拟穴青蟹精氨酸激酶的重组表达及致敏性分析

杨 阳，何欣蓉，何少贵，陈锦莉，刘 萌，费丹霞，毛海燕，刘光明,*

（1.厦门华厦学院环境与公共健康学院，福建 厦门 361024；2.集美大学海洋食品与生物工程学院，福建 厦门 361021；3.翔安创新实验室，福建 厦门 361104；4.厦门海洋职业技术学院海洋生物学院，福建 厦门 361102）

在过去几十年里，过敏性疾病的发病率在全球范围内显著且迅速地升高[1]。食物过敏是人体对食品中抗原物质产生的由免疫系统介导的不良反应，属于免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）介导的I型（速发型）超敏反应，其临床症状多种多样，最常见的是消化道症状、皮肤黏膜症状和呼吸道症状，严重时会产生过敏性休克甚至危及生命[2-3]。根据2021年联合国粮农组织和世界卫生组织公布的数据，引发过敏性疾病的八大类主要致敏食物为谷物、甲壳类水产品、鸡蛋、鱼类、牛乳、花生、芝麻和坚果[4]。

甲壳类水产品是亚洲最常见的致敏食物，近年来食品加工业的不断发展使得水产品来源的食品原材料被广泛添加于各类食品中，在客观上扩大了水产品过敏原的分布范围，导致我国水产食物过敏发生率呈现出上升趋势，过敏症状也更加复杂化和严重化[5-6]。甲壳类水产食物过敏主要由虾、蟹、章鱼等引起，精氨酸激酶（arginine kinase，AK）被认为是其水溶性蛋白中的主要过敏原[7]。拟穴青蟹（Scylla paramamosain）具有较高的经济价值和营养价值，是我国海水养殖产量最高的蟹类[8]，但其产量和消费量逐年升高的同时也伴随着越来越多的蟹类食物过敏问题。前期研究表明，拟穴青蟹AK是一种分子质量为40 kDa的糖蛋白，其空间结构包含1 个N端的α-螺旋结构域和C端的α-β结构域，N端的α-螺旋结构域由位于氨基酸（amino acids，AA）1～92位的5 个α-螺旋组成；C端的α-β结构域由位于AA 93～356位的7 个α-螺旋和8 个β-折叠组成；AK分子内含2 对二硫键，其中201位和271位半胱氨酸形成的二硫键对于维持AK分子规则折叠的高级结构和致敏性具有重要作用[9-10]。

对于AK的研究，拟穴青蟹肌肉中提取的天然AK（native AK，nAK）最能体现其原本致敏性，但是天然蛋白也有其不可避免的缺点。分离纯化过程中步骤繁琐、过敏原组分含量和生物活性存在差异，以及处理过程中过敏原的降解等问题，都使提取天然过敏原难以标准化、程序化和量产化。因此，通过分子生物学方法制备的重组食物过敏原成为替代天然过敏原应用于食品安全检测、过敏性疾病诊断和治疗的重要工具[11]。前期Mao Haiyan等[12]利用大肠杆菌（Escherichia coli）原核表达系统获得了拟穴青蟹重组AK（recombinant AK，rAK），并证实rAK与nAK具有相似的IgE结合活性。但费丹霞[13]对rAK和nAK的性质比较发现rAK分子中游离巯基含量和疏水性高于nAK，即蛋白质分子空间结构折叠松散。AK分子内二硫键是维持其空间结构和致敏性的重要因素，rAK与nAK空间结构的差异可能导致二者稳定性和致敏性的差异[10,12]，因此rAK是否能够替代nAK需进一步通过致敏性评估进行验证。此外，目前已报道的甲壳类水产品AK的线性表位主要分布于AA 29～53、AA 101～110、AA 113～155、AA 204～225和AA 308～330[10,12,14-16]。从结构上看，AA 29～53位于AK N端的α-螺旋结构域，其余线性表位区域则位于其C端的α-β结构域[9-10,12,14-16]，但在机体中这些抗原表位所发挥的作用也需进一步评估。

