温度、时间对不同方法检测地下水中总大肠菌群的影响

摘 要：分别以温度和时间为变量，比较了滤膜法、酶底物法检测地下水中总大肠菌群的数量。研究表明，2种方法的检测结果随温度变化趋势基本一致，在35、36、37 ℃时，大肠菌群生长最快，3个温度下的检测结果基本无差异（P < 0.05），而与28、32、40℃下的检测结果相比差异明显。滤膜法和酶底物法的培养时间在22、24、28 h时总大肠菌群基本无差异（P < 0.05），而16、18、20、32 h的总大肠菌群数差异明显。因此为保证实验数据真实准确，2种检测方法都应严格控制培养温度和时间。培养温度为36±1 ℃，培养时间为22～28 h。

关键词：培养温度；培养时间；总大肠菌群数；滤膜法；酶底物法；影响因素

Temperature and time effects on different methods to detect total coliform bacteria in groundwater

WANG Puyu1，2

（1.Beijing Institute of Geo-Environment Monitoring， Beijing 100195， China；

2.Urban Groundwater Safety Prevention and Control Technology Innovation Base， Beijing 100195， China）

Abstract： This paper compared the number of total coliform bacteria detected by membrane filtration method and enzyme substrate method， using temperature and time as variables， respectively. The study shows that the detection results of the two methods basically agreed with the temperature change trend. At 35 ℃， 36 ℃ and 37 ℃， the coliform bacteria grew the fastest and showed almost no difference for the three temperatures （P<0.05）， but varied significantly at 28 ℃， 32 ℃， and 40 ℃. The primary culture time of filter membrane method and enzyme substrate method were basically not different at 22 h， 24 h and 28 h （P< 0.05）， while the total coliform number at 16 h， 18 h， 20 h and 32 h varied significantly. Therefore， in order to ensure the true accuracy of the experimental data， the culture temperature and time should be strictly controlled when using either of the two detection methods. The incubation temperature and time were 36 ± 1 ℃， and from 22 h to 28 h， respectively.

Keywords： incubation temperature; incubation time; total coliform bacteria; membrane filtration method; enzyme substrate method; influencing factors

地下水是城市生活和工农业生产的重要水源，且许多城市地下水的使用量占整个城市供水量的一半以上，城市垃圾粪便对地下水源的污染深受专家重视（朱济成，1981；毕桂超等，2010）。大肠菌群是一类与粪便污染有关的菌群（吕肖楠，2014），主要包括大肠埃希氏菌、产气克雷伯氏菌、柠檬酸杆菌和阴沟肠杆菌等，通常可作为水体粪便污染的指标菌（张杨，2015）。指标菌的数量与水体受粪便污染的程度呈正相关，且这些菌中极可能存在肠道致病菌，对人体健康存在威胁（昝帅君等，2015），地下水中大肠菌群的研究一直以来备受关注（陈露等，2013；刘京梅等，2006）。

在總大肠菌群检测中，培养温度和培养时间是重要的控制因素，温度异常或培养时间有误均会影响检测结果。特别是与有机指标和无机指标相比，微生物的检测周期一般较长。全自动固相萃取-高效液相色谱法检测16种多环芳烃，40 min内实现了全部待测指标的分离检测（纪春苗等，2017）；高效液相色谱法分离检测铁、铜、锌，10 min内便实现了Fe3+，Cu2+，Zn2+的同时分离测定（吴宪龙等，2000）；微生物的检测周期相对要长（≥22 h），检测中若某个步骤出现偏差，时间、精力均会增加，严重影响检测效率。因此，结果异常的快速定位分析以及清楚了解符合检测的温度区间、培养时间区间尤为重要。环境因素、测样要求不同，检测方法亦不同。GB/T5750.12-2006生活饮用水卫生指标规定了3种检测方法：滤膜法、多管发酵法、酶底物法。多管发酵法适用范围广，可用于各种水样的检测，但操作繁琐，出具结果慢（邹文燕等，2022）；相对多管发酵法，滤膜法操作简便，出具结果快，适用范围较窄，更适用于浊度较低、总大肠菌群较少的水样（农树莘等，1993）；而酶底物法相对前2种方法成本较高，但操作简单、检测周期短（孙杰，2020）、准确度高，且无需无菌环境（田立平等，2019），可满足大量水样检测及应急水样检测工作的需要（赵春霞等，2009；王士花等，2017），已在国际上被广泛认可。综上可知，不同方法检测总大肠菌群在操作及出具结果周期等方面各有不同，而其在检测大肠菌群时随环境如何变化？变化是否一致？逯南南等人（2014）用酶底物法检测研究了不同温度、不同时间、是否为无菌环境等条件下的大肠菌群的变化，而对不同方法检测大肠菌群时检测结果随温度时间的变化、检测结果是否一致未做研究。

