八棱海棠种子超低温保存中含水量对糖代谢的影响

彭 颖, 朱梦婷, 乔 谦, 李 杏, 张 玥, 皮晓飞, 刘 燕*

(1. 北京林业大学 园林学院, 花卉种质创新与分子育种北京市重点实验室, 国家花卉工程技术研究中心, 城乡生态环境北京实验室, 林木花卉遗传育种教育部重点实验室, 北京 100083; 2. 国家植物园, 北京 100093 )

八棱海棠(Malus×robusta)隶属于蔷薇科(Rosaceae)苹果属(Malus)(陆秋农和贾定贤, 1999),是重要的种质资源,其适应性和抗逆性均较强,既是优秀的观赏海棠,也是一种优良的苹果砧木(河北省农林科学院昌黎果树研究所, 1986),主要通过播种提供砧木苗,因此,其种子资源保存具有重要意义。超低温保存是种质永久保存最有潜力的技术,具有环保、方便、节约成本等诸多优点,受到广泛关注。目前,仅见八棱海棠在低温(-35～5 ℃)贮藏的报道,瓶装密封在0～5 ℃冰箱冷藏保存效果较好(何建斌等, 2022)。因此研究八棱海棠种子的超低温保存,实现其种质资源的永久保存具有重要的应用价值。

含水量是影响种子生活力的关键因素之一(Chmielarz, 2009; Wen et al., 2009),大量研究表明,超低温保存后,只有在适宜的种子含水量时才能获得较高的萌发率(Generoso et al., 2019; 张晓宁等, 2020),但其作用机制尚不完全清楚,一般认为含水量变化与细胞低温损伤“两因素假说”相关,即慢速冷冻会引起细胞逐渐脱水,发生溶质损伤,快速冷冻会引起细胞发生冰晶损伤(Mazur et al., 1972)。近年来研究也显示,ROS介导的氧化应激可能是含水量变化导致种子超低温保存活力降低的损伤机制之一(曹柏, 2016; 李萍, 2018)。

研究表明,在特定的逆境条件下,糖在压力感知、信号传递和胁迫介导的基因表达中发挥着关键作用,确保渗透调节反应、清除ROS,并通过碳分配维持细胞能量状态(Saddhe et al., 2021)。其中,糖含量与相关酶活性是较为敏感的指标,易受环境因素的影响,并对胁迫做出反应(方诗雯, 2018)。不同含水量种子超低温保存中面临低温和脱水双重胁迫,而含水量是否会通过影响糖代谢进而影响超低温保存后种子的萌发尚未见报道。

本文以八棱海棠种子为材料,通过研究超低温保存的适宜含水量,探究不同含水量种子超低温保存效果差异的生理基础,拟探讨以下问题:(1)含水量是否会影响八棱海棠种子超低温保存后的生活力;(2)含水量影响超低温保存生活力的作用机制。本研究为进一步提高种子超低温保存后的生活力提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

八棱海棠种子购于河北省怀来县绿欣八棱海棠苗木基地,初始含水量为27.12%,沙藏60 d后用于本试验。

1.2 方法

1.2.1 种子不同含水量的调制及测定 用硅胶干燥不同时间,获得不同含水量的种子,即W1(27.12%)、W2(20.32%)、W3(15.10%)、W4(9.02%)和W5(6.40%),含水量随干燥时间的变化具体见图1。

图1 八棱海棠种子含水量随干燥时间的变化Fig. 1 Change of seed water content of Malus × robusta with drying time

种子含水量用烘箱干燥法测定:取30粒种子,称重记为A;将种子放在称量皿中,称重记为B;一起放入105 ℃烘箱中烘干至恒重,待冷却后测定种子和称量皿的总重,记为C。按照公式计算含水量,种子含水量=(B-C)/A×100%。每个处理含30粒种子,设置3个重复,取均值。

1.2.2 种子超低温保存及化冻方法 以100粒种子为一份,用锡纸包装后装入网兜,再投入液氮(liquid nitrogen, LN)分别保存15 d和120 d,试验时快速取出,用40 ℃水浴化冻5 min,备用。

