DNA含量测定方法在生物制品安全控制中的应用

摘" 要：为避免宿主细胞残留DNA可能带来的致癌性、感染性与免疫原性等危害，有必要在生物制品生产过程中对DNA进行纯化去除与含量测定，保障生物制品的安全性和有效性。该文从残留DNA的危害性分析出发，介绍5种DNA含量测定方法在生物制品安全控制中的应用。

关键词：DNA含量测定；生物制品；安全控制；宿主细胞；残留DNA

中图分类号：R392-33" " "文献标志码：A" " " " " 文章编号：2095-2945（2023）14-0144-04

Abstract： In order to avoid carcinogenicity， infectivity and immunogenicity caused by residual DNA in host cells， it is necessary to purify and remove DNA and determine its content in the production process of biological products to ensure the safety and effectiveness of biological products. Based on the harmfulness analysis of residual DNA， this paper introduces the application of five determination methods of DNA content in the safety control of biological products.

Keywords： determination of DNA content; biological product; safety control; host cell; residual DNA

生物制品是利用基因工程、细胞工程、发酵工程等现代生物技术，以微生物、细胞、动物源生物组织等作为基础原料制成的生物活性制剂，一般常用于人类疾病预防、治疗和诊断，常见的生物制品包括疫苗、诊断抗原、类毒素、干扰素和诊断蛋白等。2019年12月至今，新型冠状病毒感染（COVID-19）已经剥夺了全球数百万人的生命，针对这种新冠感染研发的疫苗就属于一种特殊的生物制品，其可以帮助绝大部分人获得免疫力，有效降低发病、重症和死亡的风险，进而帮助社会逐步建立起免疫屏障，阻碍其流行传播。

现代生物科学技术的突飞猛进，使得越来越多的生物制品应用到人类疾病预防、治疗和诊断领域中来。为满足社会对生物制品安全性、有效性与可及性的需求，进一步推动现代生物科学技术的健康发展与应用，国内外监管机构不断出台相关法定技术标准加强对生物制品质量的控制力度，我国“四个最严”和飞行检查的常态化也有力推动了现代先进检测技术的应用。如今，越来越多标准化、便捷化、科学化的针对生物制品中宿主细胞残留DNA含量的测定方法得到应用，以满足对生物制品安全控制的要求，减少安全隐患。

1" 宿主细胞残留DNA的危害性

随着生物工程技术的发展和生物信息的全球化，大量的生物制品已采用细胞生产，我国疫苗的生产就常使用非洲绿猴肾细胞（Vero细胞）和中国仓鼠卵巢（CHO）细胞[1]作为宿主细胞。宿主细胞也叫作受体细胞，是指在转化或感染过程中接受外源基因的细胞，常用作受体细胞的有原核受体细胞（大肠杆菌等）、真核受体细胞（酵母菌等）和动物细胞等。

生物制品中的残留DNA片段或更长的分子主要来源于作为基础原料的宿主组织细胞[2]，因其来源的广泛性，随之而来的潜在风险也是多样的，主要风险可概括为致癌性、感染性、免疫原性等[3]。

1.1" 致癌性

宿主细胞残留DNA可携带显性致癌基因，像癌基因MYC或RAS等，这些显性致癌基因可能会导致生物制品具有致癌风险。宿主细胞残留DNA常见的致癌机制是显性致癌基因可直接把正常细胞转化为瘤性细胞，如含有Ｈ-ras基因和C-myc基因的12.5 ug质粒可在成年和新生幼鼠中引发肿瘤[4]。宿主细胞残留DNA的另外一种致癌机制可能是宿主细胞残留DNA的插入引发突变导致原癌基因被异常激活、抑癌基因则失去活性，2类基因在细胞生长、增殖调控中的平衡被异常打破，两者不再相互制约，正负调节信号失稳，最终引发正常细胞不断癌变、侵袭及转移形成癌症[5]。

1.2" 感染性

宿主细胞残留DNA的感染性归因于其可能携带传染性病毒基因组，如HIV病毒，这些病毒基因组无论是作为染色体外组分还是整合入人体基因组，或是逆转录病毒的前病毒[6]，都可能会扩增并催生传染性病毒粒子，增加宿主细胞残留DNA的感染性风险。因此，宿主细胞残留DNA的感染性风险可能比致癌性风险更高。Li等[7]通过体外定量测定逆转录病毒DNA的传染性研究得到：微量的逆转录病毒的前病毒DNA在体外就具有感染性；线状DNA具有很强的感染力，其感染力约为环状DNA的30至100倍。

1.3" 免疫原性

宿主细胞残留DNA也可能会引起免疫原性，这类残留在生物制品上的杂质能够激活模式识别受体，加速促炎性细胞因子的生成，使得抗原递呈细胞对抗原的处理和递呈动作更加剧烈，最终可能引起非特异性免疫反应：皮肤反应、过敏反应及血清学疾病等。人类机体对生物制品中宿主细胞残留DNA的免疫应答不可预知，由此产生的严重免疫反应甚至会危及生命。单克隆抗体TNG1412的第一阶段临床试验期间出现的临床前安全性测试未预测到的危及生命的“细胞因子风暴”表明某些生物制品（如某些特殊生物治疗剂）可能会对哺乳动物产生不可预料的严重伤害[8]。除此之外，人们还常见到一些高剂量的核酸样品（DNA疫苗或CpG寡脱氧核苷酸）诱发产生不良免疫反应或产生DNA抗体的临床研究报道[9]。

