基因编辑工具CRISPR-Cas9与CRISPR-Cas12a的比较与应用

王炀坤,纪世新,苏莹莹,孙英旗,宋相伟

(长春师范大学生命科学学院,吉林 长春 130032)

CRISPR-Cas系统是一种原核生物适应性免疫机制,用于清除外源的核酸,从而在原核生物中获得抵抗病毒的能力[1]。CRISPR-Cas系统由两部分组成:在大肠杆菌中发现的簇状规则间隔的短回文重复序列[2](Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)和CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated proteins,Cas)。该系统可以分为两大类,分别为Class1和Class2[3]。Class1需要多个效应蛋白组合作用才能完成靶向剪切功能;Class2包括Ⅱ型、Ⅴ型和Ⅵ型,只需要单个效应蛋白就可以完成靶向剪切作用。Class2因具有简单性而被广泛使用[4]。它们均通过向导RNA(guide RNA,gRNA)识别靶标的原间隔子相邻基序(protospacer adjacent motif,PAM),进而对靶标起作用。本文对Class2中应用最广泛的CRISPR-Cas9和CRISPR-Cas12a的作用机制及其应用领域进行阐述,并对二者进行比较。

1 Cas9与Cas12a的作用机制比较

1.1 PAM识别位点不同

PAM是前间隔序列的5′或3′端延伸几个碱基构成的十分保守的序列,长度一般为2～5 bp。PAM可以使CRISPR-Cas系统区分自身的核酸和外源的核酸[5],避免CRISPR-Cas系统出现自身免疫反应。

PAM存在于靶标DNA双链中,Cas9能够识别富G序列5′-NGG-3′,通过Cas9羧基端保守的精氨酸残基的主沟与非互补链的GG二核苷酸相互作用识别[6]。有研究表明,Cas9也能够识别没有PAM的RNA。 STRUTT等[7]证明,在Cas9亚型中,空肠弯曲杆菌Cas9(CjCas9)可以不依赖靶标RNA分子中的PAM位点,直接利用RNA-RNA相互作用,从而识别RNA。使得CRISPR-Cas9直接靶向RNA成为可能,进一步扩大了CRISPR-Cas9系统的应用范围,这表明Cas9可以对DNA和RNA病毒进行细胞防御。

Cas12a能够识别富T序列5′-TTTV -3′,相对于富G的Cas9 PAM来说,扩大了基因组靶标的广度[8]。KLEINSTIVER等[9]设计了一种增强型酸氨基球菌Cas12a变种(enAsCas12a)实验,使标准PAM位点上的基因组编辑活性扩大了两倍。除了典型的PAM外,Cas12a还可以对含C的PAM序列进行识别,与靶标DNA双链相互作用。

1.2 gRNA的结构不同

gRNA是一种小分子非编码RNA[10],作用于动质体(一种附有鞭毛的原生动物,包含某些能使人类或其他动物发生严重疾病的寄生虫)体内的RNA编辑后转录修饰过程。gRNA也可与前体mRNA(pre-mRNA)结合,通过在pre-mRNA中插入一定数量的U,形成成熟的mRNA。gRNA靶向结合基因组中的特定靶标DNA序列,是CRISPR系统的一个共同特性。gRNA的表达水平与基因编辑效率密切相关。

Cas9的gRNA是由反式激活crRNA(trans-activating crRNA,tracrRNA)与CRISPR RNA(crRNA)组成的100 nt的杂合体,又称小向导RNA(small guide RNA,sgRNA)[11]。sgRNA可以识别基因组上的特定序列,而Cas9可以作为剪刀,对DNA序列进行剪切。为了提高基因组编辑的准确性,研究人员对Cas9核酸酶进行突变,使其只能剪切靶标DNA双链中的一条链。通过sgRNA引导突变的Cas9对靶标DNA进行剪切,可以降低脱靶效应,提高基因组编辑的特异性。

Cas12a的gRNA仅由42 nt组成,它将自己的 pre-crRNA 加工为成熟的 crRNA,而不需要tracrRNA。它与Cas12a结合可以对靶 DNA 进行剪切[12]。另外,对crRNA进行结构优化,增加crRNA的稳定性,可以提高它与Cas12a的结合能力,从而增强Cas12a的活性。

1.3 发挥功能的阶段不同

CRISPR序列由前导序列、重复序列和间隔序列组成。CRISPR-Cas系统中的Cas9和Cas12a都有独特的适应、表达和干扰阶段(图1)。

图1 CRISPR-Cas9/12a的模块化结构

适应阶段相当于邻近PAM的序列的捕获阶段,细菌识别出外源DNA,利用Cas蛋白复合物与外源的靶标DNA分子结合,导致其双链断裂[13]。入侵噬菌体或质粒的短DNA片段(原间隔序列)整合在CRISPR位点前导序列的末端,产生新的间隔序列。在CRISPR-Cas9系统中,Cas9-tracrRNA复合物与Csn2和Cas1-Cas2构成的复合物一起参与间隔序列的获取,而在CRISPR-Cas12a系统采用Cas12a、Cas1、Cas2和Cas4获取间隔物。

