基于转录组测序的藏猪睾丸组织性成熟相关基因鉴定

摘要：【目的】基于转录组测序分析筛选出藏猪睾丸组织中的性成熟相关基因，为提高藏猪的繁殖育种性能提供 参考依据。【方法】以性成熟前（2月龄）和性成熟后（24月龄）的藏公猪为研究对象，通过人工阉割法采集藏猪睾丸组织 进行转录组测序，依据错误发现率（FDR）lt;0.05且logFold Change|gt;1的标准筛选差异表达基因（DEGs），综合GO功 能注释分析和KEGG信号通路富集分析筛选出藏公猪性成熟相关候选基因，并通过实时荧光定量PCR验证转录组测序结果的准确性。【结果】经转录组测序，从性成熟前后藏猪睾丸组织样品中筛选出5929个DEGs，其中有3822个DEGs呈上调表达、2107个DEGs呈下调表达。筛选获得的5929个DEGs主要注释到生精过程、纤毛运动、鞭毛精子运动、运动纤毛、精子主块、精子顶囊、动力蛋白轻链结合、动态蛋白中间链结合等与精子发生和精子运动等有关的GO功能条目；KEGG信号通路富集分析发现，DEGs主要富集于受体相互作用通路、轴突引导通路、神经活性配体一受体相互作用通路、钙信号通路等；综合DEGs的GO功能注释分析和KEGG信号通路富集分析结果，共筛选出9个与藏公猪性成 熟相关的基因，分别是BAX、DMRTI、FSHR、IGFIR、IZUMO1、LYZL4、LYZL6、SYCP3和TNP2。实时荧光定量PCR检测 结果显示，BAX、DMRTI、FSHR、IGFIR等4个基因在性成熟后藏猪睾丸组织中的相对表达量较性成熟前呈明显 的下降趋势，且下降幅度均在50%以上；IZUMO1、LYZL4、LYZL6、SYCP3、TNP2等5个基因的相对表达量较性成熟前 上升了1.07～30.25倍，其中IZUMO1、LYZL4和LYZL6基因的上升倍数达极显著水平（Plt;0.01），与转录组测序结果基本 一致。【结论】基于转录组测序分析从藏猪睾丸组织中筛选获得9个与性成熟相关的DEGs，即BAX、DMRT1、FSHR、 IGFIR、IZUMOI、LYZL4、LYZL6、SYCP3和TNP2，可作为研究藏猪繁殖育种能力的主要候选基因。

关键词：藏猪；睾丸组织；性成熟；精子；转录组测序

文章编号：2095-1191（2024）03-0680-09

中图分类号：S828.89

文献标志码：A

Identification of genes related to sexual maturation in Tibetan pig testis tissue based on transcriptome sequencing

SHI Chun-yuan， ZHAO Yan-ling

（College of Animal Science， Xizang Agricultural and Animal Husbandry University， Nyingchi， Xizang 860000， China）