1.2.3 种子萌发测定方法 将沙藏后的种子用清水洗净,均匀播于放有1层滤纸的一次性培养皿中,置于光照培养箱中:夜间温度20 ℃,8 h;白天温度25 ℃,16 h;相对湿度在60%以上。每天定时观察,记载发芽数。以胚根长度大于种子长度的1/2时视为发芽(李扬汉, 1984)。按照下列公式计算生活力。

发芽率(%)=发芽种子数/供试种子数。

发芽势(%)=发芽高峰期萌发的种子数/供试种子数。

发芽指数(GI)=∑Gt/Dt(Gt是时间在t日的发芽数,Dt是对应的发芽天数)。

每个处理30粒种子,重复3次,取均值。

1.2.4 糖代谢相关指标测定方法 可溶性糖和淀粉含量测定采用蒽酮法(刘萍和李明军, 2016);果糖含量测定采用果糖试剂盒(货号GT-2-Y);蔗糖含量测定采用蔗糖试剂盒(货号ZHT-2-Y);葡萄糖含量测定采用葡萄糖试剂盒(货号PT-2-Y);海藻糖含量测定采用海藻糖含量测试盒(货号HT-2-Y);山梨醇含量测定采用山梨醇含量测试盒(货号SC-2-Y);直链淀粉含量测定采用直链淀粉试剂盒(货号ZDF-2-Y);支链淀粉含量测定采用支链淀粉试剂盒(货号ZHDF-2-Y);蔗糖磷酸合成酶活性测定采用蔗糖磷酸合成酶试剂盒(货号SPS-2-Y);蔗糖合成酶(合成方向SS-Ⅱ)活性测定采用蔗糖合成酶(合成方向SS-Ⅱ)试剂盒(货号SSⅡ-2-Y);中性转化酶活性测定采用中性转化酶试剂盒(货号NI-2-Y);酸性转化酶活性测定采用酸性转化酶试剂盒(北京索莱宝科技有限公司,货号BC0560);蔗糖合成酶(分解方向SS-Ⅰ)活性测定采用蔗糖合成酶(分解方向SS-Ⅰ)试剂盒(货号SSⅠ-2-Y);果糖激酶活性测定采用果糖激酶试剂盒(货号FRK-2-Y)。

以上试剂盒未标注来源的均来自苏州科铭生物技术有限公司,各种物质测定操作步骤按照试剂盒说明书进行。每处理重复3次,取均值。

1.3 数据处理与分析

数据用Excel软件进行整理及图表制作,采用SPSS 26.0软件进行单因素ANOVA分析和Origin进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 不同含水量种子超低温保存后生活力变化

种子含水量对超低温保存后种子生活力有明显影响,见表1。超低温保存15 d后,随着含水量降低,生活力呈单峰变化,即呈现先升高再降低的趋势,含水量为9.02%(W4)的种子生活力显著高于其他含水量种子,发芽率为53.33%, 发芽势为33.33%,发芽指数为20.52;自然含水量27.12%(W1)的种子保存后丧失生活力;较高含水量20.32%(W2)的种子发芽率仅为6.67%,显著低于含水量15.10%(W3)的32.22%和6.40%(W5)的33.33%。

表1 八棱海棠种子含水量超低温保存后生活力的变化Table 1 Changes of Malus× robusta seed viability after cryopreservation

超低温保存120 d后,各含水量种子的生活力均下降,保存15 d时生活力最高的W4种子生活力下降最大,发芽率由53.33%降至25.56%,已与W3和W5种子无显著差异。随着含水量的降低,种子生活力一直升高,含水量为6.40%(W5)的种子生活力最高,发芽率为27.78%,发芽势为23.33%,发芽指数为13.27。

2.2 种子含水量在超低温保存15 d后糖含量的变化

液氮保存15 d后,不同含水量八棱海棠种子超低温保存后可溶性糖总量的变化见图2:a。具有最高生活力的W4种子(含水量9.02%),其可溶性糖总量显著低于其他各组,但种子含水量降至6.40%(W5)时,可溶性糖含量升高且与其他高含水量种子没有显著差异。

