10个抗稻瘟病基因在黄淮稻区粳稻品种(系)中的分布

摘 "要：利用Pi5、Pii、Pib、Pita、Pita2、Pish、Pi54、Pia、Pizt、Pikm 10个抗瘟基因的分子标记，对94份黄淮稻区粳稻品种（系）进行了分子检测。结果表明，10个基因在供试品种中的分布频率分别为15.96%、15.96%、87.23%、37.23%、73.40%、85.11%、59.57%、32.98%、29.79%、37.23%。在供试品种中，检测出5个抗瘟基因的品种最多，占供试品种总数的35.1%；检测出4、6、2、3、7、8、1个抗瘟基因的品种分别有23、19、6、6、4、2、1个。本研究初步明确了10个抗瘟基因在94份黄淮稻区水稻品种（系）的分布情况，为抗稻瘟病辅助育种提供了参考依据。

关键词：黄淮稻区；抗稻瘟病基因；分子标记；HRM

中图分类号：S511.2+2 " " " " " " " " " " " " " 文献标志码：A文章编号：1673-6737（2024）04-0001-09

Distribution of 10 Blast Resistant Genes in Japonica Varieties（Lines） of Huang-huai Region

CHEN Feng1 ， FANG Wen-wen1 ， LIU Wei2 ， Wang Sha-sha3 ， WANG Hai-feng1 ， XU Jian-di1 ，

ZHU Wen-yin1 ， JIANG Ming-song1 ， ZHANG Hua4 ， ZHANG Shi-yong1*

（1 Institute of Wetland Agriculture and Ecology， Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan 250100， China;

2 Linyi Jinqiudaliang Agricultural Technology Co.， Ltd.， Linyi Shandong 276000， China;

3 Dongying Yibang Agricultural Technology Development Co.， Ltd.， Dongying，257000，China;

4 Tancheng Jinghua Seed Industry Co.， Ltd.， Tancheng Shandong 276100， China）

Abstract： Molecular detection was conducted on 94 japonica rice varieties（lines） from the Huanghuai region using molecular markers of 10 blast resistance genes， including Pi5， Pii， Pib， Pita， Pita2， Pish， Pi54， Pia， Piztand Pikm. The results showed that the distribution frequencies of 10 genes in the tested varieties were 15.96%， 15.96%， 87.23%， 37.23%， 73.40%， 85.11%， 59.57%， 32.98%， 29.79% and 37.23% respectively. Among the tested varieties， the variety with the highest detection of 5 blast resistance genes accounted for 35.1% of the total number of tested varieties; There are 23， 19， 6， 6， 4， 2， 3， 7， 8， and 1 varieties with blast resistance genes detected， respectively. This study preliminarily identified the distribution of 10 blast resistant genes in 94 rice varieties（lines） from the Huanghuai region， providing a reference basis for blast resistant assisted breeding.

Key words： Huanghuai district; Resistance genes to rice blast disease; Molecular markers; HRM

水稻是我国重要的粮食作物，近一半的人口以稻米为主食。稻瘟病是水稻生产上主要病害，严重影响水稻产量和品质[1]。利用广谱抗稻瘟病基因培育抗病品种，具有重要意义[2]。20世纪60年代中期，日本率先开展了抗稻瘟病基因研究工作，鉴定了最初的8个抗性位点上的14个基因，并建立了一套抗稻瘟病基因分析用的鉴别体系[3]。截至2019年，已报道了100余个抗稻瘟病基因位点，这些基因成簇地分布于除第3染色体外的所有水稻染色体上，其中，Pb1，Pia，Pib等37个基因已被成功克隆[4]。