Abstract： [Objective]Based on transcriptome sequencing analysis， the genes related to sexual maturation were screened out in testicular tissue of Tibetan pigs so as to provide reference for improving the breeding performance of Tibetan pigs. 【Method】Tibetan boars before sexual maturity （2 months old） and after sexual maturity （24 months old） were selected as the study objects， testicular tissues of the Tibetan boars were collected by artificial castration method for tran- scriptomic sequencing， and differentially expressed genes （DEGs） were screened according to the criteria of 1 dis- covery rate （FDR）lt;0.05 and |log2 Fold Changegt;1. GO functional annotation analysis and KEGG signaling pathway enrich- ment analysis were combined to select the candidate genes related to sexual maturity in Tibetan boars. And the accuracy of transcriptome sequencing results were verified by real-time fluorescence quantitative PCR. 【Result]According to tran- scriptome sequencing， 5929 DEGs were screened from testicular tissue samples of Tibetan pigs before and after sexual maturity， among which 3822 DEGs were up-regulated and 2107 DEGs were down-regulated. The 5929 DEGs were se-lected to include spermatogenesis， ciliary motility， flagellate sperm motility， motile cilia， sperm mass， sperm apical sac， kinetic protein light chain binding， dynamic protein intermediate chain binding and other GO functional entries related to spermatogenesis and sperm motility. KEGG signaling pathway enrichment analysis showed that the DEGs was mainly enriched in receptor interaction pathway， axon-guided pathway， neural active ligand-receptor interaction pathway， calcium signaling pathway， etc. Based on the GO functional annotation analysis of DEGs and the enrichment analysis of KEGG signaling pathway， a total of nine genes related to sexual maturation in Tibetan boars were selected， which were BAX， DMRT1， FSHR， IGF1R， IZUMO1， LYZL4， LYZL6， SYCP3 and TNP2. Real-time fluorescence quantitative PCR detection results showed that the relative expression levels of the four genes， including BAX， DMRT1， FSHR and IGF1R， were decreased after sexual maturity compared with that before sexual maturity， all decreased by more than 50%.The relative expression levels of the five genes， including IZUMO1， LYZL4， LYZL6， SYCP3 and TNP2， were increased by 1.07-30.25 times compared with that before sexual maturity， and the increasing times of IZUMO1，LYZL4 and LYZL6 genes reached extremely significant level （Plt;0.01）， which was basically consistent with the transcriptome sequencing results. 【Conclusion】Nine DEGs related to sexual maturity are detected in testicular tissue of Tibetan pigs before and after sexual maturity， namely BAX， DMRT1， FSHR， IGF1R， IZUMO1， LYZL4， LYZL6， SYCP3 and TNP2， which can be used as the main candidate genes to study the breeding ability of Tibetan pigs.

Key words： Tibetan pigs; testicular tissue; sexual maturity; sperm; transcriptome sequencing

Foundation items： National Natural Science Foundation of China （31760669）

0 引言

【研究意义】藏猪作为我国古老珍稀的瘦肉型猪 种，主要分布在青藏高原半农半牧区，具有四肢坚 实、脂肪沉积能力强及肉质风味鲜美等特点，但也存 在生长速度缓慢、育肥增重难、屠宰率低和繁殖能力 不强等缺陷（杨烨城等，2022），且多数藏猪为近亲繁 殖，严重制约其规模化养殖的发展速度。筛选鉴定 藏公猪性成熟相关基因，有利于对藏猪遗传特性进 行深度了解，如胰岛素样生长因子1（IGF1）和胰岛素样生长因子1受体（IGF1R）是影响动物生长发育 的重要候选基因。因此，加强藏猪遗传特性研究 及繁殖相关基因鉴定，对开展其种质资源保护及品 种改良具有重要意义。【前人研究进展】至今，转录 组学在猪业科学上的研究已得到高度重视和广泛 应用（易凡利等，2018；马围围等，2021；韦明邦等， 2022）。如基于转录组测序分析筛选出猪遗传候选 基因（甘麦邻等，2020；张福平等，2021）、猪脂肪沉积 关键基因（孙菁希等，2021；翟丽维等，2022）、猪黑色 素生成相关基因（覃海等，2022）、猪骨骼肌发育相关 基因（熊和丽等，2023）等，在猪相关病毒性疾病研究中也有应用（梁婉等，2019；王璐梦等，2021）。这些 研究通过转录组测序获得猪种在某些性状方面的特 殊基因，后续通过对这些特殊基因进行深入挖掘，可 为生产性能研究提供重要的理论依据。在藏猪上， 聂靖茹等（2022）基于RNA-Seq技术对迪庆藏猪背最长肌组织进行转录组测序，结果筛选出ATF3、CCL2、CCN1、EGR1、FOXO1等12个影响大型迪庆藏猪不同生长阶段肌肉生长的差异表达基因（Dif-ferentially expressed genes，DEGs）;宋明坤等（2022） 利用背最长肌转录组数据筛选藏公猪与大约克夏公猪差异表达IncRNAs和DEGs，发现差异表达 lncRNAs可能通过调控HESI、LEP、TGFB2和PER2 等基因的表达而影响猪肉品质；董新星等（2023）、王 琳等（2023）通过转录组测序筛选并鉴定出不同生长 阶段迪庆藏猪背、腹脂代谢的DEGs。【本研究切入 点】藏猪作为我国珍贵的物种遗传资源，在生产性 状、繁殖性能及相关基因功能等方面已得到深入研 究（易凡利等，2018；董世雄等，2022；刘思源等， 2022；韩雨晴等，2023），但针对藏猪性成熟前后睾丸 组织转录组测序的研究鲜见报道。【拟解决的关键问 题】以性成熟前（2月龄）和性成熟后（24月龄）的藏 公猪为研究对象，基于转录组测序分析筛选出藏猪 睾丸组织中的性成熟相关基因，为提高藏猪的繁殖 育种性能提供参考依据。

