。冷却至室温后多次加入少量甲醇，45 ℃减压蒸发去除残余的三氟乙酸，加水溶解，再加入70 mg的NaBH4避光放置24 h，用0.5 mol/L乙酸溶液调节pH值至5.0，经透析、浓缩、冷冻干燥得到降解产物。降解产物采用糖腈乙酰化的方法经衍生处理后进行气相色谱（gas chromatography，GC）分析[21]。

1.3.3.6 刚果红实验

参照杨东达[22]的方法，准确配制1 mg/mL UPP1a、UPP1a-P溶液，取1 mL多糖溶液与1 mL 50 mmol/L刚果红溶液于试管中混匀，后分别加入3 mL不同浓度的NaOH水溶液，混匀，使溶液中NaOH浓度分别为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L。在400～600 nm波长范围，采用紫外-可见分光光度计进行扫描，测定溶液的最大吸收波长。

1.3.3.7β-消去反应

取10 mg UPP1a-P，加入3 mL 0.2 mol/L NaOH水溶液，于45 ℃下放置3 h，冷却至室温后用紫外分光光度计于190～400 nm波长扫描。另取10 mg UPP1a-P，配制成质量浓度1 mg/mL的溶液，置于45 ℃下3 h，冷却后于190～400 nm波长扫描。

1.3.3.8 碘-碘化钾实验

分别取4 mL 1 mg/mL的UPP1a、UPP1a-P溶液，与2.4 mL碘-碘化钾试剂（含0.000 2 g/mL I2的0.002 g/mL KI溶液），混匀后，在300～800 nm波长范围内扫描[23]。

1.3.4 UPP1a-P的生物活性测定

1.3.4.1 自由基清除能力测定

参照冯书珍等[24]的方法，将UPP1a和UPP1a-P样品溶于超纯水，分别配制成不同质量浓度（0.3、0.5、1.0、3.0、5.0 mg/mL）的溶液，以VC作为阳性对照，测定UPP1a及UPP1a-P对DPPH自由基、O2-·和·OH的清除能力并计算半抑制质量浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。自由基清除率与IC50分别按式（2）、（3）计算。

式中：A样品为样品组吸光度；A对照为对照组吸光度；A空白为空白组吸光度。

式中：Xm为最大浓度的对数；I为最大浓度/相邻浓度的对数；P为自由基清除率之和/%；Pm为最大自由基清除率/%；Pn为最小自由基清除率/%。

1.3.4.2 降血糖活性测定

参照冯学珍等[25]的方法，将UPP1a和UPP1a-P样品分别配制成不同质量浓度（3.0、5.0、10.0、15.0、20.0 mg/mL）的溶液，以阿卡波糖作为阳性对照，测定UPP1a及UPP1a-P对α-葡萄糖苷酶（底物pNPG）的抑制活性并计算IC50。酶活性抑制率和IC50分别按式（4）、（3）计算：

式中：A1为药物反应组（样品+酶+底物）吸光度；A2为药物对照组（样品+磷酸缓冲液+底物）吸光度；A3为空白反应组（磷酸缓冲液+酶+底物）吸光度；A0为空白对照组（磷酸缓冲液+磷酸缓冲液+底物）吸光度。

1.4 数据处理

每组实验均平行测定3 次，结果以平均值±标准差表示，用SPSS 25.0、Jupyter Notebook软件对数据进行统计分析，利用GraphPad Prism 9和Origin 2022软件绘图。磷酸化前后裙带菜多糖自由基清除能力和降血糖活性用方差分析（analysis of variance，ANOVA）和S-N-K（Student-Newman-Keuls）多重比较进行显著性分析（P＜0.05），采用熵值法计算磷酸化前后裙带菜多糖对自由基清除能力的综合评价值[3]，并用ANOVA和S-N-K多重比较进行显著性分析（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 裙带菜多糖的分离纯化

由图1A可知，从20 g裙带菜中得到UPP约2.53 g，提取率为12.65%。UPP经DEAE-Cellulose 52型阴离子交换树脂分别用蒸馏水、NaCl溶液洗脱分离后，得到1 个多糖组分（UPP1），产率为21.20%，为0.05 mol/L NaCl溶液洗脱组分。UPP1再经Sephadex G-100凝胶层析柱进一步纯化，呈现单个对称的洗脱峰，记为组分UPP1a（图1B），其产率为55.91%。