对于过敏原致敏性的评估主要包括体内和体外2 种方式。目前应用最多的过敏原致敏性体内评估方式是动物模型，即利用鼠、兔等动物模拟人体食物过敏反应，检测其血清中的抗体水平及免疫细胞的变化情况，从而达到对过敏原致敏性评估的目的，这种方法在高度模拟过敏原在体内作用方式的同时，也避免了过敏原对人体造成的威胁[17]。根据过敏反应的发生机制，机体中效应细胞表面的特异性IgE和入侵机体的过敏原是触发过敏反应的物质基础，因此过敏原致敏性的体外评估除血清学分析外，还包括细胞模型[18]。过敏反应发生时效应细胞会产生介质释放、脱颗粒等变化，因此过敏原激发效应细胞释放介质的能力也可作为评估其致敏性的一个标准，目前大鼠嗜碱性白血病（rat basophilic leukemia，RBL）-2H3细胞脱颗粒模型是一种较为常用的过敏原致敏体外评估模型[19]。RBL-2H3细胞表面高表达IgE高亲和力受体，且细胞内存在预先合成的β-己糖苷酶，经IgE敏化的RBL-2H3细胞可被抗原激发而发生脱颗粒、释放β-己糖苷酶，细胞脱颗粒时释放的β-己糖苷酶与过敏相关活性物质的释放呈正相关[20]。因此，在过敏原的致敏性体外评估中常用致敏小鼠血清特异性IgE敏化的RBL-2H3细胞建立模型，以β-己糖苷酶的释放作为脱颗粒的一个衡量标准，评价过敏原的致敏性[10,21-22]。

获得高纯度、标准化的过敏原对后续致敏机理的相关研究、过敏原检测、过敏性疾病的诊断和治疗等都具有重要意义，重组蛋白具有易标准化、量产化等优势，与天然过敏原具有相似理化特性和免疫学特性的重组过敏原具有重要的应用潜力。此外，探究过敏原分子中主要的表位分布区域在机体过敏时所发挥的作用，可为过敏原检测、过敏性疾病的治疗提供依据。因此，本研究针对拟穴青蟹AK，根据其已报道的空间结构和抗原表位对该分子进行分段并利用E.coli原核表达系统对分段的基因进行重组表达；进一步通过BALB/c小鼠致敏模型和RBL-2H3细胞模型对nAK、rAK及AK分段表达产物致敏性进行评估，比较分析nAK和rAK的致敏性，并鉴定AK分子中致敏的主要表位区域，以期为AK检测及过敏性疾病诊断、治疗提供一定理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜活的拟穴青蟹购自厦门市集美区集美菜市场。

6～8 周龄雌性BALB/c小鼠，无特定病原体级别，购自中国科学院上海实验动物中心，生产许可证号：SCXK（闽）2016-0006。

E.coliTop10/BL21感受态、质粒pEASY-T1、T4连接酶北京全式金生物技术有限公司；TaqDNA聚合酶、限制性内切酶NdeI、SalI、DNA Marker（DL2000）日本Takara公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒 天根生化（中国）有限公司；辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的羊抗鼠IgE、IgG1、IgG2a抗体、HRP-羊抗兔IgG抗体 美国Abcam公司；小鼠淋巴细胞分离液 中国达科为生物技术有限公司；小鼠白细胞介素4（interleukin 4，IL-4）、IL-13、干扰素γ（interferon γ，INF-γ）酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒美国Peprotech公司；明矾佐剂、Ni2+-次氨基三乙酸（nitrilotriacetic acid，NTA）琼脂糖凝胶柱 赛默飞世尔科技（中国）有限公司；大鼠嗜碱性粒细胞（RBL-2H3）上海复祥生物技术有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；rAK表达菌株（E.coli）由本实验室Mao Haiyan等[12]前期构建。其他试剂均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 仪器与设备