1材料与方法

1.1试验材料

以饲养于西藏林芝（海拔3000m）牧场且营养 良好、体况相似、繁殖机能正常的藏猪为研究对象， 随机选取性成熟前（2月龄）和性成熟后（24月龄）的 藏公猪各3头，按照《实验动物管理条例》规定，通过人工阉割法采集藏猪睾丸组织，将表皮划开取黄豆 粒大小样本，生理盐水冲洗后放入装有RNA保存液的冻存管中，编号[性成熟前（TPA）：TPO1、TP02、TP03；性成熟后（TPB）：TP04、TP05、TP06]，然后置于-80℃冰箱保存备用。RNATRIzol提取试剂盒（T102096）购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；TruSeq Stranded Total RNA with Ribo-Zero Gold（RS122-2301）购自美国Illumina公司；Agencourt AMPure XP（A63881）购自美国Beckman Coulter公司;Bioana- lyzer 2100 DNA-1000 Kit（5067-1504）购自美国Aglient公司;SuperScript Ⅱ Reverse Transcriptase（18064014） 购自美国Invitrogen公司;TransScript®All-in-One First- Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR （AT341- 02）和PerfectStartTM Green qPCR SuperMix（AQ601）购自北京全式金生物技术股份有限公司。主要仪 器设备：ST16R冷冻离心机（美国ThermoFisher Sci- entific公司），NanoDrop 2000紫外分光光度计（美国 ThermoFisher Scientific公司），Centrifuge 5418R台式 离心机（德国Eppendorf公司），Tanon 2500凝胶成像系统（上海蓓米尔生物科技有限公司），MyCyclerPCR仪（美国Bio-Rad公司），Qubit2.0荧光定量仪（美国 ThermoFisher Scientific公司），Bioanalyzer生化分析仪（安捷伦科技有限公司）。

1.2转录组测序

转录组测序分析委托上海欧易生物医学科技有 限公司完成。采用TRIzol法提取藏公猪睾丸组织总RNA，利用NanoDrop 2000分光光度计检测其浓度及OD250/OD230，以1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。质检合格的总RNA去除rRNA后进行片段化处理，逆转录生成cDNA，末端补平poly（A）尾及加接头，PCR扩增后上机测序，测序原始数据经生物分 析前预处理后，进行基因组比对、转录本拼接及基因 表达定量分析。

1.3DEGs筛选与分析

通过HtSeq-count获取每个样本中比对到蛋白编码基因上的Reads，再根据FPKM公式计算基因表达量（FPKM值）。FPKM（A）=（比对到基因A的 Fragments/比对到所有基因的Fragmentsx基因A长 度×10°）。然后计算差异倍数，并采用NB（负二项分布检验）进行差异显著性检验，最终根据差异倍 数及差异显著性检验结果筛选[DEGs错误发现率 （FDR）lt;0.05且|log2Fold Change|gt;1]，并对筛选获得 的DEGs进行火山图（Volcano Plot）分析、GO功能注释分析和KEGG信号通路富集分析，根据分析结果筛选出藏公猪性成熟相关候选基因。

