基于非线性光声的组织热凝固评估技术

摘" 要：组织的光吸收和通过组织的光通量差异显著影响了当前基于光吸收原理的光声技术对组织热凝固评估的准确性。该研究基于格鲁内森参数的温度依赖性，提出一种消除组织光吸收系数、光通量影响的热凝固评估光声技术。该方法首先通过水浴快速加热组织至41 ℃，采集不同温度对应的光声信号，基于格鲁内森参数与温度存在的线性关系得到光声信号振幅随组织温度变化的斜率常数。然后利用初始温度对应的光声信号对斜率归一化，即得到一个仅取决于温度依赖性的参数。由于含水量是影响信号温度依赖性的主要因素，而热凝固过程中的组织脱水会导致信号的温度依赖性减弱，因此，可根据归一化斜率减小量来进行组织状态评估。该文采用2种肌肉组织研究温升范围和初始温度对归一化斜率的影响，多次重复试验的结果显示当初始温度小于38 ℃时，可根据归一化斜率将正常与热凝固后的肌肉组织完全区分开，热凝固后组织的归一化斜率相较于正常组织下降了52.81%～63.47%。试验结果表明所提出的技术具有无损评估组织热凝固的潜力。

关键词：光声成像；非线性光声；格鲁内森参数；组织热凝固；归一化斜率

中图分类号：U17" " " 文献标志码：A" " " " " 文章编号：2095-2945（2023）19-0001-08

Abstract： The differences in the distribution of light absorption and the light fluence in tissue significantly affect the accuracy of the current light absorption-based photoacoustic techniques for the evaluation of tissue thermal coagulation. In this study， based on the temperature dependence of the Grüneisen parameter， we proposed a thermal coagulation evaluation photoacoustictechnique that eliminates the influence of the inhomogeneous distribution of tissue light absorption coefficient and light fluence. Firstly， the tissue is rapidly heated to 41 °C by a water bath， the photoacoustic signals corresponding to different temperatures are acquired， and the slope constant of the photoacoustic signal amplitude with the temperature of the tissue is obtained based on the linear relationship between Grüneisen parameter and temperature. The photoacoustic signal corresponding to the initial temperature is then used to normalize the slope， then a parameter determined only by its temperature dependence is obtained. Since the water content is the main factor affecting the temperature dependence of the signal， tissue dehydration due to the thermal coagulation will weaken the signal's temperature dependence， therefore， the tissue status can be characterized according to the reduction of the normalized slope. In this paper， two kinds of muscle tissues were used to investigate the influence of the ranges of temperature rise and the initial temperature on the normalized slope. The results of the repeated experiments showed that as the initial temperature was less than 38 ℃， the normal and coagulated muscle tissues could be completely distinguished according to the normalized slope. The normalized slope of the coagulated tissue decreased by 52.81%～63.47% compared to that of the normal tissue. The experimental results indicate the potential of the proposed technique for the non-invasive evaluation of tissue thermal coagulation.

Keywords： photoacoustic imaging; nonlinear photoacoustic; grüneisen parameter; thermal coagulation of tissue; normalized slope

近年来由于热疗可以用微、无创的方式对空间靶组织进行原位治疗，具有术后感染率低、手术恢复期短、副作用小及安全性高等优势，在治疗良恶性肿瘤和皮肤美容等方面受到了临床医生的广泛关注[1-2]。例如：高强度聚焦超声消融[3-4]，激光热疗[5-7]，射频/微波消融等[8-9]。因为这些热疗方式大多都是通过对组织进行热消融的方式实现疾病治疗，所以只有实现对组织热凝固状态的准确评估，才能真正发挥热疗作为一种微、无创治疗手段的最大潜力。目前已经有磁共振成像（Magnetic Resonance Imaging，MRI）、超声成像（Ultrasound Imaging，US）、光声成像（Photoacoustic Imaging，PAI），以及光学成像如相干断层成像（Optical Coherence Tomography，OCT）、光谱法等多种模态应用到了组织热凝固的评估应用中。虽然这些技术各有优势，但是也存在一定的局限性。例如，MRI虽然具有高分辨率和对比度的优点，但是成本高和便携性差制约了其在热疗应用中的普及[10-11]；虽然US可以实时成像，但是对热凝固组织的成像对比度低，且热疗过程中产生的空化泡会对热凝固区域的判断产生严重干扰[12]；传统光学成像方法具有微米级的分辨率、高灵敏度和高对比度，但是成像深度受到光学散射极限的限制，成像深度仅限于皮下几毫米[13-14]。PAI结合了光学成像的高对比度和超声成像在深度成像中良好的空间分辨率的优势，同时凭借较低的价格、非侵入、无损实时成像能力，有望成为一种在热疗中评估组织热凝固状态的理想工具[15]。