不同大写字母表示相同处理组不同含水量种子差异显著(P<0.05),下同。Different capital letters indicate significant differences in seeds with different water contents in the same treatment group (P<0.05), the same below.图2 不同含水量八棱海棠种子超低温保存15 d后可溶性糖总糖和葡萄糖含量的变化Fig. 2 Changes of soluble sugar and glucose contents in different water contents of Malus × robusta seeds after 15 days of cryopreservation

进一步测定不同含水量八棱海棠种子超低温保存后葡萄糖含量的变化,结果见图2:b。与可溶糖含量变化趋势不同,自然含水量种子(W1)的葡萄糖含量显著低于其他组,生活力较高的W4种子含量较低,但与其余含水量种子之间差异不显著。

不同含水量八棱海棠种子超低温保存后蔗糖含量的变化不大,结果见图3。仅液氮保存后丧失生活力的自然含水量W1种子蔗糖含量显著低于其他含水量,而其他含水量种子之间差异不显著;从变化趋势看,低含水量的W3～W5种子蔗糖含量要高于较高含水量的W1和W2种子。

图3 不同含水量八棱海棠种子超低温保存15 d后蔗糖、果糖、海藻糖和山梨醇含量的变化Fig. 3 Changes of sucrose, fructose, trehalose and sorbitol contents in different water contents of Malus × robusta seeds after 15 days of cryopreservation

超低温保存后,随着种子含水量降低,其果糖含量升高,高含水量W1和W2种子与较低含水量W3～W5种子差异显著;虽然含水量W4的种子果糖含量最高,但与W3和W5差异不显著。

不同含水量之间的海藻糖和山梨醇含量变化趋势一致,高含水量W1和W2种子的含量显著低于较低含水量,随着含水量降低,均呈升高趋势,W5种子海藻糖和山梨醇含量最高,与W3和W4种子的海藻糖含量差异显著,而山梨醇含量差异不显著。

不同含水量八棱海棠种子超低温保存后淀粉含量的变化见图4。八棱海棠种子中支链淀粉含量明显高于直链淀粉含量,约为其5倍。随着含水量的降低,淀粉含量和直链淀粉含量均呈先升高再降低的趋势。液氮冻后丧失生活力的W1种子的直链淀粉含量显著低于其他含水量,各含水量间的支链淀粉含量未见明显差异。

图4 不同含水量八棱海棠种子超低温保存15 d后淀粉含量的变化Fig. 4 Changes of starch content in different water contents of Malus × robusta seeds after 15 days of cryopreservation

2.3 种子超低温保存后生活力、含水量与糖含量指标的相关性分析

超低温保存15 d后,生活力、含水量与糖含量指标的相关性分析结果见图5。含水量与生活力呈极显著负相关关系,相关系数为0.82,还与蔗糖、果糖、葡萄糖、海藻糖和直链淀粉呈显著负相关。生活力与蔗糖呈显著正相关,相关系数为0.59,与果糖和海藻糖呈极显著正相关,相关系数分别为0.83和0.72,蔗糖与果糖和海藻糖也呈显著正相关。15 d液氮保存表明,种子含水量可以影响蔗糖和果糖代谢,追踪测定液氮保存120 d后不同含水量种子的生活力(表1)、蔗糖和果糖含量变化及相关代谢酶活性关系。

*表示显著相关(P<0.05); **表示极显著相关(P<0.01)。SS. 可溶性糖; Suc. 蔗糖; Glc. 葡萄糖; Fru. 果糖; Tre. 海藻糖; Sbt. 山梨醇; Aum. 淀粉; Ase. 直链淀粉; Ain. 支链淀粉。*indicates significant correlations (P<0.05); **indicates extremely significant correlations (P<0.01). SS. Soluble sugar; Suc. Sucros; Glc. Glucose; Fru. Fructose; Tre. Trehalose; Sbt. Sorbitol; Aum. Amylum; Ase. Amylose; Ain. Amylopectin.图5 八棱海棠种子超低温保存15 d后生活力、含水量与糖含量的相关性Fig. 5 Correlation between viability, water content and sugar content of Malus × robusta seeds after 15 days of cryopreservation