1.4实时荧光定量PCR验证

使用 TransScript®All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR试剂盒将质检合格的 总RNA反转录合成cDNA。反转录体系10.0μL：总 RNA 0.5 μg， 5×TransScript® All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR 2.0 uL， gDNA Remover 0.5 uL，Nuclease-free H20补足至10.0 uL。反转录程序：42℃15min，85℃5s。实时荧光定量PCR扩增引物（表1）由上海欧易生物医学科技有限 公司设计，并委托北京擎科新业生物技术有限公司 合成。使用PerfectStartTM Green qPCR SuperMix 试 剂盒在LightCycler®480Ⅱ型荧光定量PCR仪上完 成实时荧光定量PCR验证。反应体系10.0μL：2×PerfectStartTMGreen qPCR SuperMix 5.0 uL，上、下游引物（10umol/L）各0.2uL，cDNA模板1.0uL， Nuclease-free H2O3.6μL。扩增程序：94℃预变性30s；94℃5s，60℃30s，进行45个循环。以HMBS为内参基因，采用2-^Ac法计算目的基因相对表达量，采 用SPSS 19.0进行单因素方差分析（One-way ANOVA）。 2结果与分析

2.1转录组测序分析结果

对6份藏猪睾丸组织样品的转录组测序共获 得94.26 Gb的有效碱基（Clean bases），其中14.61～16.64 Gb的Clean bases占比较高，Q30分布范围在93.28%～93.76％，GC含量为48.86%～50.03%（表2）。将有效序列（Clean reads）与参考基因组进行比对， 结果发现6个样本的转录组测序数据比对率均 在90.00%以上，Clean reads的准确性和可靠性为90.07%～91.16%。此外，每个样本原始碱基（Raw bases）过滤后获得的Clean bases不少于14.50 Gb，且Q30gt;93.00%、GC含量gt;48.50%，说明转录组测序数据质量 较高，可用于后续研究。

2.2DEGs筛选结果

以性成熟前的藏猪睾丸组织样品（TP01、TP02、TP03）为对照组，性成熟后的藏猪睾丸组织样品（TP04、TP05、TP06）为试验组，依据FDRlt;0.05且|log2Fold Change|gt;1的标准，共筛选出5929个DEGs，其中有3822个DEGs呈上调表达、2107个DEGs呈下调表达。性成熟前后藏猪睾丸组织DEGs火山图如 图1所示。

2.3DEGs的GO功能注释分析结果

DEGs的GO功能注释分析结果（图2）显示：在 生物学过程（Biological process）中，DEGs主要注 释到生精过程（Spermatogenesis）、纤毛运动（Cilium movement）、鞭毛精子运动（Flagellated sperm moti- lity）、多细胞生物发育（Multicellular organism deve- lopment）、纤毛组装（Cilium assembly）、细胞分化 （Cell differentiation）及精细胞发育（Spermatid deve- lopment）等GO功能条目；在细胞组分（Cellular com- ponent）中，DEGs主要注释到基因丝（Axoneme）、运 动纤毛（Motile cilium）、纤毛（Cilium）、精子主块（Sperm principal piecee）、精子顶囊（Acrosomal ve- sicle）、微管（Microtubule）和睫状基体（Ciliary basal body）等GO功能条目；在分子功能（Molecular funca- tion）中，DEGs主要注释到动力蛋白轻链结合 （Dynein light chain binding）、动态蛋白中间链结合（Dynein intermediate chain binding）、金属内肽酶活 性（Metalloendopeptidase activity）、微管结合（Microtu- bule binding）、钙离子结合（Calcium ion binding）等 GO功能条目。

2.4DEGs的KEGG信号通路富集分析结果

对DEGs进行KEGG信号通路分析，并利用超几何分布检测评估各通路中DEGs的富集情况，得到前20条KEGG信号通路富集分析气泡图。如图3所示，DEGs主要富集于受体相互作用通路（ssc04512：ECM-receptor interaction）、轴突引导通路（ssc04360： Axon guidance）、神经活性配体一受体相互作用通路 （ssc04080： Neuroactive ligand-receptor interaction）、钙信号通路（ssc04020：Calcium signa-ling pathway）、 心律失常性右心室心肌通路（ssc05412：Arrhythmo- genic right ventricular cardiomyopathy）、肥厚性心肌 病通路（ssc05410：Hypertrophic cardiomyopathy）、化学致癌-DNA加合物通路（ssc05204：Chemical carcino-genesis-DNA adducts）、矿物吸收通路（ssc04978：Mine-ral absorption）、PPAR信号通路（ssc03320：PPAR sig-naling pathway）及消化吸收通路（ssc04974：Protein digestion and absorption）等。

