异黄酮与β-伴大豆球蛋白的相互作用及其对蛋白结构和潜在致敏性的影响

邓 雯，廖雅如，黄丽衡，杨安树,2,*，陈红兵,2

（1.南昌大学 食品科学与资源挖掘全国重点实验室，江西 南昌 330047；2.南昌大学中德联合研究院，江西 南昌 330047）

大豆营养丰富，蛋白质含量高，是人们日常饮食中重要的蛋白质来源[1]。但大豆又是常见的过敏食物之一，目前仍没有可完全治愈大豆过敏的方法，患者最有效的方法是规避摄入大豆过敏原[2]。β-伴大豆球蛋白（β-conglycinin，BCG）是大豆中的主要过敏原之一[3]。迄今为止，工业上使用的任何单一的食品加工处理都不能完全消除大豆的致敏性[4]，而且还极易破坏大豆的营养成分与功能特性[5]。所以，寻找安全有效的新型方法降低大豆致敏性具有重要意义。大豆异黄酮是一种植物类雌激素[6]，其中活性成分主要为染料木素（genistein，Gen）、大豆苷元（daidzein，Dai）和黄豆黄素（glycitein，Gly），具有抗氧化[7]、抗过敏、预防骨质疏松、防癌抗癌等功效[8]。研究显示，大豆异黄酮可以调节Th1/Th2平衡、减少免疫因子合成、加强人体对致敏食物的耐受[9]。有研究表明，大豆异黄酮可显著减少花生过敏小鼠的肥大细胞脱颗粒，有效缓解小鼠过敏症状的发生[10]。迄今为止，黄酮类化合物抗过敏的相关报道，多数文献主要围绕黄酮类化合物本身开展抗过敏作用研究，一般通过调节机体免疫系统的平衡和减少效应细胞中活性介质的释放来缓解过敏反应。近年来，从食物组分干预的角度研究抗过敏作用受到广泛关注，如通过主要过敏蛋白与多酚类、黄酮类活性物质发生相互作用，可降低花生过敏蛋白的致敏性[11-12]。由于不同种类异黄酮与不同过敏蛋白的相互作用机制及其对复合物结构与致敏性的影响也存在差异，大豆异黄酮能否改变大豆中主要过敏原蛋白的结构从而影响其致敏性，有待进一步研究。

本研究以Gen、Dai 2 种活性异黄酮和BCG为研究对象，利用荧光光谱法分析异黄酮与蛋白相互作用机制及其复合物的结构，并利用竞争酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法和免疫印迹评估复合物及其消化产物的致敏性，以期在分子水平为活性大豆异黄酮与BCG相互作用机制提供新的见解，并为其在食物过敏预防和管理中的潜在应用提供新的方向。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

BCG（纯度为84.1%）实验室自制；Gen、Dai（纯度≥98%）上海源叶生物科技有限公司；苯氨基-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）、胃蛋白酶、胰蛋白酶、生物素标记的羊抗人免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）美国Sigma公司；大豆过敏患者血清（详细信息见表1）重庆曼纽艾克科技有限公司；辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的链霉亲和素 深圳欣博盛生物科技有限公司；其他试剂均为分析纯。

表1 大豆过敏患者血清信息Table 1 Sera information about soybean allergic patients participating in this study

1.2 仪器与设备

F-4600荧光分光光度计 日本Hitachi公司；Varioskan LUX多功能酶标仪 美国Thermo Fisher Scientific公司；MOS-450圆二色光谱仪 法国Bio-Logi公司；UV WinLab紫外分光光度计 美国Perkin Elmer公司。