PTC-1198聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪、DNA水平电泳槽、蛋白垂直电泳槽、Biologic LP蛋白层析系统、Bench mark 96酶标仪美国Bio-Rad公司；Bio-Profile凝胶成像仪 法国Vibler Lourmant公司；AvantiTM JA-25高速冷冻离心机（大型）美国Beckman公司。

1.3 方法

1.3.1 拟穴青蟹AK的分段和引物设计

根据对AK序列的分段信息，利用Primer 5.0软件设计4 对带有酶切位点的分段扩增引物，为使限制性内切酶能够有效识别酶切位点，分别在AK-E1上游引物和下游引物的5′端加入CCG和CGC保护性碱基，实验所用引物由厦门瑞辰铂生物技术有限公司合成（表1）。

表1 AK基因分段引物序列、内切酶及酶切位点Table 1 Primer sequences,endonucleases,and cleavage sites used for amplification of gene fragments of AK

1.3.2 AK片段的基因扩增及表达载体构建

以实验室前期构建的rAK表达菌株质粒（pET-28a载体）pET-AK作为PCR反应的模板[12]，对AK的4 个片段进行PCR扩增，PCR程序参数为：94 ℃预变性，5 min；94 ℃变性，30 s，根据表1的引物退火温度退火，45 s；72 ℃延伸，60 s；变性、退火、延伸过程共进行30 个循环后72 ℃延伸10 min，反应结束后采用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，切胶回收目的条带。将扩增得到的AK片段基因与pEASY-T1载体连接，构建AK的分段克隆载体，转化Top10感受态细胞，涂布于含卡那霉素的LB平板，37 ℃培养过夜，挑取单菌落进行高温裂解作为菌落PCR模板，采用与4 个AK片段PCR扩增反应相同的条件进行PCR扩增。根据扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果，选取PCR产物分子质量与设计的片段大小相符、扩增条带单一的克隆子测序。将测序正确的分段克隆载体及表达载体pET-28a分别采用表1所列的限制性内切酶进行双酶切后，回收酶切产物，用T4 DNA连接酶将目的基因片段与载体酶切产物于16 ℃连接18 h，转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中，构建rAK分段表达载体pET-28a-AK-E1、pET-28a-AK-E2、pET-28a-AK-E3和pET-28a-AK-E4。将转化了连接产物的大肠杆菌BL21涂布于含卡那霉素的LB平板，筛选能够在含卡那霉素抗性固体培养平板上生长的菌株，委托厦门瑞辰铂生物技术有限公司对菌株所携带的重组质粒进行测序。

1.3.3 重组蛋白的小量诱导表达

表达载体在BL21中的表达及检测参照He Xinrong等[23]的方法，选取上述测序正确的表达宿主菌种接种于含卡那霉素的LB液体培养基，培养至600 nm波长处的光密度（optical density，OD）（OD600nm）为0.6左右，加入异丙基硫代半乳糖苷至浓度为0.5 mmol/L，37 ℃下诱导培养4 h。离心（4 ℃、10 000×g、1 min）回收菌体，用含0.5 mol/L NaCl的50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）重悬后超声破碎。收集全菌液，离心（4 ℃、12 000×g、2 min）得到上清液及沉淀，利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）鉴定诱导表达结果。

1.3.4 nAK、rAK和AK分段表达产物的纯化及鉴定

nAK的纯化参照Yang Yang等[9]的方法，新鲜拟穴青蟹肌肉经组织捣碎、硫酸铵盐析、Q-Sepharose阴离子交换柱层析后，收集目的蛋白进行SDS-PAGE分析。rAK和AK分段表达产物的纯化参照Huang Yuhao等[24]的方法，将诱导表达后的重组质粒菌液进行超声破碎后离心（4 ℃、12 000×g、20 min），可溶表达的重组蛋白取上清；包涵体蛋白弃上清后沉淀用4 mol/L脲复溶，于2 mol/L脲和不含脲的缓冲液中分步透析复性；选择Ni2+-NTA琼脂糖凝胶柱纯化目的蛋白，收集目的蛋白，采用SDS-PAGE检测纯化结果。纯化的蛋白采用Yang Yang等[10]制备的兔抗拟穴青蟹AK IgG多克隆抗体为一抗，通过Western blot对纯化的蛋白进行鉴定。

