流式细胞术估测胡椒属植物基因组大小方法的建立及应用

伍宝朵 胡丽松 冯楗雄 范睿 郭芬 吉训志 郝朝运 闫林

关键词：胡椒属；流式细胞术；细胞核提取液；基因组大小

基因组大小是指某种生物中单倍体细胞核或配子体中的DNA含量，是物种特有的，称为C值（C-value），常用重量皮克（10?12g）或核苷酸碱基对数量（basepair）来表示。基因组大小与物种的进化有较强的相关性，同时与生物学性状也有一定的关系[1]。基因组大小测定的方法有多种，如Feulgen染色法、化学分析法及流式细胞术等。Feulgen染色法结果相对准确，但是操作过程繁琐；化学分析法易受细胞周期影响，致使测定结果存在偏差[2]；而新技术流式细胞术（flowcytometry，FCM）具有瞬间准确分析大量细胞的特点，是一种测定基因组大小快速且有效的方法[3]。流式细胞术在人和动物的临床和基础研究中被广泛应用，植物体内由于含有大量的多糖、多酚等次生代谢物质，严重影响了PI染料的荧光染色强度，降低了测定基因组大小的准确性[4]。因此明确适合测定物种流式细胞术的测定方法对该物种基因组大小研究至关重要。近年来，流式细胞术在植物中被广泛应用。杨转英等[5]采用流式细胞术测定不同菠萝蜜株系基因组大小，发现不同菠萝蜜株系之间基因组大小存在显著差异，且湿苞株系大于干苞株系。柳觐等[6]利用改良OTTO细胞核提取液检测出澳洲坚果基因组大小为1.872758×109bp，该研究发现运用流式细胞术进行澳洲坚果基因组C值测定准确可靠。

胡椒属植物是胡椒科（Piperaceae）重要的泛热带组成成分，是基部被子植物中最大的属之一[7]。约有1000多个种，主要分布于南亚、南美洲、中美洲等热带和亚热带地区。胡椒属内有许多具有经济价值和开发潜力的资源，例如胡椒（P.nigrum）、卡瓦胡椒（P.methysticum）和石楠藤（P.wallichii）等被用来入药[8]，在亚洲东南部，人们常将蒌叶（P.betle）和槟榔果连同石灰一起咀嚼帮助消化。胡椒野生近缘种众多，部分资源具有优良性状，例如黄花胡椒（P.flaviflorum）具有较强的抗瘟病性[9]。大叶蒟（P.laetispicum）具有较长的花穗，石楠藤具有较强的抗寒性等[10]。胡椒是人们喜爱的调味品，素有“香料之王”的美誉。原产于印度，胡椒自1947年引入中国，目前种植面积达3万hm2，年总产量超过3万t，位居世界第5位。我国胡椒栽培品种以热引1号（P.nigrumcv.Reyin1）为主，存在栽培品种单一和抗逆性弱的问题，严重限制了我国胡椒产业的良性发展[11-12]。因此亟待开展胡椒资源挖掘和创新利用工作。胡椒是四倍体植物，染色体数为2n=4x=52[13]。JOSE等[14]报道胡椒属不同资源具有不同染色体数，且胡椒属植物具有较小的染色体长度（0.56～2.41μm），而染色体倍性分析需要较强的实验技术，利用流式细胞术可快速测定胡椒属资源基因组大小，为染色体倍性估测和分析提供基础。

本研究以4份不同来源地胡椒属种质为材料，通过筛选6种细胞核提取液和不同部位葉片，明确适合胡椒属基因组大小的流式细胞术测定方法。利用筛选出的适合胡椒流式细胞术测定的方法，以黄瓜为标样，测定22份胡椒属资源的基因组大小。本研究可为胡椒属资源基因组大小测定提供方法，也将为胡椒属资源变异、种质资源评价及远源杂交等研究提供技术基础。

1材料与方法

1.1材料

供试材料为胡椒属种质，胡椒属种质叶片取材于中国热带农业科学院香料饮料研究所的农业农村部万宁胡椒种质资源圃。分别取4份来源地不同的胡椒属种质嫩叶用于细胞核提取液筛选（表1）；取4份种质的下位叶、中位叶、倒一叶用于叶片部位筛选；22份胡椒属资源用于测定基因组大小。以黄瓜（CucumissativusL.）为标样[15]，将黄瓜种子播种于15cm×20cm培养盆中，并在人工气候室培育，待长出真叶后取嫩叶用于试验。

1.2方法

1.2.1细胞核提取液及DNA荧光染料的配制选取4种已报道的细胞核提取液（Otto提取液[5]、Tris提取液[16]、LB01提取液[4]和WPB提取液[17]）、1种改良提取液[18]和1种PI试剂盒（广州吉源生物科技有限公司），细胞核提取液具体配方见表2。提取液配制完成后过滤、灭菌，并置于4℃冰箱内保存。荧光探针是碘化丙啶（PI），PI工作液中碘化丙啶的浓度为1mg/mL。