1.3 方法

1.3.1 荧光猝灭光谱分析

首先扫描BCG样品（2×10-6mol/L）的荧光光谱，再依次将60 μL异黄酮溶液（2×10-4mol/L）等分10 次加入，扫描混合溶液的荧光光谱。同时扫描磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）的荧光光谱作为空白对照，并扣除相应浓度异黄酮溶液的荧光。光谱条件：在温度298 K和314 K下，设定激发波长（λex）为280 nm，发射波长（λem）为250～500 nm，狭缝宽度为2.5 nm，固定扫描速率为1 200 nm/min。分别以Gen、Dai浓度为横坐标、F0/F为纵坐标拟合得到Stern-Volmer曲线进行分析，方程如式（1）所示：

式中：F和F0分别为有、无猝灭剂时的大分子荧光强度；[Q]为淬灭剂浓度/（mol/L）；KSV为猝灭常数/（L/（mol·s））；Kq为生物分子的猝灭速率常数/（L/mol）；τ0为无猝灭剂时生物大分子的平均寿命（10-8s）。

1.3.2 同步荧光光谱分析

在Δλ=15/60 nm 条件下，扫描BCG 溶液（2×10-6mol/L）的同步荧光光谱，再将60 μL异黄酮溶液（2×10-4mol/L）分5 次加入，每次加入后静置3 min后，依次扫描混合溶液的荧光光谱，并扣除相应浓度异黄酮溶液的荧光。

1.3.3 三维荧光光谱分析

配制BCG与异黄酮物质的量比分别为1∶1、1∶10、1∶20的混合溶液，以PBS作为空白对照，扫描其三维荧光光谱，并扣除相应浓度异黄酮溶液的荧光。扫描条件为：激发波长200～400 nm，发射波长200～600 nm，光谱采集间距5 nm，温度298 K。

1.3.4 外源性荧光光谱分析

室温条件下，配制不同浓度异黄酮溶液，分别加入BCG溶液（0.2 mg/mL）中，得到不同物质的量比混合溶液，静置2 h。将20 μL 5 mmol/L ANS溶液加入2 mL混合溶液中，黑暗条件下反应30 min后，扫描疏水性荧光光谱，并扣除相应浓度异黄酮溶液的荧光。扫描条件为：激发波长390 nm，发射波长400～600 nm。

1.3.5 圆二色光谱分析

配制不同浓度异黄酮溶液，加入BCG溶液（0.2 mg/mL）中，得到不同物质的量比混合溶液，静置2 h后扫描圆二色光谱。设置扫描范围为190～250 nm，光径为1 mm，扫描速率为60 nm/min，扫描间隔为1 nm，相关结果利用圆二色光谱在线分析网站（http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk/html/process.shtml）进行整理分析。

1.3.6 异黄酮-BCG复合物的制备

复合物制备参考Sui Xiaonan等[13]的方法，主要步骤如下：1）碱性复合物：用PBS（pH 9.0）将BCG稀释至4 mg/mL，将异黄酮溶液稀释至0.4 mmol/L后边搅拌边加入蛋白溶液中，调节混合溶液pH值为9.0，室温搅拌反应24 h后超滤除去游离异黄酮；2）中性复合物：与碱性复合物制备大致相同，但略有改动。BCG溶液和异黄酮稀释后不调节pH值，搅拌反应时间为2 h。

将BCG在碱性条件下分别与Gen、Dai制备的复合物标注为BCG-Gen-A、BCG-Dai-A，在中性条件下分别与Gen、Dai制备的复合物标注为BCG-Gen-N、BCGDai-N。

1.3.7 竞争ELISA

参考张英[14]方法，采用竞争抑制ELISA法检测BCG及其复合物与大豆过敏患者血清特异性IgE的结合能力。通过方阵滴定法确定蛋白的包被质量浓度为0.4 µg/mL，大豆过敏患者血清（一抗）稀释倍数为1∶35，生物素标记的羊抗人IgE（二抗）稀释倍数为1∶10 000，HRP标记的链霉亲和素稀释倍数为1∶300。用酶标仪检测样品在450 nm波长处的光密度（OD450nm），按式（2）计算抑制率，IgE结合能力以半抑制质量浓度（50% inhibiting concentration，IC50）表示。