1.3.5 BALB/c小鼠致敏模型构建

小鼠实验全程在集美大学水产学院动物中心（实验动物使用许可证号：SYXK（闽）2016-0006）进行。将42 只BALB/c小鼠分为磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）对照组、nAK致敏组、rAK致敏组、AK-E1～AK-E4致敏组，每组各6 只）。纯化的抗原根据BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书测定质量浓度并调整质量浓度至1 mg/mL后，与明矾佐剂以3∶1（V/V）混匀，对照组小鼠注射采用等体积的PBS代替抗原。致敏方式为在第0、14天以腹腔注射的方式敏化小鼠，每只小鼠注射200 μg抗原。第2次腹腔注射后1 d，眼球取血并分离血清用于特异性抗体水平检测[25]。将小鼠宰杀，取出脾脏，分离淋巴细胞，将细胞数量调整为2×105个/mL，加入100 μg/mL抗原，对照组细胞加入等体积培养基，放置于37 ℃的CO2细胞培养箱刺激培养72 h。将刺激培养后的细胞离心（25 ℃、4 000×g、10 min），回收上清液用于脾脏淋巴细胞因子释放水平检测[26]。

1.3.6 BALB/c小鼠血清特异性抗体及脾脏淋巴细胞因子释放水平测定

参照史云凤等[27]的方法，采用间接ELISA检测小鼠血清中AK-特异性IgE（specific IgE，sIgE）、AK-sIgG1和AK-sIgG2a抗体水平。以10 μg纯化的nAK包被96 孔板，4 ℃孵育过夜；用TPBS（含0.05%吐温-20的20 mmol/L PBS）洗涤3 次后，用5 g/100 mL脱脂乳于37 ℃封闭2 h；洗涤3 次后加入以1 g/100 mL脱脂乳稀释5 倍的小鼠血清样品，37 ℃孵育2 h；洗涤5 次后加入二抗（HRP-羊抗鼠IgE、IgG1、IgG2a抗体），37 ℃孵育2 h；洗涤5 次后加入3,3,3′,5,5′-四甲基联苯胺底物，37 ℃避光反应20 min后用2 mol/L H2SO4终止反应，在450 nm波长处检测各孔的OD450nm。同时，以小鼠血清（1∶5稀释）为一抗，HRP-羊抗鼠IgE、IgG1、IgG2a抗体为二抗，采用Western blot对小鼠血清中AK特异性抗体水平进行检测[25]。

小鼠脾脏淋巴细胞刺激培养后上清液细胞因子质量浓度的检测均按照细胞因子（IL-4、IL-13、INF-γ）检测试剂盒说明书采用ELISA法进行检测。

1.3.7 RBL-2H3细胞脱颗粒效率测定

将培养至对数生长期的RBL-2H3细胞调整至浓度为1×106个/mL，在48 孔细胞培养板中每孔加入200 μL，并添加1.3.5节以nAK免疫小鼠后获得的鼠抗拟穴青蟹nAK抗血清（10 μL/孔），放置于37 ℃的CO2细胞培养箱中培养过夜。用PBS洗涤细胞3 次，将各抗原按照浓度梯度溶于200 μL Tyrode’s缓冲液，分别加入培养板中，阴性对照孔加入等体积PBS，继续培养6 h。回收细胞培养上清，每孔加入200 μL含0.1% Triton X-100的Tyrode’s缓冲液冰浴5 min，使培养板底部的细胞完全裂解后回收。取25 μL上清/细胞裂解液，加入100 μLβ-氨基己糖苷酶的底物1.2 mmol/L 4-甲基伞形酮基-N-乙酰基-b-D-氨基葡萄糖苷，于37 ℃反应30 min，当体系中含有β-氨基己糖苷酶时，可将该底物分解，释放荧光分子，在360 nm激发波长、450 nm发射波长下可测定荧光强度，该荧光强度可反映细胞的β-氨基己糖苷酶水平[28]。抗原刺激细胞脱颗粒的能力以脱颗粒效率表示，按下式计算：