已有多项研究探究了光声在光热治疗、射频/微波消融、高强度聚焦超声消融应用中评估热凝固的潜力[16]。其中一类方法是基于光声测温原理来间接表征组织的热凝固状态，此类方法利用光声信号幅值（格鲁内森参数）与组织温度的线性关系来估计组织的温度[17]，进而根据温度来评估组织状态。首先，光声测温的准确性依赖于对被测组织光热参数先验信息的准确估计[18]；其次，仅根据温度信息并不能决定组织是否发生热凝固，热凝固还与加热维持的时间有关，有研究表明用热剂量评估组织热凝固比温度更加准确[19]。另一类方法是基于热凝固后组织光吸收系数的变化来评估组织状态[20]。然而，在生物组织中，光声信号幅值对光吸收系数和光通量极其敏感，同时还与格鲁内森参数密切相关[21]。首先，为克服光通量随着样品的位置、光学特性改变而改变带来的影响，基于光吸收的方法都需要对光通量进行精确测量[22]；其次，该方法需要消除光声信号幅值随温度变化带来的影响[13]；最后，在大多数离体组织的研究中组织热凝固以后光声信号会大幅增加，这与热凝固后组织的光吸收和光散射系数增大有关[23]。然而，在活体研究考虑了血流灌注的影响以后，光声信号反而由于组织热凝固失血而大幅减小[24]。综上，在组织热凝固后，光吸收的变化规律较为复杂，基于光吸收的方法无法根据光声信号单纯地增大或者减小来区分组织状态。

针对以上问题，本文提出一种基于单波长非线性光声的组织热凝固评估技术，在公式中利用在初始温度的光声信号消除光吸收和光通量两项，得到只取决于温度依赖性的归一化斜率，实现在没有光吸收和光通量的影响下评估组织的热凝固状态。本文通过肌肉试验验证了该方法在原理上的可行性，探究了温升范围和初始温度对归一化斜率的影响，旨在为组织热凝固评估提供一种全新的对比度。

1" 材料与方法

1.1" 原理与方法

在光声效应中，通过短脉冲激光引起组织内部温度的变化，发生热弹性膨胀并产生通过介质传播的压力波。因为组织受到激光脉冲的作用时间短，能量低，所以脉冲激光所带来的热量扩散以及体积胀缩可以忽略不计，假设组织是一个光吸收均匀的物质，那么激光照射的生物组织中产生的声压与温度的关系可以表示为[21]

其中：P表示组织声压；T表示组织温度；Γ（T）表示组织格鲁内森参数，是一个与温度T相关的函数；F（Φ）表示组织表面的激光通量；μa表示组织的光吸收系数。格鲁内森参数可以由组织的热膨胀系数β，声速cs，恒压比热容cp表示为