2.4 种子含水量对超低温保存120 d后糖代谢相关指标的影响

2.4.1 八棱海棠不同含水量种子超低温保存120 d后蔗糖和果糖含量变化 各个含水量的种子在液氮保存120 d后的蔗糖含量均显著低于保存15 d后的蔗糖含量,结果见图6。低含水量(W3～W5)种子的蔗糖和果糖含量也高于高含水量(W1～W2)种子,并且保存120 d后生活力最高的W5种子的蔗糖和果糖含量也显著高于其他含水量。

图6 八棱海棠种子不同含水量超低温保存120 d后蔗糖和果糖含量的变化Fig. 6 Changes of sucrose and fructose contents in different water contents of Malus × robusta seeds after 120 days of cryopreservation

2.4.2 超低温保存120 d后蔗糖代谢酶活性变化 八棱海棠不同含水量种子超低温保存120 d后蔗糖合成相关酶的变化见图7:a,蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthetase, SPS)和蔗糖合成酶(合成方向)[sucrose synthetase (synthesis), SS-Ⅱ]活性变化均没有一定规律性。W2种子SPS活性显著高,而W3显著低,高含水量的W1种子与低含水量的W4和W5没有显著差异;高含水量的自然含水量W1种子的SS-Ⅱ活性最高,但与低含水量组W3和W5组无显著差异。

图7 八棱海棠种子不同含水量超低温保存120 d后蔗糖代谢酶活性变化Fig. 7 Changes of sucrose metabolism enzyme activity in different water contents of Malus × robusta seeds after 120 days of cryopreservation

图8 八棱海棠种子不同含水量超低温保存120 d后果糖激酶(FRK)活性变化Fig. 8 Changes of fructokinase (FRK) activityin different water contents of Malus × robusta seeds after 120 days of cryopreservation

八棱海棠不同含水量种子超低温保存120 d后蔗糖分解相关酶的变化见图7:b。3种酶活性均没有随种子含水量变化呈规律性变化。超低温保存120 d后,各含水量种子的蔗糖中性转化酶(neutral invertase, NI)和蔗糖合成酶(分解方向)[sucrose synthetase (decomposition), SS-Ⅰ]活性差异不明显。生活力最高的W5种子的酸性转化酶(acid invertase, AI)显著高于其他含水量种子,生活力随液氮保存时间下降最明显的W4种子AI活性最低,但W1～W4之间没有显著差异。

八棱海棠不同含水量种子超低温保存120 d后,蔗糖分解类酶活性高于蔗糖合成类酶活性,说明在八棱海棠中主要以蔗糖分解为主要代谢方向。

2.4.3 超低温保存120 d后果糖激酶活性变化 不同含水量种子果糖激酶(fructokinase, FRK)活性变化结果见8。液氮保存120 d后,FRK活性变化呈单峰变化,低含水量W3～W5种子的FRK活性显著高于高含水量W1～W2种子,生活力下降最大的W4种子FRK活性值最大。

2.4.4 八棱海棠种子超低温保存120 d后生活力、含水量与糖含量和相关酶指标的相关性分析 超低温保存120 d后,种子含水量、生活力和糖及其酶相关性见图9。相关分析显示与液氮保存15 d相同,含水量与生活力呈极显著负相关,相关系数为0.85,含水量还与蔗糖、果糖含量呈负相关,生活力与蔗糖和果糖含量呈显著正相关,与AI活性和FRK活性也呈显著正相关,说明含水量通过影响蔗糖分解成果糖影响了种子生活力,酸性转化酶在其中发挥了重要作用,同时果糖代谢也影响了种子的生活力。

*表示显著相关(P<0.05); **表示极显著相关(P<0.01)。Suc. 蔗糖; Fru. 果糖; SPS. 蔗糖磷酸合成酶; SS-Ⅱ. 蔗糖合成酶(合成); NI. 中性转化酶; AI. 酸性转化酶; SS-Ⅰ. 蔗糖合成酶(分解); FRK. 果糖激酶。*indicates significant correlations (P<0.05); ** indicates extremely significant correlations (P<0.01). Suc. Sucrose; Fru. Fructose; SPS. Sucrose phosphate synthetase; SS-Ⅱ. Sucrose synthetase (synthesis); NI. Neutral invertase; AI. Acid invertase; SS-Ⅰ. Sucrose synthetase (decomposition); FRK. Fructokinase.图9 八棱海棠种子超低温保存120 d后生活力、含水量与糖含量和相关酶的相关性Fig. 9 Correlation between viability, water content and sugar content and related enzymes of Malus × robusta seeds after 120 days of cryopreservation