1.4 数据处理

实验所得数据采用GraphPad软件分析，数据进行方差分析，采用Tukey多重检验法进行显著性检验。数据均平行测定3 次，结果以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 重组蛋白的表达

2.1.1 AK片段表达载体的构建及测序

根据拟穴青蟹AK的AA序列（GI：375298903）和已解析的晶体结构（PDB：5ZHQ），以及已鉴定的抗原表位[9-10,12,14]，AK的N端α-螺旋结构域中包含1 个位于AA 29～53的线性表位区域，因此首先确定AK-E1为AA 1～92。在AK分子C端的α-β结构域中，主要有3 个线性表位的分布区域：AA 101～110和AA 113～155、AA 204～225、AA 308～330。根据线性表位在C端结构域的分布，并确保各分段表达产物相对分子质量较一致且分段表达产物中α-螺旋和β-折叠结构不受破坏，从无规卷曲区域选择AK的分段位点，确定AK的C端的α-β结构域分为AK-E2（AA 87～187）、AK-E3（AA 172～265）和AK-E4（AA 276～357）3 段（图1）。以rAK表达质粒pET-AK为PCR扩增模板，分别采用4 对引物进行扩增后，由琼脂糖凝胶电泳结果（图2）可知，扩增的4 个基因大小与设计的目的基因片段大小基本相符。将产物回收，构建分段克隆载体，转入Top 10克隆宿主大量扩增后，回收质粒，将目的条带与pET-28a载体双酶切后连接，构建分段表达载体，转化BL21表达宿主。选取菌落PCR阳性克隆子进行测序。

图1 AK的分段表达示意图Fig.1 Schematic diagram of partial expression of AK

图2 AK片段PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图Fig.2 Agarose gel electropherograms of PCR amplification products of AK fragments

2.1.2 重组蛋白的诱导表达及nAK、rAK、分段表达产物的纯化

将测序结果正确的宿主表达菌在37 ℃下诱导表达后，提取超声处理的上清液和沉淀，用SDS-PAGE分析各重组蛋白的表达情况，并采用Western blot对表达产物进行鉴定。由图3可知，AK-E1为可溶表达，AK-E2、AK-E3和AK-E4则以包涵体形式表达，各分段表达产物大小约为14 kDa，与理论值相符，并且目的蛋白均能被兔抗拟穴青蟹AK IgG多克隆抗体特异性识别，表明获得的表达产物为AK的片段。AK-E1为可溶表达蛋白，直接上样于Ni2+-NTA琼脂糖凝胶柱，用Ni2+吸附纯化带有His标签的重组蛋白；AK-E2、AK-E3包涵体蛋白溶解于4 mol/L脲，透析复性后上样于Ni2+-NTA琼脂糖凝胶柱，用Ni2+吸附纯化带有His标签的重组蛋白；AK-E4包涵体蛋白溶解于4 mol/L脲，透析复性后离心收集上清液中的重组蛋白。分别参照Mao Haiyan[12]、Yang Yang[9]等的方法纯化rAK和nAK。通过SDS-PAGE检测经柱层析分离的样品（图4）并分别对各泳道的目的蛋白纯度进行分析，结果表明，纯化后目的蛋白纯度均达到90%以上。

图3 AK分段表达产物的SDS-PAGE和Western blot检测结果Fig.3 SDS-PAGE and Western blot analysis of AK fragments

图4 nAK、rAK及AK分段表达产物的SDS-PAGE分析结果Fig.4 SDS-PAGE analysis of nAK,rAK,and AK fragments

