m6A甲基化修饰对大肠癌转移的影响以及中医药干预机制研究

梁 霜, 张 蕾, 宋 卿

(南京中医药大学附属苏州市中医医院, 江苏 苏州 215000)

大肠癌(Colorectal cancer,CRC)是最常见的消化道恶性肿瘤之一,在全球癌症发病率中排名第三,病死率占第二位。仅2018年就有超过88.1万例新发死亡,是癌症相关死亡的第二大原因[1]。在世界范围内,超过一半以上CRC患者死于肿瘤远处转移,转移性CRC仍然是一种难以治愈的肿瘤。患者术后5年生存率最高能达到90%,但在晚期转移的情况下,这一比例降低到8%[2]。目前,我国的CRC患者逐步呈现年轻化的趋势,肥胖和超重、高热量饮食、过度饮酒、久坐不动的生活方式等环境风险因素,通过触发机体代谢编辑、肿瘤微环境、免疫受损等,影响肠上皮细胞表观遗传修饰及转录组学之间的动态平衡,诱导大肠癌复发、远处转移。

N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)甲基化是真核生物信使RNA和非编码RNA最普遍的表观遗传修饰[3],广泛参与RNA的加工、剪接、核转运、翻译和降解。越来越多的证据表明,异常表达的m6A修饰对大肠癌的发生、进展至关重要,可能为转移性CRC诊疗和预后提供潜力靶点。此外,中医药可以作为有效的治疗方法来破坏癌细胞的生存环境,诱导细胞凋亡,增强机体免疫力,联合应用减少耐药性和不良反应,从而达到抗癌和改善生存状况的效果[4]。本文综述了m6A甲基化修饰与CRC转移之间的调控关系,并重点阐述m6A调控因子及中医药干预靶向治疗的分子机制,以提高其对干预CRC的分子靶点和信号通路的认识。

1 m6A甲基化修饰蛋白组成及生物学功能

m6A是指RNA分子在腺苷N6位置发生甲基化修饰,约占所有RNA修饰的60%以上,该表观调控过程是可遗传和动态可逆的,异常的调控因子可诱导肿瘤细胞发生侵袭和迁移。m6A修饰由甲基转移酶(Writer)、去甲基化酶(Eraser)和甲基化识别蛋白(Reader)执行不同功能并协同完成[3]。甲基转移酶3(METTL3)、甲基转移酶14(METTL14)、Wilms肿瘤 1相关蛋白(WTAP)形成复合体,是锚定在细胞核上催化m6A甲基转移酶的关键成员。其余组成成分包括甲基转移酶16(METTL16)、类病毒m6A甲基转移酶相关蛋白VIRMA(KIAA1429)、锌指CCCH域蛋白13(ZC3H13)和RNA 结合基序蛋白15(RBM15)等多种蛋白亚基,负责启动m6A甲基化修饰。

去甲基化酶的核心蛋白由脂肪和肥胖相关蛋白(FTO)和烷基B同源物5(ALKBH5)组成,去甲基化酶与甲基转移酶共同调节目标基因,这是甲基化修饰过程动态可逆的根本原因。m6A甲基化识别蛋白包括YTH结构域的蛋白(YTHDF1-3和YTHDC1-2)、不均一核糖核蛋白A2/B1(HNRNPA2B1)、不均一核糖核蛋白C(HNRNPC)和胰岛素样生长因子2 mRNA 结合蛋白1-3(IGF2BP1-3),特异性识别RNA甲基化,随后执行mRNA 的剪接、翻译、转运、降解等生物学功能。

2 不同来源的甲基化调控基因对大肠癌转移的影响

2.1m6A甲基转移酶

2.1.1METTL3:METTL3的表达在肿瘤细胞增殖和转移过程中发挥双重作用。Peng等[5]发现METTL3介导pri-miR-1246甲基化,高水平的miRNA-1246,负向调控抑癌基因SPRED2逆转其对MAPK信号通路的抑制,从而促进上皮-间质转换(EMT)及体内外CRC细胞侵袭和转移能力。METTL3亦作为抑癌基因参与肠道肿瘤的多种生物学过程。Deng等[6]研究表明,METTL3活化p38/ERK信号通路,抑制CRC细胞的增殖和迁移。METTL3敲除组中的p-P38和p-ERK被激活,从而诱导CRC细胞的迁移和侵袭。此外,Chen等关于微生物与宿主相互作用影响CRC进展的研究,证实具核梭杆菌抑制Hippo通路并激活YAP信号,降低FOXD3的表达,抑制了METTL3转录[7]。低表达的METTL3通过调控KIF26B的m6A修饰和mRNA降解,上调KIF26B表达,随后诱导CRC细胞的侵袭性转移。综上可知,METTL3在CRC中上调或下调,影响大肠癌的基因表达,并通过靶向不同类型RNA及信号通路发挥着致癌/抗癌的功能。