1.3.8 复合物体外模拟胃肠消化

包括模拟婴幼儿胃肠消化和模拟成人胃肠消化，参考Dupont[15]、孟轩夷[16]等的方法并稍作修改。

1.3.8.1 模拟婴幼儿胃肠消化

模拟胃消化：在离心管中分别加入5 mL的BCG及复合物（2 mg/mL）。将6.9 mL KCl溶液（0.5 mol/L）、12.5 mL NaHCO3溶液（1 mol/L）、11.8 mL NaCl溶液（2 mol/L）、0.9 mL KH2PO4溶液（0.5 mol/L）、0.4 m L M g C l2(H2O)6溶液（0.1 5 m o l/L）和0.5 mL (NH4)2CO3溶液（0.15 mol/L）混匀，调节pH值为3.0，定容至500 mL配制成胃储液，加入4.909 mL胃储液和91 μL胃蛋白酶（2 500 U/mL），调节pH值至3.0，将所有样品置于摇床（37 ℃、100 r/min）中消化反应2 h，滴加NaHCO3调节溶液pH值至7.0终止反应。

模拟肠消化：在离心管中加入5 mL胃消化后的样品。将6.8 mL KCl溶液（0.5 mol/L）、42.5 mL NaHCO3溶液（1 mol/L）、9.6 mL NaCl溶液（2 mol/L）、0.8 mL KH2PO4溶液（0.5 mol/L）和1.1 mL MgCl2(H2O)6溶液（0.15 mol/L）混匀，调节pH值为6.5，定容至500 mL配制成肠储液，通过加入4.94 mL肠储液、35 μL胰酵素（2.5 mg/mL）和25 μL CaCl2(H2O)2（0.3 mol/L）溶液模拟肠消化环境，调节溶液pH值至6.5后，将所有样品置于摇床中反应2 h，沸水浴加热5 min结束消化。

1.3.8.2 模拟成人胃肠消化

实验步骤与婴幼儿胃肠消化类似，实验参数略有改动。成人胃消化：胃蛋白酶活力为182 U/mg，pH值为2.5。成人肠消化：胰蛋白酶活力为35 U/mg，pH值为6.5。

1.3.9 复合物消化产物免疫印迹

参考常雪娇[17]方法对BCG胃肠消化产物进行免疫印迹鉴定。将胃肠消化产物经过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，电泳凝胶洗涤后在转印仪上进行转膜，设置转膜电压100 V，电流400 mA，时间60 min，转膜结束后在室温下封阻1 h；加入大豆过敏患者血清（一抗，1∶10）后，4 ℃孵育过夜，含0.1% Tween-20的Tris缓冲液（Tris buffered saline with Tween-20，TBST）漂洗3 次；加入生物素标记的羊抗人IgE（二抗，1∶2 500），室温孵育60 min，TBST漂洗3 次；滚动孵育HRP标记的链霉亲和素（1∶60稀释）60 min，TBST漂洗3 次；再使用增强型化学发光显色剂显色，并立即用凝胶成像系统拍照。

1.4 数据处理

所有实验均重复测定3 次。采用Excel软件对实验所得数据进行处理，采用SPSS 26.0软件进行差异显著性分析，以P＜0.05表示差异显著，通过Origin软件作图。

2 结果与分析

2.1 异黄酮与BCG相互作用

2.1.1 荧光猝灭机制

通过荧光猝灭光谱分析Gen/Dai与BCG相互作用的猝灭机制。由图1中Stern-Vlomer图可以观察到，随着Gen和Dai添加量的增加，蛋白荧光强度呈线性下降趋势。根据表2中数据，在298 K和314 K条件下加入Gen和Dai后，BCG的Kq均远大于2.0×1010L/（mol·s）（最大扩散碰撞猝灭常数）[18]，说明2 种活性异黄酮与BCG发生的猝灭属于静态猝灭[19-20]。静态猝灭是多酚类化合物与蛋白结合的常见猝灭方式，在多酚-玉米醇溶蛋白[21]、白藜芦醇-大豆分离蛋白（soybean protein isolated，SPI）[22]以及表没食子儿茶素没食子酸酯-SPI[23]相互作用的研究中均有体现。