3 讨论

八棱海棠种子可以实现超低温保存,并且含水量对超低温保存效果有重要影响。本研究中八棱海棠种子从自然含水量27.12%逐渐降为9.02%时,在液氮保存15 d后,种子发芽率呈逐渐升高趋势,此结果与马尾松(Pinusmassoniana)(张晓宁等, 2020)、多花芍药(Paeoniaemodi)(周好, 2021)和鸡蛋果(Passifloraedulis)(Generoso et al., 2019)等种子一样,含水量需要降到一定的水平(分别为6.1%、8.87%和10%)才能在液氮中保存依然有较高生活力,可能是由于生物组织含水量降低时会形成玻璃态, 而含水量较高的植物进行超低温保存时,通常易在细胞内形成冰晶,破坏细胞结构,从而导致细胞死亡。八棱海棠种子在自然含水量状态下,液氮冻存15 d和120 d后生活力均丧失,本研究还发现随着液氮冻存时间的延长,最适含水量也会随之降低。

近年来研究发现,参与糖代谢过程中的蔗糖、葡萄糖和果糖具有信号分子的功能,在植物遇到逆境的情况下,这些可溶性糖类直接或间接对植物进行调控,对逆境的胁迫做出应激反应(Wind et al., 2010)。尽管有些植物在低温胁迫下糖含量会增加,但不同植物可能会积累不同的糖类物质。例如,耐低温的番茄(Solanumlycopersicum)品种在低温(4 ℃)胁迫时会积累果糖和葡萄糖(齐红岩等, 2012);稻(Oryzasativa)在低温(平均温度4.6 ℃)下积累可溶性总糖、还原性糖和蔗糖(Turhan & Ergin, 2012)。在本研究中,液氮保存15 d后,低含水量(W3～W5)种子的蔗糖和果糖含量均高于高含水量(W1～W2)种子,但此时活力最高的W4种子的可溶性糖和葡萄糖含量相比W3和W5种子较低。蔗糖和果糖与含水量和生活力均相关,推测含水量可能通过影响可溶性糖中的蔗糖和果糖含量而影响生活力,适宜的含水量有利于八棱海棠种子蔗糖和果糖含量的积累,增加抗低温能力,需要进一步验证。

Wang等(2000)研究表明,叶片中蔗糖合成酶和转化酶活性的增强可加快蔗糖的快速循环,有利于蔗糖的积累,以抵抗干旱胁迫的影响。SPS催化蔗糖合成,SS活性与蔗糖的分解与合成有关,但目前不同文献对这两种参与蔗糖代谢的相关酶在胁迫下的变化规律并不完全一致。例如,苗期夜间低温处理会导致番茄叶片的SS和SPS活性受到抑制(Wang &Li, 2011; 刘玉凤等, 2011),小麦(Triticumaestivum)受低温胁迫后,不同器官SS和SPS基因的表达变化不同,分蘖中SS基因表达逐渐降低,叶片中SS基因表达先升高后降低,而SPS在叶片和分蘖中均表现为先升高再降低(Zeng et al., 2011)。蔗糖转化酶则参与蔗糖的分解,在植物体内,果糖可以通过蔗糖合成酶(分解方向)和蔗糖转化酶的作用下分解蔗糖而产生,本研究中发现果糖含量与蔗糖含量呈显著正相关,同时蔗糖和果糖与AI活性也具有显著相关性,说明八棱海棠种子超低温保存过程中蔗糖主要通过AI降解成分子量更小的果糖,供机体吸收,提高渗透调节能力以响应水分和低温胁迫。这与孙汉青(2018)的研究结果一致,即干旱条件可以提高苹果(Maluspumila)果实中AI活性,导致果实中蔗糖含量下降,果糖、葡萄糖含量上升,缓解了干旱对植物的影响,但本研究中SPS和SS两种酶的活性与含水量以及生活力之间的相关性不显著,仅SPS与蔗糖相关,可能是糖含量与糖代谢酶活性之间有较为复杂的关系,错综复杂地调控着糖代谢,有待更多的研究数据解开诸多困惑。