2.2 重组蛋白的致敏性分析

2.2.1 重组蛋白和nAK致敏BALB/c小鼠的血清学分析

由图5A可知，nAK敏化组小鼠的血清特异性IgE升高最为明显，ELISA检测结果OD450nm为1.098±0.008，显著高于rAK和AK分段表达产物敏化组小鼠（P＜0.05）。重组蛋白中，rAK、AK-E1、AK-E2、AK-E3都能刺激小鼠产生AK-sIgE，其中rAK敏化组小鼠OD450nm升高至0.472±0.002，显著高于对照组和AK分段表达产物敏化组，而AK的4 个片段中，AK-E2可刺激机体产生较高水平的AK-sIgE。Western blot检测结果表明，nAK和rAK敏化组小鼠血清中的IgE能够特异性识别结合AK，但AK分段表达产物敏化组小鼠血清中的IgE水平较低，未出现免疫印迹。

图5 第2次腹腔注射后1 d小鼠血清中AK特异性抗体的Western blot和ELISA检测结果Fig.5 Western blot and ELISA analysis of AK-specific antibodies in the serum of mice at 1 d after the second intraperitoneal injection

对AK-sIgG1的ELISA检测结果（图5B）表明，与PBS组小鼠血清相比，nAK（OD450nm＝1.975±0.058）、rAK（OD450nm＝1.891±0.088）、AK-E2（OD450nm＝1.772±0.105）和AK-E3（OD450nm＝0.929±0.085）敏化组小鼠血清中的AK-s IgG 1 含量显著升高（P＜0.05），AK-E1（OD450nm＝0.082±0.003）和AK-E4（OD450nm＝0.126±0.004）敏化组小鼠注射抗原后未检测到其血清中AK-sIgG1水平升高。通过Western blot检测，nAK、rAK、AK-E2及AK-E3组小鼠血清中的AKsIgG1呈阳性，与ELISA检测结果相符。小鼠血清中AKsIgG2a水平的ELISA测定结果（图5C）表明，与PBS组相比，nAK（OD450nm＝0.965±0.042）、rAK（OD450nm＝0.694±0.010）、AK-E2（OD450nm＝0.468±0.018）、AK-E3（OD450nm＝0.481±0.001）和AK-E4（OD450nm＝0.456±0.001）敏化组小鼠血清中的AK-sIgG2a水平显著升高（P＜0.05），AK-E1（OD450nm＝0.090±0.002）组小鼠注射抗原后未检测到其血清中AK-sIgG2a水平的升高。各组血清中AK-sIgG2a水平的Western blot检测结果与ELISA检测结果均相符。此外，在nAK、rAK、AKE1、AK-E2和AK-E3敏化小鼠中，sIgG1水平均明显高于sIgG2a，即IgG1/IgG2a比值均大于1，表明在能够产生特异性IgE的小鼠机体内过敏反应均为Th2型[29]。

2.2.2 小鼠脾脏细胞培养上清液中细胞因子水平

由图6可知，与PBS组相比，nAK敏化组小鼠的淋巴细胞刺激培养上清中，IL-4（（63.067±1.359）pg/mL）、IL-13（（20.767±0.040）pg/mL）和IFN-γ（（133.289±2.393）pg/mL）水平均显著升高，且显著高于重组蛋白组（P＜0.05）。rAK敏化组小鼠淋巴细胞的刺激培养上清中IL-4（（49.501±0.352）pg/mL）、IL-13（（14.851±1.073）pg/mL）和IFN-γ（（68.141±7.464）pg/mL）水平也有显著升高（P＜0.05），而在分段表达产物中，AK-E2能够刺激淋巴细胞释放较高水平的IL-4（（50.668±0.759）pg/mL），且其释放水平与rAK组无显著差异。在I型超敏反应中，Th0向Th2分化、Th1/Th2失衡、IgE含量增加是关键环节，而Th2分泌IL-4、IL-13等多种细胞因子，具有诱导B细胞的免疫球蛋白类别转化、导致IgE水平升高并协同IL-3共同刺激肥大细胞增殖等功能[30]。nAK、rAK和AK-E2敏化组小鼠脾脏淋巴细胞刺激培养上清中的Th2型细胞因子与其血清中特异性抗体水平一致，表明与nAK相比，rAK对机体的敏化能力较弱，而在AK分子中，AK-E2（AA 87～187）在致敏阶段发挥较为重要的作用。对Th1型细胞因子IFN-γ水平的检测结果表明，nAK组IFN-γ水平同样最高，但有研究表明这一细胞因子还参与机体的炎症反应[31]，表明AK敏化组小鼠机体中IFN-γ水平升高可能主要是因为参与机体的炎症反应。