为确保提出方法的安全性，如图1（a）所示，本研究利用水浴通过热传导的方式将组织温度升高到41 ℃即停止加热，其间实时采集光声信号（图1（b））。然后立刻利用水循环系统将组织温度冷却到37 ℃以下，人体体表温度通常在34～37 ℃，因此本研究涉及的温度范围是34～41 ℃；其中大于40 ℃的维持时间不超过15 min，远低于常规热疗使用的43 ℃温度和持续时间（gt;60 min）[25-26]。在该温度范围内，cs略有下降[27]，cp基本不变[28]，因此可以忽略掉这两者的影响，故格鲁内森参数随温度的变化率主要受热膨胀系数的影响，在此温度范围内可将公式（2）表示为

此外，在光声测温技术的研究中[29]发现在10～55 ℃的温度范围内， 格鲁内森参数与温度成线性关系，由公式（1）和公式（3）可知P和β（T）与T也呈线性关系（图1（c）），即

式中：a，b均为常量，a表征了热膨胀系数对温度的依赖性，a越大表示热膨胀系数随温度的变化越剧烈。b与热膨胀系数的绝对值大小相关。

假设组织升温前的初始温度为T1，则此时声压可以表示为

则利用初始温度处的光声压P（T1）对公式（1）进行归一化，并代入公式（2）、（3）、（4）可得（图1（d））

公式（6）的归一化斜率k已经消除了组织的光吸收和光通量的影响

式中：β（T1）是初始温度T1处的热膨胀系数，由公式（4）可知，归一化斜率k初始温度及热膨胀系数对温度的依赖性有关。

由文献[30]可知，组织含水量是影响β（T）温度依赖性的主要因素，组织含水量越高，归一化斜率k越大。本研究提出的方法涉及的34～41 ℃温度范围内，组织发生热凝固前的含水量保持不变，当初始温度T1确定时，组织发生热凝固前的归一化斜率k是一个恒定值knative（T1）。当组织发生热凝固后，组织脱水后会使k减小到kcoagulation。同样地，在34～41 ℃温度范围内，脱水后的组织含水量也不会发生变化，因此，当确定初始温度T1以后，kcoagulation（T1）也是一个恒定值。

1.2" 样品制备

本研究选择了2种肌肉组织：牛心和牛肉进行验证性试验。为避免组织在水浴中吸收水分导致含水量的不可控变化对试验结果带来的影响，将新鲜或者热凝固后的组织样本切割成1.5 cm×1.5 cm×1.5 cm的立方体大小，嵌入大小为4 cm×4 cm×4 cm，浓度为1.5%的中空琼脂仿体中（琼脂作为生物组织固定物），最后用琼脂密封仿体上表面。

1.3" 试验系统

试验装置如图2所示，使用可调谐光参量振荡（Optical Parametric Oscillators，OPO）激光器（NSOPO-L532HF-200，中科思远，中国，重复频率：100 Hz，脉宽：5 ns）作为激励源，试验输出激光波长为720 nm。输出激光被耦合到一个定制高能光纤束（CeramOptec，德国）中并用3D打印支架固定后照射在试验组织上，激光能量计测得组织表面的激光能量为4.5 mJ/cm2，远小于美国国家标准（American National Standards，ANSI）规定的激光安全标准[31]。数字延迟脉冲发生器（DG538，中科思远，中国）用于同步激光器和数据采集，触发频率被设置为100 Hz。光声信号被一个圆形非聚焦超声换能器（奥索电子科技，中国，中心频率：1 MHz，带宽：0.39～1.61 MHz，晶圆直径：8 mm）接收，首先经过自制的低噪放大器（放大倍数：40 dB，带宽：0.05～15 MHz）进行放大，再由示波器（Picoscope5000D，Pico科技，英国，采样率：62.5 MHz）采集后实时存储到计算机中。试验组织被放置在充满脱气去离子水的有机玻璃水缸中央的支架上，外接一个控温水池循环水进行组织加热，使组织温度在34～41 ℃范围内均匀升温。使用2个测量精度为0.01 ℃的K型热电偶探针连接到多通道温度测量仪（TP00-16Q，铂电科技，中国，重复频率：10 Hz），一个从包埋试验组织的仿体下表面插入组织，并使热电偶热结节处于接收换能器声轴下方；另一个放置在水缸中用于监测水温，保证水缸中脱气去离子水温度分布均匀。校准多通道温度测量仪系统时钟与计算机系统时钟，以便于将光声信号和温度数据进行同步。