图1 UPP的DEAE-52柱层析洗脱图（A）和UPP1组分的Sephadex G-100柱层析洗脱图（B）Fig.1 Elution curve of UPP on DEAE-52 anion-exchange column (A),and elution curve of UPP1 on Sephadex G-100 column (B)

2.2 UPP1a的结构表征

2.2.1 取代度及紫外光谱

采用磷酸盐法对UPP1a进行磷酸化修饰，得到裙带菜多糖磷酸根的取代度为9.26。由图2可知，UPP1a及UPP1a-P在260、280 nm波长处均无明显吸收峰，说明磷酸化修饰前后的裙带菜多糖的核酸和蛋白质含量均相对较低。裙带菜多糖经磷酸化修饰后形成了化学键束缚，导致修饰后裙带菜多糖紫外吸收强度有所减弱，峰值降低。

图2 UPP1a和UPP1a-P的紫外扫描图谱Fig.2 UV absorption spectra of UPP1a and UPP1a-P

2.2.2 傅里叶变换红外光谱分析

由表1和图3可知，裙带菜多糖修饰前后主体结构并未发生改变，UPP1a-P和UPP1a在3 670～3 220、3 000～2 800、1 700～1 400、1 200～1 000 cm-1均显示出多糖的特征吸收峰[26]；与UPP1a相比，UPP1a-P分别在1 216、886 cm-1出现P＝O、P—O—C键的吸收峰[27]，均提示存在磷酸基团，说明多糖磷酸化修饰成功。

表1 UPP1a和UPP1a-P官能团的傅里叶变换红外光谱分析Table 1 FTIR analysis of functional groups in UPP1a and UPP1a-P

图3 UPP1a和UPP1a-P的傅里叶变换红外光谱图Fig.3 FTIR spectra of UPP1a and UPP1a-P

UPP1a-P在1 094 cm-1附近出现的吸收峰是吡喃环的醚键和羟基的共振吸收峰，由C—O—C不对称伸缩振动引起[28]，890 cm-1附近出现的吸收峰由C—H的变角振动引起，是吡喃葡聚糖和β-型糖苷键连接的特征吸收峰[29-30]，771 cm-1为吡喃糖对称环伸缩振动[31]，在N—H的变角振动范围内有1 643 cm-1吸收峰，为蛋白质吸收峰，说明磷酸化修饰后的裙带菜多糖UPP1a-P是一种由β-糖苷键连接的吡喃型葡聚糖。

2.2.3 相对分子质量测定结果

通过MALDI-TOF-MS可知，UPP1a和UPP1a-P的相对分子质量均分布在5×103～8×104。其中，UPP1a的最大相对分子质量为77.3×103，修饰后的UPP1a-P相对分子质量增大，在5×103～1.8×104区间峰较明显，最大相对分子质量为94.4×103。

2.2.4 高碘酸氧化和Smith降解法分析

通过高碘酸氧化实验，在223 nm波长处测吸光度，得到高碘酸消耗量标准曲线：y＝10.568 0x-0.001 1（R2＝0.999 1）。UPP1a-P能被高碘酸氧化，当反应时间达到144 h时，吸光度趋于平稳，反应结束（图4）。UPP1a-P经高碘酸氧化后，平均每摩尔糖残基消耗高碘酸0.507 mmol，并生成0.002 mmol甲酸。此过程中，高碘酸氧化产生了少量甲酸，说明UPP1a-P中存在1→6糖苷键。高碘酸消耗量大于甲酸生成量的2 倍，说明UPP1a-P结构中存在只消耗高碘酸而不生成甲酸的1→2,1→4糖苷键，还存在既不消耗高碘酸也不产生甲酸的1→3糖苷键。

图4 UPP1a-P的高碘酸氧化反应曲线Fig.4 Curve of periodic acid in oxidation of UPP1a-P

UPP1a-P经Smith降解后，检测出甘油、木糖、乙二醇和半乳糖（表2），说明UPP1a-P的多糖组分中存在1→6、1→2,1→4型糖苷键[32]。进一步结合高碘酸氧化实验可知，UPP1a-P的主要连接方式为1→2、1→3、1→4和1→6，即UPP1a-P结构中存在0.504 mmol的1→2,1→4糖苷键、0.002 mmol的1→6糖苷键和0.494 mmol的1→3糖苷键。