图6 nAK、rAK及AK分段表达产物对小鼠脾脏淋巴细胞因子释放影响的ELISA检测结果Fig.6 ELISA analysis of effects of nAK,rAK and AK fragments on cytokine levels in splenocyte culture

2.2.3 rAK及AK分段表达产物对RBL-2H3细胞脱颗粒的影响

用不同质量浓度梯度的重组蛋白刺激经AK-sIgE敏化过夜的细胞，以nAK为阳性对照，PBS为阴性对照，评价各重组蛋白刺激RBL-2H3细胞的脱颗粒效率。由表2可知，与PBS组相比，当nAK质量浓度达到50 μg/mL时就能够使细胞产生明显脱颗粒反应，而rAK则在质量浓度达到100 μg/mL时能够引起细胞产生明显的脱颗粒。AK的4 个分段表达产物均能够引起RBL-2H3细胞脱颗粒，但其能够引起细胞脱颗粒所需的质量浓度比rAK高出10 倍以上，AK的分段表达产物刺激RBL-2H3细胞脱颗粒效率的程度为AK-E2＞AK-E4＞AK-E3＞AK-E1。

表2 nAK、rAK及AK分段表达产物对RBL-2H3细胞脱颗粒效率的影响Table 2 Effect of nAK,rAK and AK fragments on the degranulation efficiency of RBL-2H3 cells %

3 讨论

水产品是人们日常饮食的重要组成部分，是营养的重要来源，但同时也是引起食物过敏的重要因素，甲壳类水产品引起的过敏反应可引起皮肤红疹、面部及喉部水肿，甚至引发休克，在亚洲沿海地区这种现象尤为常见[32]，因此，甲壳类水产品过敏原的研究开始受到广泛关注。重组过敏原可以作为天然过敏原的一种替代物，特别是用于过敏原标准物的制备，在过敏原研究中具有重要意义[33]。