2.5藏公猪性成熟相关基因筛选结果

综合DEGs的GO功能注释分析和KEGG信号 通路富集分析结果，共筛选出9个与藏公猪性成熟 相关的基因，分别是凋亡蛋白基因（BAX）、双性和mab-3相关转录因子1（DMRT1）、卵泡刺激素受体基因（FSHR）、胰岛素样生长因子1受体基因（IGFIR）、精卵融合必需蛋白1基因（IZUMO1）、人源类溶菌酶蛋白4基因（LYZL4）、人源类溶菌酶蛋白6基因（LYZL6）、突触复合蛋白3基因（SYCP3）和过渡蛋白2基因（TNP2）。其中，BAX基因在线粒体凋亡过程 中发挥作用；DMRTI基因通过控制睾丸发育和生殖细胞增殖，在雄性性别决定和分化中起关键作用； FSHR基因通过cAMP的产生激活下游PI3K-Akt和ERK1/ERK2信号通路；IGF1R是胰岛素样生长因子 1受体a链，介导胰岛素样生长因子1作用的受体酪 氨酸激酶；IZUMO1基因是受精的必需因子；LYZL4基因可能参与受精，而LYZL6基因可能与受精过程 中精卵质膜的黏附与融合有关；SYCP3是雄性生 殖细胞减数分裂过程中着丝粒配对的必需蛋白； TNP2基因在精细胞伸长与浓缩过程中发挥重要 作用。

2.6实时荧光定量PCR验证结果

以性成熟前的藏猪睾丸组织样品（TP01、TP02、TP03）为对照组，性成熟后的藏猪睾丸组织样品（TP04、TP05、TP06）为试验组，通过实时荧光定量PCR检测筛选出的9个藏公猪性成熟相关基因，设性成熟前藏猪睾丸组织的相对表达量为1，以2-Ac法 计算目的基因在性成熟后藏猪睾丸组织的相对表达 量，结果（图4）显示，BAX、DMRT1、FSHR、IGFIR等 4个基因在性成熟后藏猪睾丸组织中的相对表达量 较性成熟前呈明显的下降趋势，且下降幅度均在50%以上；IZUMO1、LYZL4、LYZL6、SYCP3、TNP2等 5个基因的相对表达量较性成熟前上升了1.07～30.25倍，其中IZUMO1、LYZL4和LYZL6基因的上升倍数达极显著水平（Plt;0.01）。同时，计算9个基因的表达差异倍数（表3），发现实时荧光定量PCR检测结果与转录组测序结果基本一致，即BAX、DMRT1、 FSHR、IGF1R等4个基因呈下调表达，IZUMO1、LYZL4、LYZL6、SYCP3、TNP2等5个基因呈上调表达，进一步 证实转录组测序结果的准确性。