1.2.2细胞核悬浮液的制备和染色剪取约20～40mg胡椒叶片放入60mm培养皿中，加入预冷的细胞核提取液500μL，让提取液充分浸没叶片，用厚度为0.08mm锋利的双面刀片迅速切成碎片，倾斜放置5min，再用400～600目滤膜过滤至流式细胞仪专用上样管中，在滤液中加入2mL细胞核提取液或缓冲液、6μLRNaseA（终浓度为40μg/mL）和20μLPI染液，避光静置30min。

1.2.3流式细胞术检测将制备好的细胞核悬浮液采用德国Partec公司CyFlow?Cube6流式细胞仪检测。流式细胞仪的氩离子激光发射器的激发光波长为488nm，检测通道为FL2通道590/50[488]，利用流式细胞仪随机自带软件CyFlowCube15-CFG收集至少5000个细胞，变异系数（coefficientofvariation，CV）控制在6%以内；每个样本重复测定5次。

1.3数据处理

利用FlowJo-V10软件分析数据，以标样基因组大小和出峰位置为对照，依据测定样品出峰位置计算出其基因组大小（基因组C值），计算公式为：待测样本基因组大小=参考样本基因组大小（待测样本荧光均值/参考样本荧光均值）；使用SPSS16.0软件进行数据统计分析。

2结果与分析

2.1细胞核提取液的筛选

比较6种细胞核提取液流式细胞术测定结果可知（图1），以Otto提取液为细胞核提取液时，只有墨西哥胡椒能检测出信号峰，热引1号胡椒、黄花胡椒和卡瓦胡椒3份种质不能检测出信号峰。以Tris提取液为细胞核提取液时，热引1号胡椒和墨西哥胡椒能检测出信号峰，但是信号峰碎片较多，CV值均大于6，黄花胡椒和卡瓦胡椒不能检测出信号峰。以LB01提取液为细胞核提取液时，热引1号胡椒、墨西哥胡椒和卡瓦胡椒均能检测出信号峰，其中热引1号胡椒和卡瓦胡椒的信号峰都是碎片较多，CV值大于6，墨西哥胡椒信号峰碎片相对少一些，黄花胡椒不能检测出信号峰。以WPB提取液为细胞核提取液时，热引1号胡椒和墨西哥胡椒均能检测出信号峰，但是检测出的信号峰都是碎片较多，CV值大于6，黄花胡椒和卡瓦胡椒不能检测出信号峰。以PI试剂盒为细胞核提取液时，墨西哥胡椒和卡瓦胡椒能检测出信号峰，但是卡瓦胡椒信号峰碎片稍多，热引1号胡椒和黄花胡椒不能检测出信号峰。以改良提取液为细胞核提取液时，4份种质均能检测出完整信号峰，CV值小于6。可见，改良提取液是适合胡椒属种质流式细胞术的细胞核提取液。

2.2叶片取样部位的筛选

为选择适合胡椒属种质资源流式细胞检测的最佳部位叶片，利用筛选出的改良提取液分别对黄花胡椒、热引1号胡椒、卡瓦胡椒和墨西哥胡椒的下位叶（superiorleaf）、中上位叶（inferiorleaf）和倒一叶（invertedoneleaf）进行流式细胞术检测（图2），结果表明4份胡椒种质使用下位叶和上位叶检测时，少数不能形成完整的信号峰，多数形成了完整的信号峰，但是与倒一叶相比，下位叶和上位叶形成的信号峰碎片较多，细胞核收集偏少。可见，倒一叶是适宜胡椒属流式细胞术的叶片采样部位。

2.3胡椒属资源C值测定

通过比较待测胡椒资源样品与黄瓜样品峰值的倍数关系（图3），计算出胡椒资源的基因组大小（表3）。以热引1号胡椒为例，其荧光强度是6596，标样黄瓜的荧光强度为3184，ARUMUGANATHAN等[15]报道利用流式细胞术测定的黄瓜基因组大小为367Mb，依据基因组大小计算公式，计算出热引1号胡椒基因组大小为759.69Mb，HU等[19]通过全基因组测序估测的热引1号胡椒基因组大小为761.2Mb，二者误差较小，说明该方法准确可靠。利用同样的方法，估测了22份胡椒资源基因组大小，检测的胡椒种质基因组大于900Mb的种质有石楠藤、卡瓦胡椒和山蒟；基因组在600～800Mb的种质有热引1号、柬埔寨小叶种、班尼约尔1号、古晋、Aman胡椒、EMAS胡椒、73F5、杂交种、复毛胡椒、华山蒟、蒌叶和筚菝；基因组小于600Mb的种质有海南蒟、假蒟、大叶蒟、尖峰岭胡椒、斜叶蒟、黄花胡椒和墨西哥胡椒。综上可见，胡椒属不同种质间基因组大小差异较大。