重组表达系统主要包括原核表达系统、真核表达系统和无细胞表达系统，其中大肠杆菌原核表达系统因其成本低、表达量高、易于培养等优势被广泛应用于重组过敏原的表达。史云凤等[27]以大肠杆菌原核表达系统成功重组表达了花生过敏原Ara h 1，并通过体内和体外致敏性评估方法证实重组Ara h 1与天然Ara h 1蛋白性质、致敏性相似。此外，目前已有多种由大肠杆菌表达系统获得的重组过敏原被证实与天然过敏原具有相似的IgE结合性，并广泛应用于过敏原组分诊断和抗原特异性治疗等领域[11]。但是大肠杆菌作为一种原核表达宿主，也存在缺乏翻译后修饰作用、无法使蛋白质形成正确折叠的空间结构等问题，而大多数过敏原属于糖蛋白，且多肽链经过正确折叠形成的空间结构对某些过敏原的致敏性也有重要影响，因此糖基化、二硫键形成等翻译后修饰过程是影响某些过敏原致敏性的关键因素[34]。Huang Yuhao等[24]以大肠杆菌表达宿主表达大菱鲆小清蛋白，对天然和重组小清蛋白等性质分析发现，重组小清蛋白钙离子结合方式与天然蛋白有所差异，导致其IgG结合活性及消化稳定性弱于天然过敏原。前期Mao Haiyan等[12]证实rAK与nAK具有相似的IgE结合活性，但本研究通过体内实验证实二者的免疫原性存在较大差异，rAK致敏BALB/c小鼠后，血清中特异性抗体水平显著升高，但显著低于nAK致敏组小鼠；Th2型细胞因子（IL-4、IL-13）水平也显著低于nAK致敏组小鼠。RBL-2H3细胞的β-己糖苷酶释放率检测结果表明，rAK刺激效应细胞脱颗粒的能力较nAK弱，进一步证实尽管rAK的IgE结合活性与nAK相似，但在机体内，其免疫原性弱于天然过敏原。费丹霞[13]对rAK和nAK的理化特性分析比较发现，rAK分子中二硫键含量较nAK少，且其热稳定性较天然蛋白差，在30 ℃时即产生多聚体。AK分子中的二硫键是其空间结构稳定性的关键，由此可推测，通过原核表达系统获得的rAK由于无法形成二硫键而导致空间结构变化及理化特性改变，是其免疫原性弱于nAK的重要原因。因此，由原核表达系统表达的rAK无法完全替代天然过敏原，通过更换表达系统，实现rAK分子的翻译后修饰和空间结构的正确形成是获得高免疫原性rAK的重要措施。尽管如此，低免疫原性的重组蛋白被证实在应用于过敏性疾病的临床诊断和过敏原特异性治疗过程中有较高的安全性[35-36]，因此，rAK这种高IgE结合活性、低免疫原性的特点可为甲壳类水产品过敏性疾病的诊断和治疗提供参考。

过敏原分子中抗原表位是抗体分子和免疫细胞识别抗原的基本单位，因此，对于食物过敏的研究逐渐深入至抗原表位水平，关于甲壳类水产品AK抗原表位的研究也已较为深入[14-15]。为进一步探究AK致敏的关键表位，本研究根据AK线性表位的分布情况及其结构域将AK分为AK-E1（AA 1～92）、AK-E2（AA 87～187）、AK-E3（AA 172～265）和AK-E4（AA 276～357）4 个部分，进行分段重组表达。以4 个分段表达产物免疫BALB/c小鼠，结果发现，AK-E2区域在机体内的免疫原性最强，而AK-E4最弱；利用RBL-2H3细胞模型对4 个分段表达产物刺激效应细胞的能力进行比较发现，AK-E2和AK-E4能刺激细胞释放较高水平的β-己糖苷酶。从AK分子的抗原表位分布情况看，AK-E1、AK-E3主要为构象表位分布区域[10,14]，分段表达产物失去AK分子的空间结构，无法形成原有的构象表位，是该片段免疫原性较弱的重要原因；而AK-E2是AK分子中线性表位较为集中的区域[10,12,14-15]，刺激机体产生免疫反应的能力较强，因此，针对该区域通过食品加工或分子生物学手段改造AK有望有效降低AK的致敏性。AK-E4也是AK分子中线性表位分布较多的区域[10,12,14-15]，但其刺激机体产生AK特异性抗体的能力较弱，这可能与该片段长度较小有关，尽管如此，该片段对效应细胞具有较强的刺激作用，可能在机体过敏的效应阶段发挥较重要的作用，有望用于食品中过敏原的检测及蟹类过敏性疾病的诊断。

4 结论

本研究成功重组表达了拟穴青蟹AK的4 个区域，且利用BALB/c小鼠模型和RBL-2H3细胞模型对nAK、rAK及AK的分段表达产物进行了致敏性分析，证实通过原核表达系统获得的rAK免疫原性较nAK弱，而AK分子中免疫原性较强的区域为AA 87～187，免疫反应性较强的区域为AA 276～357。相关结果为利用重组蛋白进行过敏原标准物质的制备以及食物过敏的诊断、治疗提供了理论依据。