仿体温度提升范围设置为34～41 ℃（该温度下组织性质不变），每隔0.25 ℃采集一组该温度下的光声信号。为避免随机噪声干扰，在每一个温度记录点共采集100次光声信号取平均值作为该温度点的光声信号，每2个信号点的间隔时间为0.01 s。为了更好地探索光声信号与温度之间的关系，水浴加热的升温速率为15 min/℃以保持仿体温度分布的均匀性，因此，光声信号取平均过程中采集的每个光声信号可视为在同一温度值下所采集的。

2" 结果与分析

2.1" 试验验证基于非线性光声评估组织热凝固的原理

为了验证热凝固前后的不同组织格鲁内森参数具有不同温度依赖性，本试验在720 nm波长下，采用温度可控的水浴法精确调整样品温度，对热凝固前后的牛心和牛肉组织进行了试验。

在34～41 ℃温度变化范围内，采集了牛心组织和牛肉组织热凝固前后的光声信号并在每个温度点进行了平均处理，最后在34 ℃的位置对光声信号幅值进行归一化，并在整个试验温度范围内用线性函数进行了最小二乘拟合。其中图3（a）和图3（c）分别表示牛心和牛肉热凝固前后的仿体实物图，图3（b）和图3（d）分别表示不同状态下牛心、牛肉组织的光声信号峰峰值与温度关系。从图3（b）和图3（d）中可以看出，不同状态（性质）下组织的光声信号峰峰值与温度呈线性相关，R2均大于0.9。根据图3（b）牛心组织的试验结果表明，虽然热凝固前后组织的光声信号峰峰值均随温度的升高而增加，但是热凝固前的新鲜牛心组织斜率明显大于热凝固后的牛心组织，新鲜牛心组织的归一化斜率为0.057 09，而将这块组织热凝固后的归一化斜率为0.029 63，热凝固后的归一化斜率表现为热凝固前组织的51.9%，这是格鲁内森参数与温度关系体现出来组织状态特异性的结果。根据图3（d）牛肉组织的试验结果表示，热凝固前的新鲜牛肉组织斜率明显大于热凝固后的牛肉组织，新鲜的牛肉组织的归一化斜率为0.064 86，而将这块组织热凝固后的归一化斜率为0.033 04，热凝固后的归一化斜率表现为热凝固前组织的50.94%，与牛心组织的试验结果具有相似的规律性。试验结果表明，2种肌肉热凝固后比热凝固前的归一化斜率显著减小，归一化斜率的减小量有望用于区分热凝固前后的组织状态。

2.2" 温升范围对于组织状态评估准确性的影响

为了探究人体表初始温度一定温升范围对于组织状态评估准确性的影响，对36 ℃和37 ℃温度下的不同组织，分别用3 ℃和4 ℃两种升温进行了10组的重复性试验，如图4所示。

由图4（a）和图4（b）结果显示，在升温为3 ℃，初始温度为36 ℃和37 ℃时，正常与热凝固后的牛心和牛肉组织试验结果整体规律符合试验预期，即热凝固后的组织归一化斜率小于正常组织，结果表明，在升温为3 ℃，初始温度为37 ℃时，归一化斜率可以区分组织状态。由图4（c）和图4（d）结果显示，初始温度为36 ℃和37 ℃时，升温4 ℃能够区分出正常与热凝固后的牛心组织和牛肉组织。

2.3" 初始温度对于组织状态评估准确性的影响

为了验证上述试验规律的鲁棒性，探索初始温度的适用范围，本研究控制温度升高的截止温度为41 ℃且保持恒定，探究初始温度变化对正常与热凝固后组织归一化斜率的影响，对正常与热凝固后牛心和牛肉组织做了10组的重复性试验，如图5所示。