图1 Gen（A、B）和Dai（C、D）对BCG荧光猝灭的影响Fig.1 Effects of Gen (A and B) and Dai (C and D) on the fluorescence quenching of BCG

表2 异黄酮与BCG结合的相关常数和热力学参数Table 2 Kinetic constants and thermodynamic parameters of the interaction between isoflavones and BCG

根据Scatchard方程可计算得到BCG与Gen/Dai的结合常数（Ka）和结合位点数（n）（表2）。温度升高，2 种活性异黄酮与BCG之间的Ka均增大，并且不同温度的n都接近1，表明BCG与Gen/Dai在空间结构上至少存在1 个结合位点。

生物大分子与小分子之间存在的非共价作用力主要有氢键、静电相互作用、疏水相互作用和范德华力，由热力学参数（ΔS、ΔH和ΔG）可以推断蛋白质与小分子之间相互作用力的类型。通过Van’t Hoff方程计算可得到相互作用的热力学参数（表2）。按照Ross等[24]总结的热力学参数与相互作用力之间的规律，表2中ΔH、ΔS均为正值，表明BCG与Gen、Dai的相互作用力中疏水相互作用起主要作用。这可能是因为Gen/Dai含有碳碳双键和苯环等疏水基团，这些基团与BCG中的疏水基团或结构域发生疏水相互作用。类似地，疏水相互作用也是姜黄素与SPI[25]、VB12与大豆7S/11S蛋白[26]结合的主要驱动力。

2.1.2 同步荧光光谱

同步荧光光谱通过同步扫描λex和λem可以提供生色团分子附近微环境的信息。当波长间隔Δλ为15、60 nm时，同步荧光分别体现出酪氨酸（Tyr）或色氨酸（Trp）残基微环境的变化[27]。由图2可知，蛋白荧光强度随着Gen/Dai的加入逐渐降低，当Δλ为15 nm时，可以观察到Gen仅对BCG中Tyr残基的最大吸收波长向长波方向移动了1 nm，而添加Dai后，最大吸收波长并未出现明显移动；当Δλ为60 nm时，Gen使BCG中Trp特征峰红移14.6 nm，而Dai使其红移4 nm。某些关键氨基酸决定了蛋白质的结构和功能，这些氨基酸微环境的改变会导致蛋白质整体结构发生相应变化[28]，同步荧光光谱的结果表明，蛋白中酪氨酸和色氨酸周围环境的极性增加，BCG与2 种异黄酮发生络合作用，从而使蛋白结构更加松散，使其内部更多的亲水性氨基酸暴露[29]。由于2 种异黄酮结构存在差异，Gen比Dai多1 个酚羟基，且多出的酚羟基在空间位置上更接近羰基，导致Gen的活性更强，因此对BCG氨基酸残基微环境的影响比Dai更明显[30]。

图2 Gen（A、B）和Dai（C、D）对BCG同步荧光光谱的影响Fig.2 Effects of Gen (A and B) and Dai (C and D) on the synchronous fluorescence spectrum of BCG

2.1.3 三维荧光光谱

为进一步了解Gen/Dai对BCG构象的影响，运用三维荧光光谱进行分析，由图3和表3可知，在λex＝295 nm和λex＝282 nm处，BCG的三维荧光光谱显示出2 个峰。根据峰位置分析，峰a（λex＝295 nm）和峰b（λex＝282 nm）是BCG中Tyr或Trp残基的2 个特征峰[31]。随着2 种活性异黄酮的添加，峰a和峰b的峰高都明显降低。相较于Dai，Gen对峰a的影响更为显著，当BCG∶Gen＝1∶10时，峰a完全消失。逐渐添加Gen后，峰b的λem发生红移；而Dai加入后，峰b从原来的282 nm/323 nm红移至284 nm/325 nm和287 nm/325 nm，同时中高剂量异黄酮诱导蛋白产生了一个新的峰c（377 nm/380 nm）。以上信息表明，异黄酮的加入促使BCG的特征峰产生红移，诱导蛋白质结构发生轻微的去折叠或适应性重排[32]，引起氨基酸微环境的极性增加，导致蛋白构象发生变化[33]。