3讨论

植物体内含有大量的多糖、多酚等次生代谢物质，严重影响了PI染料的荧光染色强度，降低了测定基因组大小的准确性。胡椒属植物是遍布于热带地区的重要作物，胡椒叶片具有较厚的蜡质层，叶片硬度较高，细胞中具有较复杂的次生代谢物质，研究表明胡椒叶中DPPH清除能力、多酚含量及氧自由基清除能力均高于胡椒果实，可能含有高抗氧化因子[20]。本研究尝试采用已报道植物流式细胞术测定细胞核提取液（Otto、Tris、LB01、WPB提取液和PI试剂盒）测试胡椒属植物，均不能得到满意效果，因此，明确适合胡椒属植物流式细胞术的细胞核提取液及测定方法对胡椒属植物基因组大小研究至关重要。

本研究发现，与Otto、Tris、LB01、WPB提取液和PI试剂盒相比较，以改良提取液为细胞核提取液检测胡椒属植物时，噪音峰能够与信号峰较好分离，碎片相对较少，CV值也符合流式细胞术分析要求，是适合胡椒属植物基因组大小测定的细胞核提取液。本研究选用的6种提取液配方差异较大，以改良提取液检测胡椒属植物效果最好，LB01提取液效果次之。比较改良提取液和LB01提取液配方发现，二者共有的成分有Tritonx-100、Cl-和Tris，改良提取液特有的成分是NaHSO3，而LB01提取液特有的成分是spermine·4HCl。分析另外3种已知配方提取液发现，Tritonx-100、Cl-和Tris这3种成分在Tris和WPB提取液中也同时存在。说明NaHSO3和spermine·4HCl可能适用于作为胡椒属植物流式细胞术检测的提取液配方，尤其是NaHSO3更适合，当然，它们需与其他成分相互作用才能更好地发挥作用。本研究只测试了改良提取液在胡椒属植物中的应用，还适用于哪些植物需要进一步试验证明。

分析不同种质信号峰检测结果发现，不同种质检测出信号峰的难易程度差异较大。如：热引1号胡椒在2种提取液中能检测出完整信号峰，3种提取液中能检测的信号峰不能与噪音峰分离；黄花胡椒除在改良提取液中能检测出完整信号峰，其他的均不能；而墨西哥胡椒在4种提取液中均能检测出完整信号峰，另外2种的信号峰不能与噪音峰分离。说明利用流式细胞术检测胡椒属内不同种资源时也具有特异性，这可能与不同种资细胞内次生代谢物质不同有关。

本研究选用的栽培种胡椒有7份。古晋、Aman和EMAS胡椒都是马来西亚育成品种，其中EMAS胡椒是由Balancotta（印度品种）和古晋杂交并回交选育而成，Aman胡椒是由从哥斯达黎加引种的品种CATIERow1-1的无性系选育而来[21]。经测试发现，古晋、Aman和EMAS胡椒的基因组大小分别为708.31、667.94、719.32Mb；热引1号是由从印度尼西亚引种的品种南榜的无性系经长期选育而来，班尼约尔1号是从印度引进的品种，73F5是热引1号和班尼约尔1号的杂交后代，柬埔寨小叶种是从柬埔寨引进的小叶种胡椒品种。热引1号、柬埔寨小叶种、班尼约尔1号和73F5的基因组大小分别为759.69、759.69、770.70、785.38Mb。综上可见，本研究中测定的7份栽培种胡椒的基因组大小存在差异。JOSE等[14]报道栽培种班尼约尔1号、Cheriakaniakadan和Karimunda的总染色体长度分别为67.04、51.48、56.66μm，因此不同栽培种之间基因组大小也会存在差异。本研究中，来源于马来西亚的品种与来源于印度尼西亚、印度、柬埔寨的品种基因组大小也具有差异。

JOSE等[14]认为胡椒属资源的染色體基数是n=13（P.cubeba除外），研究发现，栽培胡椒、蒌叶、荜菝和卡瓦胡椒的染色体数分别为2n=4x=52、2n=2x=52、2n=2x=52和2n=10x=130[14，22-23]。本研究测定卡瓦胡椒基因组大小大于900Mb，明显大于另外3种染色体数为52的种质，此外，石楠藤和山蒟的基因组也大于900Mb，依据前面结论推测石楠藤和山蒟的染色体条数应该是大于52且为13的倍数[14]。本研究中7份栽培胡椒染色体数都是52，基因组大小范围为667.94～785.38Mb，SAMUEL等[22]研究中报道，3份染色体数为52的种质（P.nigrum、P.ornatum和P.porphyrophyllum）染色体长度为52.32～72.18μm，其中P.nigrum的染色体长度最长，推断基因组大小在600～800Mb范围内的种质染色体数可能也是52条。杂交种是一个未知种，从表型和进化上来看，该种具有与栽培胡椒和黄花胡椒相近的表型，本研究发现，其基因组大小几乎等于栽培胡椒和黄花胡椒的平均值，因此推测杂交种可能是栽培胡椒和黄花胡椒的杂交后代。