对于图5（a）所示的牛心组织而言，可以看出在截止温度为41 ℃时，当初始温度在37 ℃及以下时，即控制温度区间大于等于4 ℃，本方法能够有效区别正常与热凝固后的牛心组织。由于存在系统噪声，当初始温度从37 ℃逐渐增高时，用于计算的数据集越来越小，导致归一化斜率的抖动范围越来越大，正常与热凝固后组织的归一化斜率开始重合。从图中可以看到，当初始温度从34 ℃逐渐增加到40 ℃时，热凝固后组织的归一化斜率比正常组织分别降低了55.36%、53.34%、53.26%、58.21%、63.47%、52.81%及-41.71%。

对于图5（b）所示的牛肉组织而言，可以看出在截止温度为41 ℃时，当初始温度在38 ℃及以下时，即温度区间大于3 ℃，正常组织斜率大于热凝固后的组织，且在大于3 ℃区间范围内归一化斜率能够区分正常与热凝固后的组织。本方法在牛心和牛肉两种组织上呈现出相似的试验规律，即在34～37 ℃温度范围内，通过将组织升温至41 ℃，利用光声的非线性原理，将光声信号幅值与温度的归一化斜率作为一个评估指标能够有效且准确地评估组织是否发生热凝固。同样，当初始温度从34 ℃逐渐增加到40 ℃时，热凝固后的组织归一化斜率比正常组织分别降低了55.31%、55.35%、54.72%、54.76%、62.69%、61.92%及13.64%。

3" 讨论

已提出的光声评估组织热凝固状态的方法中，大多是基于光吸收的原理，但是组织热凝固前后的光吸收规律还未研究清楚，且光通量的校准一直是长期存在的问题[22]。针对以上问题，本文提出的基于格鲁内森参数的温度依赖性评估热凝固的方法，可获得一个只与组织热膨胀系数温度依赖性有关的参数：归一化斜率。热凝固前后的两种肌肉组织的研究表明，热凝固后组织的归一化斜率均出现了显著下降，与本文利用的组织热凝固脱水导致温度依赖性下降的原理相符[30]。因此，归一化斜率有望作为一种新的对比度用于热凝固的评估。

不同温升和初始温度的试验验证了本文采用的系统的温度适用范围，结果表明当温升截止温度为41 ℃，初始温度小于38 ℃（温升超过3 ℃）时，可根据归一化斜率将正常与热凝固后的组织状态完全区分开，根据热疗的相关文献[25-26]可知，温升到41 ℃对于人体是安全的，同时初始温度小于38 ℃也符合实际人体皮肤的温度范围。因此，本文提出的方法具有在临床应用的潜力。此外，试验结果显示肌肉组织发生热凝固后，归一化斜率相较于正常组织下降了52.81%～63.47%，这提示本文提出的方法在温升范围小于3 ℃时，若已知正常组织的归一化斜率，可根据归一化斜率的减小量来评估组织状态。

综上，本文通过多次重复试验验证了提出的基于非线性光声的组织热凝固评估技术原理具有可行性。该技术原理有望应用于非侵入性地评估激光治疗、聚焦超声治疗后是否产生热凝固组织，未来在临床上还可以扩展为组织含水量评估等更多组织状态评估。同时本文中采取的加热方式对浅表组织的成分评估的适用性更强，对于不同的应用需求可采用不同的加热方式，例如对更深层次的组织进行性质评估，可采取中强度聚焦超声等穿透更深的加热方式，将在今后的工作中进行进一步的研究。

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基金项目：国家自然科学基金青年科学基金项目（62201103，62101083）；重庆自然科学基金面上项目（cstc2021jcyj-msxmX0739，cstc2021jcyj-msxmX0104）；中国博士后科学基金（2020M683260）

第一作者简介：刘柯岑（1998-），女，硕士研究生。研究方向为光声测温。

*通信作者：单天琪（1990-），女，博士，副教授。研究主向为光声成像。