表达阶段是crRNA的合成和表达,CRISPR序列连同间隔序列被转录成pre-crRNA。pre-crRNA的加工通常会产生30～65 nt的成熟crRNA,这些成熟crRNA只包含一个间隔[14]。它们与一个或多个Cas蛋白结合形成效应复合物,对靶序列进行特异性识别,负责CRISPR-Cas免疫特异性的向导[10]。在 Cas9系统中,pre-crRNA 表达由嵌入在CRISPR序列中的富含AT的前导序列的启动子控制。与pre-crRNA 具有互补序列的tracrRNA是加工pre-crRNA所必需的。靶标DNA被Cas9特异性识别,并被内源性RNaseⅢ进一步切割[15]。然后,由核酸酶修剪crRNA的5′端,形成成熟的crRNA。同时,可以人为地将crRNA和tracrRNA结合为 sgRNA进行基因编辑。与Cas9系统不同,Cas12a负责pre-crRNA的加工,而不需要tracrRNA与pre-crRNA的共同作用就可产生成熟的crRNA[8]。Cas12a在不需要tracrRNA的情况下,将其自身的前crRNA加工为成熟的crRNA,使其成为一种具有核糖核酸内切酶活性的独特效应蛋白[16]。pre-crRNA转录完成后,Cas12a将其剪切到CRISPR序列中形成的发夹结构的上游4 nt处,产生中间crRNA分子,中间crRNA分子在体内进一步加工为成熟crRNA[17]。

在干扰阶段中,crRNA和Cas蛋白整合成一个复合物,利用crRNA识别靶标DNA或RNA,从而激活复合物的切割活性,使宿主细胞免受感染[2]。Cas9和Cas12a作为核酸酶(图2),在干扰过程中起着关键作用。Cas9包含RuvC和HNH两个核酸酶结构域,这两个结构域分别负责在crRNA-target DNA复合物中移位和靶标DNA链的剪切。HNH核酸酶可以剪切靶标DNA;RuvC核酸酶可以分裂成RuvC-Ⅰ、RuvC-Ⅱ和RuvC-Ⅲ亚结构域,并剪切非靶标DNA[18]。Cas12a的氨基酸序列只包含一个RuvC核酸酶结构域[19]。Cas12a、crRNA和靶标DNA构成的复合物,在结构上揭示了具有独特折叠的核酸酶结构域,在功能上类似于Cas9的HNH结构域。

图2 效应蛋白的结构域

1.4 剪切靶标的机制不同

CRISPR-Cas作为一种分子剪刀,可以特异性地识别外源核酸并利用Cas蛋白剪切靶标DNA序列,从而实现对自身的免疫(图3)。

图3 CRISPR-Cas9和CRISPR-Cas12a的剪切方式

在CRISPR-Cas9系统中,Cas9与sgRNA相互作用。Cas9识别PAM序列后,靶标 DNA 解开双链,sgRNA和DNA 互补结合。当DNA与sgRNA结合完成后,Cas9在HNH和RuvC结构域的催化位点上剪切靶标DNA,产生平末端的双链断裂[20]。

在CRISPR-Cas12a系统中,利用crRNA引导的Cas12a作用于非靶标单链DNA和靶标双链DNA[8]。Cas12a在crRNA的引导下识别含PAM的靶标双链DNA,使其解链。靶标双链中的一条链与crRNA形成环状复合体,进而释放出Cas12a中的RuvC的活性位点,使得靶标DNA解旋后被剪切。当Cas12a完成对靶标DNA的剪切后,会激活Cas12a反式裂解单链DNA的无差别切割活性[21]。

2 Cas9和Cas12a在诊断领域与治疗领域中的作用比较

2.1 Cas9主要应用治疗领域

癌基因的调控方式与正常基因不同,可促进正常细胞的恶性转化。CRISPR-Cas9系统为改变癌基因活性提供了有效的措施,从而抑制肿瘤生长,为有效治疗肿瘤奠定了坚实的基础。

GAO等[22]评估了CRISPR-Cas9系统对宫颈癌前病变的治疗效果,发现CRISPR-Cas9在抑制宫颈癌前病变细胞系的细胞生长和集落形成以及诱导细胞凋亡方面表现出了特异性。在K14-HPV16转基因小鼠HPV驱动的自发性宫颈癌变模型中,应用CRISPR-Cas9处理可导致E7基因突变,并恢复RB、E2F1和CDK2的表达,从而逆转宫颈癌变表型,证明了当CRISPR-Cas9靶向HPV16 E7时,可以有效逆转HPV相关的体外宫颈癌变以及K14-HPV16转基因小鼠的宫颈癌变,在宫颈癌前病变的临床治疗中显示出巨大潜力。LIU等[23]开发了一种名为CRISPReader的技术,可以有效控制靶向转基因和翻译。他们利用 CRISPReader技术对基因电路进行改进和优化,将基因电路微型化和简单化,并构建了介导人膀胱癌细胞中基因表达的微型基因回路。通过调控CRISPR-Cas9介导的肿瘤抑制基因hBax、E-cadherin和p21,有效抑制了膀胱癌细胞的增殖,降低了细胞活力,诱导细胞凋亡。