2.1.2METTL14:METTL14多作为抑癌基因调控CRC,而敲减METTL14可增强CRC细胞增殖和转移能力。据报道METTL14启动子中KDM5C介导组蛋白H3K4me3去甲基化,抑制METTL14转录表达,随之通过依赖于YTHDF2的途径提高了SOX4 mRNA表达,激活EMT过程和PI3K/Akt信号促进CRC恶性转移[8]。另有研究发现,转移相关基因MeCP2与METTL14结合,通过改变m6A修饰上调肿瘤抑制因子KLF4的表达[9]。在此过程中,IGF2BP2特异性识别KLF4 mRNA的m6A位点,使其稳定性及蛋白水平增加,进而调控CRC细胞的转移。因此,使METTL14高表达可能会成为治疗CRC的一种新的替代疗法。

2.1.3其他甲基转移酶:WTAP在低分化CRC中表达明显上调,WTAP表达升高与预后不良密切相关。Liang等[10]研究表明,与正常组织相比,β-arrestin2 (ARRB2)在经AOM/DSS处理后的小鼠CRC组织中的表达显著上调。机制上,ARRB2与WTAP相互作用诱导WTAP降解,敲低ARRB2可降低WTAP介导的Wnt癌症通路活性,从而抑制CRC细胞增殖和迁移。另外,KIAA1429的缺失能够显著抑制CRC生长,但其影响CRC的潜在机制仍然难以捉摸。Li等[11]指出KIAA1429靶向HK2,提高CRC有氧糖酵解,参与肿瘤的能量代谢,并调控CRC发生与转移。进一步的机制分析表明,KIAA1429通过不依赖于m6A的方式与HK2 mRNA的m6 A位点结合,增加其mRNA稳定性,使过表达HK2促进CRC细胞增殖及转移,这说明KIAA1429本身就可调节CRC癌变。

2.2m6A去甲基化酶:FTO双向调节CRC细胞侵袭和转移功能。Ruan等[12]发现,FTO对肿瘤转移相关蛋白1 (MTA1)的m6A 去甲基化修饰依靠于IGF2BP2增强其mRNA稳定性,发挥抑癌作用。同时,缺氧诱导泛素化位点K216,下调FTO蛋白表达,这揭示了肿瘤微环境促进CRC转移的一种新的表观遗传机制。另有报道,FTO的缺失显著下调HCT-116结肠癌细胞中PD-L1的mRNA和蛋白水平,从而增强PD-L1介导的T细胞激活和浸润,研究提示肿瘤细胞利用FTO逃避免疫监视,亦促进CRC细胞转移,可作为CRC免疫检查点阻断治疗的新治疗靶点[13]。

ALKBH5在肠癌组织中的mRNA和蛋白表达衰减,与远处转移相关。Wu等[14]研究认为ALKBH5在CRC中的抑癌效应,首先通过消减FOXO3的m6A修饰,增强FOXO3 mRNA稳定性,其次靶向上调miR-21/SPRY2的表达,降低了VEGF、p-ERK和HIF-1 α表达量,最终延滞CRC远处转移。

2.3m6A识别蛋白

2.3.1YTHDF1-3和YTHDC1-2:YTH结构域家族是代表性的m6A识别蛋白。YTHDC1通过与癌基因LINC00857相互作用,提高SLC7A5 mRNA稳定性,加快EMT过程,促进CRC细胞的迁移进展[15]。Li等研究阐明[16],miR-6125靶向YTHDF2的3'-UTR并下调YTHDF2蛋白,从而维持GSK3β mRNA m6A的稳定性,抑制Wnt/β-catenin/Cyclin D1途径相关蛋白的表达,导致CRC细胞停滞于G0-G1期,最终阻碍CRC细胞增殖。高水平表达的YTH蛋白通过调节与恶性潜能相关的细胞内在基因,促进肿瘤的浸润、肿瘤分期和转移。

2.3.2IGF2BP1-3:IGF2BP3表达量上调有效诱导肿瘤细胞EMT侵袭表型。Li等[17]研究发现,敲低IGF2BP3或ELAVL1明显阻滞CRC细胞增殖与迁移,而IGF2BP3与ELAVL1结合,其复合物识别CRC的mRNA转录本,增强致癌稳定性,并延长分子的半衰期、上调靶基因的表达,随后驱动CRC细胞转移进展。据报道,IGF2BP2介导UCA1 mRNA的m6A修饰,并识别UCA1 1038位点腺苷使其稳定性增强,以及METTL3联合WTAP正向调控UCA1表达,明显发挥促CRC转移的作用[18]。

2.3.3其他识别蛋白:HNRNP能够特异性识别并介导mRNA在核内加工,可能是m6A修饰调节大肠癌病理过程的重要途径。检测RASSF8-AS1在CRC转移细胞及组织中明显下调,分析其机制表明,RASSF8-AS1可捕捉miR-33a-5p上调RASSF8表达,或募集HNRNPC维持RASSF8 mRNA的稳定性,抑制CRC细胞侵袭、迁移及体外移植瘤生长。由此推测存在一种HNRNPC影响miRNA 介导大肠癌侵袭和转移的新靶点机制,并提示miR-33a-5p/HNRNPC/RASSF8轴有效干预CRC转移的潜力。eIF蛋白与多种circRNA相互作用,已被证实其通过调控EMT和血管生成介导CRC转移进展。