因此，本文分别选择滤膜法和酶底物法（因多管发酵法流程复杂，检测周期长，因此本文未选择此方法），研究了总大肠菌群随温度、时间的变化，对比了2种检测方法对大肠菌群随环境变化的影响。此研究结果为滤膜法和酶底物法检测总大肠菌群时控制培养时间、培养温度提供了理论依据，也为研究其他检测方法对大肠菌群随环境变化的影响提供了参考，进而为深入研究不同方法下大肠菌群随温度、时间等其他环境条件变化的原理等提供了研究基础。

1  材料与方法

1.1  实验室设备与试剂

1）滤膜法

奥林巴斯显微镜，型号 CX33；博讯压力灭菌器，型号 BXM-30R；生化培养箱产于上海一恒科学仪器有限公司，型号LRH-150；培养皿采用90 mm玻璃平皿；玻璃试管，直径180 mm。培养基为品红亚硫酸钠培养基、乳糖蛋白胨培养液，为BR（生物试剂），由北京奥博星生物科技有限公司购买。

2）酶底物法

程控定量封口机，型号 lk-2010；定量盘，97孔定量盘；定量瓶，100 mL一次性无菌定量瓶。培养基，Minimal Medium ONPG-MUG（简称MMO MUG）培养基试剂，以上仪器设备及试剂均由西安立科有限公司购买；生化培养箱与滤膜法中的描述一致。

1.2  方法原理

1）滤膜法。水样通过0.45 ?m的滤膜（已经高温煮沸灭菌），细菌即被截留在滤膜上，将带有滤膜的培养基于培养箱中培养24 h后，将可疑菌落进行验证实验——革兰氏染色、乳糖发酵实验，若革兰氏染色出现特征菌，且乳糖发酵实验中有产酸产气现象，表明此特征菌为大肠菌群阳性。计数滤膜上出现的此特征菌群数，即100 mL水样中总大肠菌群数。

2）酶底物法。水样经过选择性培养基（MMO MUG）培养会产生了一类细菌菌群，此类菌群可产生β-半乳糖苷酶（β-D-galactosidase），当β-半乳糖苷酶将MMO MUG培养基中的色原底物分解，便释放出色原体使培养基呈现颜色变化，通过计算定量盘中颜色变化的格数算出水样中总大肠菌群数。

1.3  实验方法及步骤

为了研究培养温度、时间对大肠菌群数的影响是否会因检测方法的不同而变化，本实验以滤膜法和酶底物法为检测方法，对6个北京市采集的地下水样（样品编号分别为D1、D2、D3、D4、D5、D6）分别在28、32、35、36、37、40℃温度下培养24 h后研究总大肠菌群数随温度的变化，在36℃下分别培养16、18、20、22、24、28、32 h研究总大肠菌群数随时间的变化。

每个水样设置2个平行样，以平行样的均值作为检测结果，且每一批水样均设置空白培养基作为空白对照，设置质控样验证检测结果的准确性。具体检测步骤见表1。

1.4  计算方法

1）滤膜法：总大肠菌群数按公式（1）计算滤膜上生长的总大肠菌群数，以每100 mL水样中的总大肠菌群数（CFU·100 mL-1）表示。公式（1）计算所得总大肠菌群数是以滤膜上生长的大肠菌群数计的。

总大肠菌群菌落数 = （数出的大肠菌群菌落数×100）/过滤的水样体积 （1）

2）酶底物法：计数经培养后的定量盘中出现黄色反应的孔数，对照MPN表查出最终的大肠菌群数（MPN·100 mL-1）。

对不同温度和时间做的数据采用SPSS统计17.0软件进行处理，以P<0.05作为差异标准，具有统计学意义。

2  结果与分析

2.1  温度对总大肠菌群的影响

1）滤膜法

实验中温度分别设置为28、32、35、36、37、40℃，培养时间为24 h，检测结果如图1-a所示。由图1-a可知，以滤膜法检测总大肠菌群时，6个水样的检测值随温度变化趋势基本一致，当培养温度为35～37℃时，各温度下总大肠菌群数相近，在此区间温度对其生长基本无影响，当温度远离此区间时，总大肠菌群数逐渐降低，表明低温或者高温均抑制大肠菌群的生长。

2）酶底物法

以酶底物法检测水样分别在温度为28、32、35、36、37、40℃下培养24 h后的检测结果，如图1-b所示。

结果表明，酶底物法与滤膜法检测大肠菌群随时间变化趋势基本一致，不同培养温度下的检测结果存在差异。随着培养温度由35℃减小到28℃，D1-D6水样的总大肠菌群数随之降低，分别由41.9、18.5、8.1、45.4、<1、67.9 MPN·100 mL-1降低到20.8、2.0、1.0、17.1、<1、48.4 MPN·100 mL-1，差異明显。而在35、36、37℃时总大肠菌群数基本无差异，具有统计学意义（P<0.05）；在40℃时，总大肠菌群相对35、36和37℃时的值偏小，36±1℃是大肠菌群的最佳培养温度，实验中为保证结果准确需严格控制培养温度在此范围（辛生等，2015）。