心血管疾病(CVD)是全球死亡的主要原因,占2019年死亡总人数的32%。Cas9可降低低密度脂蛋白胆固醇水平,加强对心血管疾病的预防。

碱基编辑器是由CRISPR-Cas9与胞嘧啶脱氨酶结构域组成的,它能以序列特异的方式将基因组DNA 中的胞嘧啶碱基改变为胸腺嘧啶碱基,而无须双链DNA断裂。科学家们将其植入成年小鼠的肝脏,以评估它是否能在Pcsk9(9型枯草蛋白酶)基因中引入位点特异性无义突变。这导致了成年小鼠血浆PCSK9蛋白水平大幅降低,血浆胆固醇水平也有一定程度的降低[24]。研究人员通过CRISPR-Cas9介导的基因整合技术,将LEF1基因导入到19号染色体上。结果证明LEF1/hUCB间充质干细胞在氧化应激条件下的增殖和存活率提高。这项研究表明,干细胞疗法与促进细胞存活的转录因子LEF1基因组编辑相结合,可成为心血管疾病的有效治疗策略[25]。

2.2 Cas12a主要应用诊断领域

CRISPR-Cas12a与其他技术相结合,可以实现快速即时检测,在病毒检测方面具有极大的前景。

CHEN等[26]的团队研发了一个基于CRISPR的DNA诊断平台,命名为“DETECTR”。它结合等温扩增技术(LAMP/RPA),可以快速、准确地检测出临床相关的HPV。LIU等[27]利用Cas12a反式裂解单链DNA活性的能力,结合亚甲基蓝标记的单链DNA,同时利用带负电荷的氧化铟锡电极,制作了一个简单、无固定化、灵敏度高、均匀的电化学生物传感器,用于检测HPV。MAYURAMART等[28]结合RT-RPA和CRISPR-Cas12a技术检测流感病毒和SARS-CoV-2,灵敏度高、特异性强,是检测流感病毒和SARS-CoV-2的有效方法,并可用于其他传染病的检测。

食品安全直接关系到广大人民群众的身体健康和生命安全[29]。基于CRISPR-Cas12a系统的荧光传感技术从疾病诊断扩展到食品安全监测领域,为食品安全检测提供了一种新策略。

副溶血性弧菌广泛存在于海产品中,该菌可引致肠袢肿胀、充血和肠液潴留,引起腹泻。ZHANG等[30]将副溶血弧菌特殊热嗜性溶血素基因的一段序列作为靶标,设计出相应的crRNA,将CRISPR-Cas12a系统预装在试管盖内,然后对提取的虾样品进行PCR扩增。离心混合试剂后在37 ℃反应5～10 min,可在紫外光下肉眼读取结果,该方法推进了其在食品安全保障领域的应用。BONINI等[31]建立了一种基于CRISPR-Cas12a的无标记阻抗生物传感方法,用于检测大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。电化学阻抗光谱法可以灵敏而强大地检测电极表面微小的物理和化学变化。修饰电极上的ssDNA会阻碍电极与溶液之间的电子交换。当 CRISPR-Cas12a识别到目标细菌的特定序列时,就会开启ssDNA的裂解模式,导致电荷转移电阻下降。该方法不仅可以缩短检测时间,还在食品安全、公共卫生安全中具有较高的应用价值。

3 展望

基因组信息在医疗、传染病预防和其他许多医疗实践中变得越来越重要。根据已经报道的方法,CRISPR技术不仅在哺乳动物细胞的基因组编辑和基因调控中被广泛应用,而且在遗传性疾病治疗方面显示出惊人的发展潜力。对CRISPR-Cas9和CRISPR-Cas12a进行区分,有助于其相关技术更好地应用。目前,CRISPR介导的基因组工程的核心是Cas9,但其可能出现的脱靶效应制约了它的发展。因与Cas9具有巨大差异,Cas12a已成为一种可供选择的分子基因组编辑工具。CRISPR-Cas9和CRISPR-Cas12a技术的应用已趋于成熟,但其临床应用仍需进一步完善。如今,Cas12f、Cas13a也逐渐进入人类的视野。尽管CRISPR诊断工具已经显示出明显的进步迹象,但由于新兴技术转化为实践的复杂性,CRISPR的临床用途、商业试剂盒和设备较少。伴随着新开发的应用的出现和更多Cas同源物的发现,CRISPR技术已经被用来促进人类健康服务诊断,在医疗方面做出了巨大贡献。