3 中医药通过m6A甲基化修饰调控大肠癌转移

近年来,随着人类CRC发病率不断上升,中医药抗CRC临床应用的效果和优势日益凸显,除手术、放化疗、靶向治疗外,中医药也被认为是一种有前景的辅助治疗手段。中医药有效抑制了CRC的恶性行为,在“整体观”和“带瘤生存”应用理念引导下,显著提高患者的生活质量并延长总生存期。诸多研究表明,m6A修饰在影响CRC进展和患者预后方面发挥着关键作用,中医药靶向其调节因子可能是治疗转移性CRC的潜在新策略。从中医药库筛选靶向m6A修饰的抗癌治疗剂具有得天独厚的优势,首先抗癌药物的安全性和有效性历经数千年实践已得到证实,其次是现代药理实验发现中药分子具有多种生物活性的药效团和化学结构。因此,本节将重点介绍靶向m6A调控因子的中医药衍生物及其与转移性CRC相互作用的新发现。

小檗碱是从黄连中提取的异喹啉生物碱,靶向参与肠道肿瘤各环节,具有较高的抗肿瘤活性和安全性。Zhao等研究发现小檗碱降低cyclin D1,增加p27和p21表达,导致细胞周期停滞在G1/G0期,抑制细胞增殖和转移[19]。另一方面,通过上调β-catenin负向调控FTO的表达水平,从而增加MYC mRNAm6A修饰并招募YTHDF1,促进肿瘤细胞糖酵解和转移。总体而言,小檗碱多影响大肠癌细胞增殖、凋亡及转移过程,而其在诱导自噬、抗炎、调节肠道菌群等仍有广泛探索空间。

白藜芦醇是从虎杖、决明、桑葚等药用植物中提取的天然多酚化合物,具备多靶点有效抗转移性CRC。白藜芦醇与姜黄素联用可降低m6A RNA甲基化,并上调回肠YTHDF2表达水平,有效改善肠黏膜完整性和功能[20]。Qian等研究证实白藜芦醇通过调控转录因子ZEB1的m6A修饰,招募CTBP和BRG1以抑制CDH1转录,使ZEB1表达下调以逆转EMT过程和CRC转移[21]。抗肿瘤单体衍生物介导失调的m6A,所产生的有益作用亦发生于其他癌症。比如,黄芩苷在高糖环境下显著削弱METTL3 介导HKDC1的表观遗传修饰,靶向于RNAm6A(2854)位点,并调控下游p-JAK2/STAT1/ cleaved Capase3途径抑制肝癌转移。然而,目前关于中药复方通过调控m6A修饰,影响转移性CRC相关机制的研究报道尚少。

4 总结与展望

当前,m6A表观遗传修饰调控CRC转移的研究才刚刚起步,但快速发展的高通量测序、生物信息技术为靶向性干预CRC提供了更多可能性,m6A甲基化修饰的生物学特性与功能、蛋白组成体系及其调控CRC转移的机制均得到一定程度揭示。关于m6A甲基化修饰在大肠癌中临床应用潜力的研究逐渐深入,仍在亟待解决的难题:首先,部分m6A调节因子在CRC组织中发挥启动子或抑制子双重作用,具体机制仍存在争议,如何针对不同的生理病理过程和大肠癌所处不同阶段来挖掘最佳靶点值得进一步探讨。其次,m6A调节因子引起其下游哪些靶点及信号通路变化,并且这一过程是否有其他m6A相关分子参与尚不明确,错综复杂的调控网络仍需深入研究。同时,需扩大临床样本以明确m6A修饰在免疫、代谢等途径中对大肠癌发生、侵润及预后的影响。目前,针对中医药干预CRC方面的报道主要是通过调控DNA甲基化、非编码RNA和组蛋白修饰,另一方面,研究内容多集中在小檗碱、白藜芦醇等单体活性成分,缺乏复方介导RNA修饰调控大肠癌细胞转移的临床疗效及靶向研究。尽管中医药是m6A调节剂药物发现的宝贵资源,但关于中医药单体及复方介导m6A调控CRC的机制研究却非常有限,中医药治疗转移性CRC的药代动力学和靶向机制也缺乏足够的临床前数据和试验。

综上所述,本文明确了有价值的分子诊疗靶点,但仍需要进行大量可靠的临床实验,深入挖掘中医药单体及复方干预转移性CRC的作用机制,积极研发具有靶向特异性的m6A相关蛋白抑制剂和激活剂。全面探索m6A调控因子在大肠癌转移方面双向调节的影响因素和具体机制,如何提高对中医药衍生化合物抗肿瘤活性的认知,将会是改善天然靶向药物研发的突破方向。本文旨在从m6A 修饰角度探索中医药介导转移性CRC的调控机制及其作为患者个性化治疗靶点的潜能,以期为调控大肠癌转移的靶向疗法提供参考。