综合考虑，不同检测方法对大肠菌群的最佳生长温度36±1℃无影响。此温度下大肠菌群酶的活性最高，生长代谢最快，然而当培养温度偏离时，会严重影响检测结果，因此检测水样时需严格控制温度。

2.2  时间对总大肠菌群的影响

对于滤膜法，分为初培养阶段和验证阶段，初培养阶段即本文所研究培养时间对大肠菌群影响阶段，验证阶段培养时间为定量（24 h），酶底物法只需培养无需验证。

1）滤膜法

滤膜法检测总大肠菌群时的检测结果如图2-a所示。由图2-a可知，不同初培养时间下大肠菌群总数不同，培养了16、18、20 h后，总大肠菌群数值与培养24 h时的总大肠菌群数（36 CFU·100 mL-1、16 CFU·100 mL-1、9 CFU·100 mL-1、47 CFU·100 mL-1、0、78 CFU·100 mL-1）相比明显较低，可能是接种于培养基中的大肠菌群，未达到其生长周期，菌落未完全生成；在32 h时，菌落数降低，可能是培养时间较久，导致许多菌体衰老死亡，衰老死亡的菌体会使镜检呈破裂状，影响检测结果。在培养了22、24、28 h后，经每2个检测数据之间的对比，总大肠菌群基本无差异（P<0.05），具有统计学意义。

2）酶底物法

相比滤膜法，酶底物法操作无需在无菌环境下，增加了操作的简便性，与滤膜法类似的是，不同培养时间仍是影响检测结果准确性的因素，水样在36℃下分别培养16、18、20、22、24、28、32 h，见图2-b。

由图2-b可看出，酶底物法检测大肠菌群实验结果随培养时间的变化呈现波动趋势，在培养时间分别为16、18、20、32 h时，检测结果与培养24 h的检测结果有明显差异（P>0.05），而在培养时间分别为22、24、28 h时，检测结果无明显差异。培养32 h后检测结果与22、24、28 h时差异明显，可能是因为MMO MUG培养基中的抑制剂随培养时间增加降低了抑制杂菌生长的效果，从而影响了检测结果。因此酶底物法检测总大肠菌群时，培养时间应该控制在22～28 h，黄晓蓉（2018）、吴海鹏（2023）、逯南南等（2014）人的研究也得到此结果。

综合考虑，2种方法下滤膜法的初培养时间或酶底物法的培养时间都应控制在22～28 h内，不足或者超出此范围均影响实验结果。使用滤膜法时不可提早或推迟镜检、验证实验，使用酶底物法时不可提早或推迟计算定量盘中颜色变化格数。

2.3  质量控制

2.3.1  空白对照

检测中，每批样品对应2个空白对照水样，将空白对照水样与接种水样的培养基同时培养，以在36℃、培养24 h条件下的总大肠菌群结果为例，空白对照水样结果如图3所示。图3-a为滤膜法实验的空白对照，结果无大肠菌群生长；图3-b为酶底物法实验的空白对照，表明经培养后定量盘无变色反应，大肠菌群未检出。因此2种检测方法均表明，在一系列操作后培养基及器皿未被污染且操作无误，结果准确。

2.3.2  质控样品结果

为了验证整个检测过程的准确性，本文每批次样品添加1个质控样（由CICC《中国工业微生物菌种保藏管理中心》购买）作为对照，由于2种方法的操作及计数单位不同，为了更直观的反映检测结果的准确性，滤膜法和酶底物法采用2个不同的质控样品，编号分别为：CICC FTQC-75-06和CICC HJQC-003，培养温度为36℃，检测结果如表2所示。

实验结果表明，2种方法下检测结果均可信。滤膜法检测结果为123 CFU·100 mL-1，虽与真值180 CFU·100 mL-1有差异，但在95%置信范围71～460 CFU·100 mL-1内；酶底物法的检测结果虽与真值存在差异但也在95%置信范围内。2种方法均有效评价了随着不同培养温度和培养时间总大肠菌群数的变化，此结果与徐庄艳（2022）研究成果一致。

3  结论及建议

大肠菌群最适生长温度为36±1℃，偏离此温度区间菌株生长变缓，检测结果偏小。使用滤膜法和酶底物法2种方法检测大肠菌群，检测结果随温度变化趋势基本一致，检测方法基本不会影响大肠菌群的最适培养温度；2种检测方法在培养时间为22～28 h时的检测结果基本无差异，不足和超出此培养时间均会影响实验结果。滤膜法、酶底物法检测水中总大肠菌群时温度和培养时间均为重要影响因素。