果糖磷酸化是果糖进入代谢途径的第一道生化反应,其中起作用的高效酶是FRK,在调节细胞中的果糖浓度及响应环境胁迫中发挥着关键的作用(叶香媛和周文彬, 2021),在盐胁迫和干旱胁迫下,FRK基因分别在玉蜀黍(Zeamays)(Zörb et al., 2010)和向日葵(Helianthusannuus)幼苗叶片(Fulda et al., 2011)中表达量上调,此外,FRK可能还在缺氧条件下对水稻幼苗碳水化合物代谢发挥重要作用(Guglielminetti et al., 2006),本研究也表明果糖激酶与超低温保存后生活力显著正相关,暗示果糖激酶在低温胁迫中发挥了一定作用。

海藻糖是一种双糖,可作为逆境胁迫下的信号和保护性物质(Suprasanna et al., 2016),保持膜的完整性,清除活性氧(Zulfiqar et al., 2019)。孙汉青(2018)研究发现海藻糖参与了苹果果实中糖代谢的调节,维持了干旱条件下植物正常生长发育,缓解干旱对植物的影响,外源添加海藻糖还可以缓解胁迫对植物的影响。本研究发现,低含水量种子的海藻糖含量要高于高含水量种子,并且海藻糖与含水量和生活力均呈显著相关,说明海藻糖是八棱海棠种子应对水分和低温胁迫重要的调节物质之一,其具体影响方式还有待进一步研究。山梨醇是木本蔷薇科植物中主要的光合产物、同化物运输形式和可溶性的贮藏性碳水化合物主要的兼容溶质与抗氧化剂,作为小分子细胞相容物质,可以抵御生物和非生物胁迫(Noiraud et al., 2001)。在短期干旱胁迫下,山梨醇含量随干旱程度的加大而明显增加,其合成关键酶活性和基因表达也显著增加(张钊, 2016),本研究中也发现随含水量的降低,八棱海棠种子山梨醇含量有所上升。

Bensari等(1990)曾提出水分胁迫下淀粉含量的变化是植物抵御胁迫的内在因素的假说,一般认为淀粉降解、可溶性糖含量升高有利于抵抗外界环境胁迫。4 ℃低温下,甘薯(Dioscoreaesculenta)中淀粉合成关键基因表达显著降低,而水解酶编码基因表达量显著升高(崔鹏等, 2022);而林敏卓(2012)研究表明,低温胁迫时南极冰藻(Chlamydomonassp.)淀粉合成酶的基因表达明显上调。本研究中随着含水量降低,淀粉总量有先上升再下降的趋势,但淀粉含量与可溶性糖含量的变化相关程度不高并且不与含水量和生活力显著相关。可能是因为可溶性糖和淀粉含量的变化是一个动态过程,未在此阶段显示出明显的对应关系。

由于材料来源所限,本研究获得的八棱海棠种子是已经过沙藏60 d的种子。从超低温保存技术原理分析,采用未经过沙藏的处于深休眠期的种子液氮保存后生活力应该更高,后续可以进一步试验确定适宜采收期和超低温保存的适宜含水量,深休眠种子液氮贮存后对休眠解除的影响等问题也值得进一步研究。

4 结论

八棱海棠种子含水量对超低温保存后生活力有明显影响,但也受液氮保存时间影响,随着液氮保存时间的延长,最适含水量降低。种子含水量通过影响酸性转化酶活性,将蔗糖降解为分子量更小的果糖,以响应脱水和低温胁迫,从而影响种子生活力;种子生活力还受到通过果糖激酶的果糖代谢影响。此外,海藻糖也是八棱海棠种子应对脱水和低温胁迫重要的调节物质之一。