表2 UPP1a-P的Smith降解产物GC分析结果Table 2 GC analysis results of Smith degradation products of UPP1a-P

2.2.5 刚果红实验分析

由图5可知，随着NaOH浓度不断增大，UPP1a和UPP1a-P的最大吸收波长均显著大于刚果红。其中，UPP1a在0～0.5 mol/L浓度范围内最大吸收波长没有明显下降趋势，说明NaOH对UPP1a的结构未造成破坏，不存在三股螺旋结构。UPP1a-P在NaOH浓度为0.0～0.5 mol/L时最大吸收波长发生红移，说明UPP1a-P分子间作用力发生变化，具有三股螺旋结构。

图5 不同NaOH浓度下UPP1a-P、UPP1a和刚果红紫外-可见光最大吸收波长变化Fig.5 Changes in maximum absorption wavelengths of UPP1a-P+Congo red,UPP1a+Congo red and Congo red at different NaOH concentrations

2.2.6β-消去反应分析

由图6可知，经NaOH处理后的UPP1a-P在240 nm波长处吸光度明显增大，表明UPP1a-P中含有—O—型糖肽键。

图6 UPP1a-P经NaOH作用前后的紫外吸收光谱Fig.6 UV absorption spectrum of UPP1a-P

2.2.7 碘-碘化钾实验分析

由图7可知，UPP1a-P与KI-I2反应物的最大吸收峰在300 nm附近，而在565 nm波长处无最大吸收，说明UPP1a-P具有较长的侧链和较多的分支。

图7 UPP1a-P与碘-碘化钾反应的紫外吸收光谱Fig.7 UV absorption spectrum of UPP1a-P after reaction with KI-I2

2.3 UPP1a的生物活性分析

2.3.1 自由基清除能力

由图8和表3可知，UPP1a-P和UPP1a对DPPH自由基、·和·OH的清除作用均随质量浓度的增加而增加，磷酸化后的裙带菜多糖自由基清除能力显著高于磷酸化前（P＜0.05），具体表现为：在0～5 mg/mL质量浓度范围内，UPP1a-P对3 种自由基清除率的IC50均显著低于UPP1a。其中，UPP1a-P对3 种自由基清除率的IC50分别为（1.19±0.43）、（2.24±1.63）、（1.11±0.13）mg/mL，UPP1a分别为（118.00±0.74）、（5.14±0.62）、（335.60±0.39）mg/mL（P＜0.05）。在5 mg/mL质量浓度下，与UPP1a相比，UPP1a-P对DPPH自由基、·和·OH的清除率显著提高34.76%、12.30%、76.05%。

表3 UPP1a-P和UPP1a对DPPH自由基、·、·OH和α-葡萄糖苷酶的IC50及自由基清除能力综合评价值Table 3 IC50 and comprehensive evaluation values for free radical scavenging activity and α-glucosidase inhibitory activity of UPP1a-P and UPP1a

表3 UPP1a-P和UPP1a对DPPH自由基、·、·OH和α-葡萄糖苷酶的IC50及自由基清除能力综合评价值Table 3 IC50 and comprehensive evaluation values for free radical scavenging activity and α-glucosidase inhibitory activity of UPP1a-P and UPP1a

注：同行小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。

图8 UPP1a-P和UPP1a的自由基清除能力Fig.8 Radical scavenging capacity of UPP1a-P and UPP1a

2.3.2 降血糖活性

由图9和表3可知，UPP1a-P和UPP1a对α-葡萄糖苷酶的抑制作用均随质量浓度的增加而增加。当质量浓度达到20 mg/mL时，UPP1a-P和UPP1a对α-葡萄糖苷酶的抑制率最高，分别为95.40%、91.70%，UPP1a-P较UPP1a抑制率提高3.70%；在0～20 mg/mL，UPP1a-P对α-葡萄糖苷酶抑制率的IC50显著低于UPP1a（P＜0.05），分别为（0.07±0.05）、（2.31±0.60）mg/mL，表明磷酸化修饰可以增强裙带菜多糖的降血糖活性。

图9 UPP1a-P和UPP1a对α-葡萄糖苷酶的抑制作用Fig.9 Inhibitory effect of UPP1a-P和UPP1a on α-glucosidase