使用不同检测方法对大肠菌群最适培养温度和培养时间无影响，而2种方法在检测时各有优缺点。滤膜法相对酶底物法虽检测成本较低，但操作复杂，需进行验证试验，检测周期长，检测效率较低，且微生物检测对样品时效性要求较高（采样后2 h完成检测），为满足地下水环境监测的需要，酶底物法更适用当前环境下的水样检测。

随着经济发展，被污染区域的风险可能会加大，地下水中大肠菌群数量、种类也会发生变化，为了更高效的检测与分析，水质总大肠菌群检测新方法的研究势在必行。且对地表水甚至污水等大肠菌群浓度较高、种类较多的水样的分析，将是我们下一步研究的内容。

参考文献

毕桂超，孙红继，2010. 锦州地区地下水饮用水源污染因素及防治对策研究［J］. 中国环境管理干部学院学报，20 （3）：65-68.

陈露，邓敏，2013. 水质检测中大肠菌群的研究［J］. 科技资讯21：129.

黄晓蓉，2018. 酶底物法检测水中总大肠菌群大肠埃希氏菌的影响因素［J］. 医药前沿，8（12）： 221-223.

纪春苗，余群，2017. 全自动固相萃取-高效液相色譜法测定水源水中的16种多环芳烃［J］. 分析仪器（6）：70-75.

刘京梅，张凌，赵君，梁伟，2006. 饮用水中大肠菌群检测技术的研究进展［J］. 国外医学（卫生学分册）（2）：117-121.

逯南南，宋武昌，褚福敏，周维芳，孙绍华，贾瑞宝，2014. 酶底物法检测水中总大肠菌群/大肠埃希氏菌的影响因素［J］. 中国给水排水，30（24）：147-150.

吕肖楠，2014. 大肠菌群快速检测方法的研究［D］. 哈尔滨：东北农业大学.

农树莘，梁恒进，覃倩萍，1993. 多管发酵法与滤膜法监测水中总大肠菌群的比较［J］. 中国公共卫生3：135.

孙杰，2020. 3种总大肠菌群和大肠埃希氏菌酶底物法检测试剂性能比较［J］. 净水技术，39（10）：13-19.

田立平，邢峰杰，王晓波，2019. 酶底物法检测水中总大肠菌群［J］. 供水技术，13（3）：56-58.

王士花， 彭国芳，安世慧，2017. 酶底物法和多管发酵法检测水中总大肠菌群的比较分析［J］. 大家健康（上旬版），11（10）：60.

吴海鹏，2023. 酶底物法检测水中总大肠菌群影响因素的探讨［J］. 广东化工，50（4）：160-162.

吴宪龙，所小沛，2000. 高效液相色谱法分离测定铁铜和锌［J］. 冶金分析（1）：32-35.

辛生，黄鑫， 张立夫，赵薇，杨修军，2015. 检测生活饮用水中总大肠菌群的酶底物法与滤膜法探讨［J］. 中国卫生工程学，14（2）：189.

徐庄艳，2022. 水中总大肠菌群酶底物法、滤膜法与多管发酵法的比较［J］. 净水技术，41（S1）：356-359.

昝帅君，樊景凤，明红霞，郭建丽，王玥，常永凯，郭皓，2015. 辽河口粪便污染指示菌的时空分布特征［J］. 环境科学学报，35（11）：3 587-3 594.

张杨，2015. 饮用水中总大肠菌群的检测方法应用：滤膜法和酶底物法的比较分析［J］. 产业与科技论坛，14（2）：58-59.

赵春霞，张哲海，厉以强，梅卓华，郭晓颍，沈燕飞，2009. 酶底物法与多管发酵法和纸片法监测环境水样大肠菌群的比较［J］. 环境监测管理与技术，21 （2）：63-64.

朱济成，1981. 防止城市垃圾粪便对地下水的污染［J］. 环境保护（5）：10-11.

邹文燕，王小龙，王波，赵敏娴，朱莉勤，2022. 一处水源水多管发酵法和酶底物法测定总大肠菌群的差异分析［J］. 中国卫生检验杂志，32（3）：297-300.

收稿日期：2023-04-21；修回日期：2023-07-12

基金项目：北京市监测网运行项目（2022年）资助

作者简介：王璞玉（1993- ），女，硕士，工程师，主要从事水质检测及分析工作。E-mail：w1335280494@163.com

引用格式：王璞玉，2023.温度、时间对不同方法检测地下水中总大肠菌群的影响［J］.城市地质，18（4）：113-118