图3 异黄酮对BCG三维荧光光谱的影响Fig.3 Effects of isoflavones on the three-dimensional fluorescence spectrum of BCG

表3 BCG与活性异黄酮相互作用后三维荧光光谱峰位置和峰强度Table 3 Three-dimensional fluorescence peak positions and intensities of BCG-isoflavone complexes

2.1.4 外源性荧光光谱

同步荧光与三维荧光光谱展示了蛋白氨基酸微环境的变化，外源性荧光光谱主要是从整体上体现蛋白质表面疏水性的强弱。蛋白质表面疏水性是支撑蛋白质空间结构稳定必不可少的部分，对蛋白质的结构和功能性质有极其重要的影响[34]。ANS是一种疏水性荧光探针，在水溶液中其荧光强度很微弱，但与蛋白质的疏水区域结合时，其荧光强度显著增强。因此可采用ANS荧光探针作为标记物，检测2 种活性异黄酮添加量变化对BCG表面疏水性的影响。由图4可知，当BCG与Gen物质的量比为1∶1时，BCG表面疏水性明显增加；而随着Gen浓度增大，BCG表面疏水性又减小，即中、高剂量（10、20 倍）的Gen使BCG的表面疏水性明显降低。添加Dai对BCG表面疏水性的影响与剂量之间的规律不明显，BCG与Dai物质的量比为1∶1和1∶20时，BCG的疏水性显著增加，而BCG与Dai物质的量比为1∶10时，BCG表面疏水性显著减小。

图4 异黄酮对BCG表面疏水性的影响Fig.4 Effects of isoflavones on the surface hydrophobicity of BCG

2.1.5 圆二色光谱

α-螺旋结构的圆二色光谱在190 nm附近有一正峰，在222、208 nm波长处有2 个负峰；β-折叠结构在216 nm波长处有一负峰，在185～200 nm波长处有一正峰[35]。由图5可知，当BCG∶Gen＝1∶1时，在蛋白二级结构中，α-螺旋相对含量略有升高，但当Gen浓度继续增加后，α-螺旋和β-转角相对含量明显下降；而β-折叠相对含量随着Gen的添加显著增加。同时Dai的添加使蛋白中β-折叠相对含量显著减少，而β-转角相对含量显著提高。随Dai浓度的升高，蛋白的无规卷曲相对含量则表现出先降低后升高的变化。综上所述，Gen的添加使得BCG的二级结构组成呈现出从α-螺旋、β-转角转化为β-折叠的趋势；Dai的添加使BCG的结构呈现从β-折叠转化为β-转角的趋势，这在矢车菊素-3-O-葡萄糖苷与7S/11S蛋白相互作用研究中也有所体现[36]，使蛋白质结构更为松散。二级结构的变化与前文荧光光谱的研究结果结合，可以看出异黄酮的添加使BCG的结构更为疏松，内部紧凑的基团暴露在外部环境中。

图5 异黄酮对BCG二级结构的影响Fig.5 Effects of isoflavones on the secondary structure of BCG

2.2 异黄酮-BCG复合物结构及潜在致敏性

2.2.1 复合物的结构

由图6A、B可知，相较于原蛋白，2 种活性异黄酮与蛋白形成复合物的二级结构中α-螺旋相对含量略有升高，占主要地位的β-折叠相对含量均降低。由于结合方式与异黄酮种类不同，2 种复合物结构变化仍有差别，BCG-Gen复合物主要表现为β-转角相对含量显著升高，而BCG-Dai复合物表现为无规卷曲相对含量显著升高。