2.3.3 自由基清除能力与降血糖活性相关性分析

将自由基清除能力综合评价值及其各自由基清除能力分别与降血糖活性进行相关性分析，由图10、11可知，磷酸化修饰前后裙带菜多糖对自由基的清除能力与其降血糖活性间存在高度显著正相关（P＜0.001），其中，DPPH自由基、·的清除作用显著影响降血糖活性（P＜0.05），但·OH的清除作用与降血糖活性间无显著相关性（P＞0.05）。

图10 自由基清除能力综合评价值与降血糖活性的相关性分析Fig.10 Correlation analysis between comprehensive evaluation values of free radical scavenging capacity and hypoglycemic activity

图11 各自由基清除能力与降血糖活性的相关性热图Fig.11 Heatmap of correlation between free radical scavenging capacity and hypoglycemic activity

3 讨论

与程浩[33]对磷酸化修饰显著提升·OH清除能力、降低·清除能力的研究结果不同，磷酸化修饰均显著增强裙带菜多糖DPPH自由基、·、·OH的清除能力；与金明枝[34]对磷酸化修饰显著降低大球盖菇多糖降血糖活性的研究结果不同，磷酸化修饰后的裙带菜多糖降血糖活性显著高于修饰前，说明磷酸化修饰适用于改善裙带菜多糖生物活性。同时，降血糖活性与自由基清除能力间存在一定相关性，王秋丹等[35]研究表明，DPPH自由基、·OH的清除能力可显著影响葛根多糖的降血糖活性，但裙带菜多糖的降血糖活性与DPPH自由基、·的清除作用具有显著相关性，与·OH清除能力无显著相关性，分析原因可能与裙带菜多糖对·和DPPH自由基的清除能力较强、·OH清除能力相对较弱有关（表3）[36-37]。

磷酸化修饰后裙带菜多糖活性的增强可能与其化学结构改变有关。多糖最佳生物活性的发挥有赖于其相对分子质量的大小[38]，与邵淑宏[39]对乌龙茶多糖的研究一致，相对分子质量较大的UPP1a-P具有更高的自由基清除能力和降血糖作用，这可能是由于相对分子质量较低时，多糖上所带的活性基团太少而无法形成有效的活性空间结构，多糖生物活性相对较弱[40]。三股螺旋结构是多糖高级结构中最具活性的空间构型[41]，与王梦绕[42]对修饰前后罗汉果多糖三股螺旋结构未发生改变结果不一致，引入磷酸基团后，裙带菜多糖出现三股螺旋结构，使多糖能够与三股螺旋结构中的1→3糖苷键结合，提高其自由基清除能力和降血糖活性。此外，UPP1a-P具有较长的侧链和较多的分支结构，且单糖之间的连接方式主要为1→3、1→2,1→4、1→6型糖苷键。刘袆帆[43]、商婷婷[44]等研究表明，分支较多、支链较长的多糖生物活性高，同时，多糖以1→3、1→4、1→6糖苷键连接时具有更高的自由基清除能力和降血糖能力[45-46]。

4 结论

裙带菜多糖经磷酸化修饰后出现磷酸基团的特征吸收峰，修饰后裙带菜多糖的最大相对分子质量为94.4×103，具有三股螺旋结构，是一种由β-糖苷键连接的吡喃型葡聚糖。其中，多糖与氨基酸主要通过—O—型糖肽键相连，单糖之间主要由0.494 mmol的1→3型、0.504 mmol的1→2,1→4型和0.002 mmol的1→6型糖苷键连接，且具有分支结构。磷酸化修饰前后的裙带菜多糖均具有一定的自由基清除能力及降血糖活性，其中，UPP1a-P对DPPH自由基、·和·OH的清除率及α-葡萄糖苷酶的抑制率均显著强于裙带菜多糖，表现出更优的自由基清除能力和降血糖活性。此外，自由基的清除能力与降血糖活性间显著正相关，且DPPH自由基和·是影响裙带菜多糖降血糖活性的主要因素。裙带菜多糖经磷酸化修饰后，化学结构发生改变，生物活性显著增强，可考虑采用磷酸化修饰方法制备具有自由基清除能力和降血糖活性的裙带菜多糖，具有广阔的应用前景，但磷酸化修饰裙带菜多糖的构效关系仍有待进一步研究。