2" DNA含量测定方法在生物制品安全控制中的应用

DNA残留量是生物制品常规的质量检测指标，2020版《《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）》规定DNA残留量不得超过每剂10 ng[10]，进行DNA含量的检测是十分必要的。DNA含量的测定方法多种多样，并不存在普遍适用性的最佳方法，2020版《中国药典》收录的3种DNA含量检测方法为我国生物制品的安全控制提供了应用指导。

2.1" 荧光染色法

荧光染色法的原理就是高灵敏度的双链DNA荧光染料（通常为PicoGreen）可与双链DNA特异结合形成可在波长480 nm激发下产生荧光信号的复合物，在DNA含量处于一定的范围内且荧光染料过量的情况下，荧光信号的强度与DNA的浓度成正比，进而可以利用荧光酶标仪在波长520 nm处进行检测，根据检测出来的荧光信号强度数值，可计算得出样品中的DNA含量[11-12]。

荧光染色法具有操作简单、准确性高且成本低的优点，但该方法的特异性不强，灵敏度也不高。除此之外，盐类物质（氯化钠、醋酸钠等）或蛋白类物质（白蛋白等）都会对荧光染色法的测定准确性造成干扰，该方法不适用于大剂量蛋白样品（如单克隆抗体）的检测，多用于含小剂量蛋白（如疫苗、γ-环糊精）的生物制品中DNA含量的测定[13-14]。

2.2" 定量PCR法

定量PCR法是在PCR反应体系内加入荧光基团，参照已知浓度的核酸标准曲线，通过监测分析反应过程中的荧光信号做到对核酸的定量测定[15]。实时定量PCR技术利用荧光染料或探针保证了PCR扩增的特异性，荧光信号数值的大小与特异性扩增产物的量成正比，得以真正做到定量检测[16]。常用的荧光基团有TapMan荧光探针和荧光染料SYBR Green，两者的主要区别见表1。

综合来看，定量PCR法具有操作简便、灵敏度高、特异性强和重复性好等优点，而且所受的人为干扰因素较少，是一种在生物制品安全控制中极具可靠性的检测手段。例如，生物制药行业常利用定量PCR法测定门冬氨酸鸟氨酸（一种抗炎保肝药物）中毕赤酵母菌残留DNA的含量，以此来把控毕赤酵母菌潜在的致癌风险。

2.3" DNA探针杂交法

DNA探针杂交法的原理是样品中的外源性DNA经变性为单链后吸附于固相膜上（一般为硝酸纤维素膜或NC膜），并在严格条件下与特异性标记的单链DNA复性杂交形成双链DNA，且在固相膜上呈现为可测斑点，通过显示系统检测与计算得到样品中DNA的残留量[17]。

DNA探针杂交法的特异性与灵敏度都比较好，常常被用于人用狂犬病疫苗（Vero细胞）原液样品中宿主细胞残留DNA的检测。但该方法的实验周期偏长且操作程序烦琐，容易出现假阳性或假阴性的错误结果，故所需检测样本量较大，且只能实现半定量[18]。同时，该测定方法容易受多种因素干扰，对基因组DNA的提取、纯化及探针等均有较高要求。

2.4" 紫外分光光度法

紫外分光光度法是基于朗伯-比尔定律，利用吸光物质对某一波长光的吸收强度与该物质的浓度成正比进而对DNA含量进行定量分析[19]。利用DNA分子中存在的共轭双键在波长260 nm处具有最大紫外吸收的特性，可通过测定样品DNA在此波长处的吸光度值进行核酸定量分析[20]。随着微量分光光度计的广泛推广和应用，利用微量样本对DNA含量进行定量成为了生物分子、生命科学和临床检验等核酸相关研究实验室最常使用的方法[21]。

紫外分光光度法简便快捷，在药物分析、食品安全等领域起着重要作用。对于高纯度的样品，紫外分光光度法可以准确地测定其DNA含量。但是此法测定核酸浓度易受到其他具有紫外吸收特性物质的干扰，如蛋白质、多糖，提取试剂中苯酚、丙酮等物质，因此样品基质中存在这些物质将会影响紫外分光光度法的准确度。

2.5" 定磷法

利用电感耦合等离子体技术（一种元素分析方法）对质荷比不同的元素进行分离，可依据元素的含量与质谱峰的面积成正比这一特性对磷含量进行定量分析。测定核酸含磷量需要采用酸消解、微波消解等方法对核酸样品进行处理。利用已知浓度的磷标准物质建立标准曲线，从而对磷进行定量，依据磷含量来计算标准物质的浓度[22]。

基于磷元素分析的核酸定量方法已被用于多种有证标准物质的定值，其相对不确定度均低于10%。但是，此法对试剂纯度要求较高 （分析纯以上），样品消解处理是定量的关键，前处理较为复杂，样品消解程度将对定量结果直接产生影响。

3" 结束语

近些年，新冠疫苗、新冠口服药等生物医学制品作为抗击疫情的急先锋走进大众视野，让人们切身体会到生物制品是与人类生命健康息息相关的，其可以在多个领域让人类社会享受到生物科技发展带来的红利。

“是药三分毒”，生物制品中宿主细胞残留DNA存在致癌性、感染性与免疫原性等风险，需要国家相关部门与生产厂家共同努力，严把质量关。合理利用科学、精确的方法对宿主细胞残留DNA含量进行测定，高标准全流程做好生物制品的研发生产与安全控制工作，才能满足社会对生物制品安全性、有效性的需求，进一步推动现代生物科学技术的发展与应用。

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