3讨论

本研究对性成熟前后的藏公猪睾丸组织进行转 录组测序，共筛选获得5929个DEGs，其中有3822个DEGs呈上调表达、2107个DEGs呈下调表达。经GO功能注释分析和KEGG信号通路富集分析，发现 5929个DEGs主要注释到与精子发生和精子运动等 有关的GO功能条目，且主要富集在与精子形成相关的经典信号通路上。综合DEGs的GO功能注释分析和KEGG信号通路富集分析结果，最终筛选出9个与藏公猪性成熟相关的基因，分别是BAX、DMRT1、FSHR、IGF1R、IZUMO1、 LYZL4、LYZL6、 SYCP3和TNP2。这9个候选基因在前人的相关研究中已有报道。LYZL4和LYZL6基因参与细胞壁大 分子分解代谢过程及细胞外空间通路，李忠邦和阎 萍（2019）研究发现LYZL4、LYZL6基因在牦牛睾丸/附睾中高表达，LYZL4基因在牦牛性成熟前存在于 间质细胞中，牦牛性成熟后则存在于精原细胞和支 持细胞中，有助于精子产生及其成熟过程；LYZL6基 因表达于睾丸和附睾中，对受精过程起重要作用。 本研究发现，在卵巢类固醇生成通路中FSHR和IGFIR基因在性成熟后个体睾丸组织中高表达。FSHR基因作用于精子的产生过程，且对性腺细胞有营养支持作用，可通过FSHR调节卵巢功能；IGFIR 基因是影响动物生长发育的主要候选基因，在免疫 调节及肌肉和骨骼发育生长过程中发挥重要作用 （Ding et al.，2022）。苏少锋等（2019）研究证实，IGFIR基因主要存在于睾丸间质细胞的细胞质中。龙亚丽等（2022）研究表明，FSHR基因主要表达于支 持细胞、间质细胞及各种生精细胞中，与曲细精管和 精子形成有密切关系。

TNP2基因在精子的形成过程中发挥重要作用。蔺蕙等（2021）研究表明，在性成熟牦牛睾丸组织中 的TNP2基因相对表达量明显高于其他发育阶段，且 在圆形精子细胞和长形精子细胞中的含量较高。Amjad等（2021）研究发现，TNP2基因新型单核苷酸多态性与男性不育相关，随着睾丸组织中TNP2基因 表达谱的增加，无精子症患者恢复生精的概率提高。BAX、SYCP3和TNP2基因在脱氧核糖核酸结合及精 子DNA缩合通路中高表达（Jebur et al.，2023）。BAX基因作为诱导凋亡因子，主要作用于线粒体膜，通过促进细胞色素释放，导致生精细胞凋亡；当BAX基因表达下降时，导致生精细胞大量存在而产生非BAX凋亡过程（Xi et al.，2017）。DMRT1基因与雄性性别 决定相关，参与雄性哺乳动物的性腺发育过程，当 DMRTI基因缺失时通过激活维甲酸信号通路，导致 干细胞向卵巢细胞分化，同时能调节精原细胞有丝 分裂及减数分裂（Zhang et al.，2016）。Li等（2018）研究表明，DMRTI基因在性成熟前后绵羊睾丸组织 中均有表达，且在性成熟后绵羊睾丸组织中的表达 水平极显著高于性成熟前。

精子与卵子融合是通过特定的膜蛋白配子相互 作用而完成，包括IZUMO1和受精介导蛋白（JUNO）等特定的膜蛋白。精子IZUMO基因依赖配子融合，会影响小鼠的雄性生育能力（Saito et al.，2019）。有研究证明，随着年龄的增长，IZUMO1基因表达量逐渐上调，且在性成熟前后差异显著（Kalwar et al.，2019b）。SYCP3是一种DNA结合蛋白，位于突触复 合物的侧向元件上，在同源染色体配对中发挥重要 作用，是精子发生减数分裂的必需蛋白（Wang et al.， 2011）。精子细胞更新与分化的动态过程发生在生 精小管内，分别受有丝分裂和减数分裂的调节。在 减数分裂过程中，基因重组是由突触复合物的组装 引起，而突触复合物涉及组成蛋白的参与，如SYCP3等。Kalwar等（2019a）研究表明，SYCP3基因在成熟牦牛睾丸组织中高表达，进一步证实SYCP3是精子 发生、诱导及同源重组的必需蛋白。上述研究结论 为今后深入开展藏猪繁殖育种能力相关研究提供了 重要的基础数据。

4结论

基于转录组测序从藏猪睾丸组织中筛选获得9个与性成熟相关的DEGs，即BAX、DMRTI、FSHR、 IGF1R、IZUMO1、LYZL4、LYZL6、SYCP3和TNP2，可 为作为研究藏猪繁殖育种能力的主要候选基因。

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（责任编辑

兰宗宝）