Pi5定位于第9染色体上S04G03和C1454之间的170kb区间内，原始抗性供体为RIL260[5]。Pib，来自品种“BL1”，位于2号染色体长臂近末端区域，与RFLP标记RZ123、C379和C2782B等连锁，属于“NBS-LRR”类抗病基因[6]。Pi-ta基因位于第12染色体靠近着丝点附近的区域，定位于BAC克隆BAC142E8[7]。Pi-ta2是Pi-ta的等位基因，且抗谱比Pi-ta广[8]。Pish位于第1染色体，表现出叶瘟抗性[9]。Pi54位于水稻第11染色体，是一个NBS-LRR型的显性抗稻瘟病基因[10]。Pia位于第11染色体，由两个相邻的NBS-LRR基因构成[11]。Pizt位于第6染色体短臂，是一个具有广谱抗性的基因，该基因所在染色体区段包含多个对不同稻瘟病生理小种具有抗性的等位基因，如Pi9、Pi-z、Pi-2以及感病等位基因[12]。Pikm是稻瘟病抗性位点Pik上的一个主效抗病等位基因，定位于11号染色体上，由两个紧密连锁的具有独立功能NBS-LRR类基因（Pikm1-TS和Pikm2-TS）组成，对病菌具有较宽的抗谱[13]。Pi-i与Pi5位于第9染色体的同一位置，且抗谱一致，Pi-i介导的抗性需要乙烯合成过程中产生的氰化物的参与[14]。

杨林浩等利用Pi5、Pii、Pib等16个抗瘟基因特异性分子标记对68份吉林省主栽水稻品种进行了基因型鉴定[15]。房文文等利用Pita、Pita2、Pia等12个抗瘟基因的功能标记，对78个山东省地方水稻品种进行了分子检测[16]。黄淮稻区常年水稻种植面积约133.3万hm2，是我国重要的优质粳稻产区，抗瘟基因的鉴定是培育抗稻瘟病品种的基础性工作。本研究利用Pi5、Pii、Pib等10个抗瘟基因的功能标记，对94份黄淮稻区水稻品种（系）进行了分子检测，可为黄淮稻区抗稻瘟病分子标记辅助育种提供参考依据。

1 "材料与方法

1.1 "试验材料

山东省农业科学院湿地农业与生态研究所培育及从黄淮稻区引进品种（系）共94份，品种名称见表1。2022年种植于山东省农业科学院湿地所济宁试验基地，常规方法栽培。以丽江新团黑谷为感病对照。

1.2 "抗瘟基因分子标记

抗瘟基因分子标记来源于参考文献[15-16]，引物信息见表2。所用引物由深圳华大基因有限公司和生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 "DNA提取

剪取3段供试水稻品种的叶片于2 mL离心管中，采用CTAB法提取DNA[15]。

1.4 "PCR扩增

荧光PCR反应体系：10×Taqbuffer（含20 mmol/L Mg2+）1 μL，250 μmol/L dNTP 0.2 μL，0.5UTaqDNAPolymerase0.1 μL，20×Evagreen0.125 μL，10 ng/μL DNA模板3 μL，0.1 mmol/L正、反向引物各0.2 μL，用ddH2O定容至10 μL。荧光PCR扩增程序：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，40个循环。

普通PCR反应体系：2×ES Taq Master Mix（Dye） 7.5 μL，DNA 3.0 μL，正、反向引物各0.5 μL，3.5μL ddH2O。PCR反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，55～60℃退火30 s（根据梯度PCR结果选择最佳退火温度），72 ℃延伸0.5～1.5 min，32次循环；72 ℃延伸10 min。

1.5 "琼脂糖凝胶电泳检测

抗瘟基因Pi5、Pii、Pib、Pish、Pita2的扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，150V稳压电泳30 min，然后在凝胶成像系统中拍照。

1.6 "HRM检测

抗瘟基因Pita、Pia、Pi54、Pizt、Pikm的扩增产物经熔解曲线（HRM）检测。分析程序：95 ℃变性15 s；60 ℃退火15 s；以0.07 ℃/s的速率升温，10 reading/℃采集荧光信号，至90 ℃保持1 s，采用Light Cycler 96 software软件进行熔解曲线分析。