图6 异黄酮-BCG复合物的结构表征Fig.6 Structure of isoflavone-BCG complexes

蛋白质在280 nm处的吸收峰主要由芳香族氨基酸（如Tyr和Trp）的π-π*跃迁引起[33]，可以提供有关蛋白质三级结构的信息。由图6C可知，与原蛋白相比，BCG-Gen-A和BCG-Dai-N在280 nm处的吸收峰强度增强，而BCG-Gen-N和BCG-Dai-A吸收峰强度减弱。这表明BCG-Gen-A和BCG-Dai-N的蛋白展开程度变大，使得Tyr和Trp残基暴露在蛋白质表面，导致紫外吸收峰强度增加[28]；而BCG-Gen-N和BCG-Dai-A暴露在表面的芳香族氨基酸残基数量有所减少，可能是因为复合物的二级结构组成发生了较大的变化，导致芳香族氨基酸的分布出现差异。

由图6D可知，相较于原蛋白，BCG-Gen-A、BCGDai-A与BCG-Dai-N的表面疏水性增强，疏水基团暴露；而BCG-Gen-N的表面疏水性明显减小。

2.2.2 复合物的潜在致敏性

为探究复合物潜在致敏性，采用竞争ELISA评估BCG及其复合物的特异性IgE结合能力，以IC50表示，IC50越大，样品与IgE的结合能力越弱。由图7A可知，复合物的IC50均显著变小（P＜0.05），其中碱性复合物的IC50变化尤为显著，即BCG与2 种异黄酮复合物的致敏性增强，特别是碱性复合物。

图7 异黄酮-BCG复合物的潜在致敏性Fig.7 Potential allergenicity of isoflavone-BCG complexes

通过免疫印迹法鉴定BCG及其复合物消化产物的潜在致敏性。由图7B～E可知，蛋白及复合物消化后存在已被降解的小分子，以及未被消化的蛋白β亚基和大分子聚合物。免疫印迹结果显示，蛋白中β亚基及大分子聚合物显色明显，而消化后小分子不显色。婴幼儿消化产物中BCG-Dai-N与成人消化产物中BCG-Gen-A的免疫印迹条带显色明显强于原蛋白及其他复合物，具有一定的潜在致敏性。消化产物的电泳与免疫印迹结果与前文ELISA结果相互印证，复合物致敏性的升高也可能是由于蛋白质与异黄酮结合后产生了致敏性强的大分子聚合物，导致表现出较强的IgE结合能力。

与2 种异黄酮结合后，BCG的潜在致敏性增强，类似的研究结果在操强等[37]研究中也有报道：卵白蛋白-白藜芦醇相互作用后卵白蛋白的体外IgE结合能力变强。结合前文复合物结构的表征结果推测，复合物致敏性增强可能是因为异黄酮与BCG相互作用后，蛋白结构变得更为松散，抗原表位更多地暴露在复合物表面。并且相较于体外实验，人体内的过敏机制更为复杂，已有较多研究证明了异黄酮的抗过敏能力。体外血清学实验仅表明与2 种活性异黄酮相互作用后蛋白的IgE结合能力有所增强，但黄酮类化合物在体内可能通过影响免疫细胞、调节免疫因子等途径达到缓解过敏的作用，后续将通过细胞实验及动物实验进一步探究异黄酮对于大豆过敏蛋白致敏性的影响机制。

3 结论

本研究采用多种光谱方法对大豆中Gen/Dai与BCG的相互作用及复合物的结构进行研究，发现2 种活性异黄酮通过静态猝灭方式猝灭BCG的内源性荧光，n均接近1，作用力以疏水相互作用为主；而2 种异黄酮与BCG相互作用后会导致蛋白的结构与氨基酸残基微环境发生改变，使蛋白结构更为松散。体外血清学实验结果说明，复合物与消化产物的致敏性均强于原蛋白，这可能是由于相互作用后蛋白质结构展开，使更多的过敏原表位暴露。