2 "结果与分析

2.1 "稻瘟病抗性基因的分子检测及在品种中的分布

利用Pi5、Pii、Pib、Pita、Pita2、Pish、Pi54、Pia、Pizt、Pikm的功能标记对94份黄淮稻区水稻品种（系）进行分子检测，结果见表3。济糯6号等15个品种含有Pi5和Pii，精华208等82个品种含有Pib，垦香稻010等35个品种含有Pita，垦香稻010等69个品种含有Pita2，精华208等80个品种含有Pish，垦香850等56个品种含有Pi54，垦香稻010等31个品种含有Pia，垦香850等28个品种含有Pizt，精华香糯等35个品种含有Pikm。部分基因分子标记的检测结果如图1～图6所示。

Pib在供试品种中的分布频率最高，达87.23%，其次是Pish、Pita2、Pi54、Pita、Pikm、Pia、Pizt，分布频率分别为85.11%、73.40%、59.57%、37.23%、37.23%、32.98%、29.79%，分布频率较低的是Pi5和Pii，均为15.96%（图7）。

2.2 "黄淮稻区粳稻品种中含有的抗稻瘟病基因的数量分析

由表3和图8可知，扬粳113检测出1个抗瘟基因Pib，占检测品种总数的1.06%。精华208等6个品种检测出2个抗瘟基因，占检测品种总数的6.38%。连粳20等6个品种检测出3个抗瘟基因。垦香850等23个品种检测出4个抗瘟基因，占检测品种总数的24.5%。垦香稻010等33个品种检测出5个抗瘟基因，占检测品种总数的35.1%。精华香糯等19个品种含有6个抗瘟基因，占检测品种总数的20.2%。圣1818等4个品种检测出7个抗瘟基因，占检测品种总数的4.26%。圣香柔108、原稻392两个品种检测出8个抗瘟基因，占检测品种总数的2.13%。

3 "讨论与结论

分子标记选择具有操作简便、用时短的优点，可进行高通量的抗病筛选，这对缩短抗病育种年限，减少工作量具有重要意义。利用抗性基因的特异性分子标记，可准确快速鉴定是否含有抗性基因，这为在品种选育时聚合不同抗性基因，培育广谱持久抗稻瘟病优良品种打下了良好基础。金国光等利用稻瘟病抗性基因Pi-9、Pi-km、Pi-ta、Pi-b、Pi-1和Pi-2等6个基因的分子标记技术对196份吉林省水稻材料进行检测[17]。王生轩等对2015年河南省沿黄粳稻品种筛选试验的21份水稻新品系进行Pi9、Pita和Piz-t 3个抗稻瘟病基因的分子鉴定[18]。房文文等利用Pita、Pizt和Pik2三个抗瘟基因功能标记，通过高分辨率熔解曲线方法对64份山东水稻品种及优异种质资源进行基因检测，分析了抗病基因的分布情况[19]。基因聚合是实现水稻稻瘟病广谱抗性的有效途径之一。吴云雨等通过构建粳稻背景下不同双基因聚合系，结果表明双基因聚合系PPLPigm / Pi1、PPLPigm / Pi54和PPLPigm / Pi33为长江下游粳稻的广谱抗性基因组合模式[20]。本研究检测了10个抗瘟基因在94个黄淮稻区水稻品种中的分布情况，为抗稻瘟病辅助育种提供了参考依据。对其他抗瘟基因的分布以及黄淮稻区粳稻的广谱抗性基因组合模式等问题还有待进一步研究。

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基金项目：山东省科技型中小企业创新能力提升工程（2023TSGC0432）；山东省重点研发计划（乡村振兴科技创新提振行动计划）项目（2022TZXD0040）；中央引导地方科技发展专项（YDZX2022088）；山东省农业良种工程（2021LZGC020，2023LZGCQY018）；山东省水稻产业技术体系（SDAIT-17-17）；山东省农业科学院农业科技创新工程（CXGC2024B01）。

收稿日期：2024-02-20

作者简介：陈峰（1979—），男，硕士，副研究员，主要从事水稻遗传育种研究。

*通讯作者：张士永（1968—），男，研究员，主要从事水稻育种研究。