γ-谷氨酰转肽酶催化特性研究进展

廖剑洪，杨 娟，曾晓房，白卫东，梁景龙*

（1 仲恺农业工程学院 轻工食品学院 广东省岭南特色食品科学与技术重点实验室 广州510225 2 仲恺农业工程学院 轻工食品学院 农业农村部岭南特色食品绿色加工与智能制造重点实验室 广州 510225）

近年来，有研究称γ-谷氨酰肽属于厚味肽[1]。这种小肽既能增加食品的风味特征，也能增加化合物的溶解性、稳定性，在食品、医药领域有重要的应用价值。在食物中添加少量的厚味肽能增强或改善风味特征，如在食品体系中添加可增强基本味感的协调性、连续性和呈味强度[2]。此外，有报道称氨基酸经γ-谷氨酰化，水溶性优于原氨基酸，并且γ-谷氨酰肽比一般的短肽稳定性好[3]。

γ-谷氨酰转肽酶（γ-Glutamyltranspeptidase，GGT）广泛存在于各种生物体内，能特异性地催化γ-谷氨酰化合物中的γ-谷氨酰键断裂，并将γ-谷氨酰基团转移到氨基酸、短肽或水分子中[4]。GGT 催化反应具有特异性强，不消耗能量等优点，已有广泛的应用研究，如改善食品体系的口感（茶氨酸、γ-谷氨酰-苯丙氨酸等）或作为药物或药物前体（γ-D-谷氨酰-L-色氨酸、γ-谷氨酰-牛磺酸等）。

GGT 在合成多种食品和医药用γ-谷氨酰基化合物方面有广泛的应用前景。然而，在使用该酶的酶促合成应用方面受多种因素制约：有限的酶促反应速率、供体底物的水解和自身转肽化的副反应、酶的抗逆性以及稳定性等。细菌中有丰富的GGT 资源，本文综述其结构与功能的关系，蛋白质工程在改造GGT 性质方面的应用以及产物特点，旨在挖掘细菌GGT 的潜力，为未来研究提供参考。

1 GGT 的来源与同源性分析

目前，人们已经从许多微生物中分离得到GGT，包括大肠杆菌GGT（Escherichia coli GGT，EcGGT）、肺炎链球菌GGT（Streptococcus pneumoniae GGT，SpGGT）、枯草芽孢杆菌GGT（Bacillus subtilis GGT，BsGGT）、地衣芽孢杆菌GGT（Bacillus licheniformis，BlGGT）、解淀粉芽孢杆菌GGT（Bacillus amyloliquefaciens，BaGGT）、奇异变形杆菌GGT（Proteus mirabilis，PmGGT）、幽门螺杆菌GGT（Helicobacter pylori，HpGGT）等。对多种不同生物体产生的GGT 结构研究表明，它是结构不对称的一种由小亚基和大亚基组成的异二聚体酶。迄今已确定的GGT 酶在一级结构上表现出一定程度的同源性。几种芽孢杆菌的GGT 的小亚基氨基酸序列同源性超过80%[5]；解淀粉芽孢杆菌的小亚基与枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、幽门螺杆菌、铜绿假单胞菌的同源性为33%～78%之间，与相应的非微生物酶亚基（如牛、人和小鼠GGT）的同源性在25%～31%之间[6]。将几种微生物的GGT一级结构序列进行比对，可以看出有较高的相似性（图1）。

图1 几种微生物的GGT 序列对比Fig.1 Sequence alignment of several microbial GGTs

目前，已有许多研究通过蛋白质分子结晶技术深入理解了GGT 的空间结构。在空间构象上，微生物产生的GGT 通常由2 个大小不相等的亚基组成，大亚基的分子质量一般约为40 ku，小亚基一般约为20 ku。GGT 是一种酰胺键水解酶，小亚基的一侧被大亚基环绕。正确的空间折叠结构是GGT 具有酶活性的关键[7-8]。

2 GGT 的催化反应特性

2.1 GGT 的催化反应类型

γ-谷氨酰转肽酶催化分为2 步反应：第：1 步称为酰化，Thr-391 的活性氧原子攻击γ-谷氨酰基化合物的羰基碳原子，裂解γ-谷氨酰化合物如谷胱甘肽和谷氨酰胺中存在的γ-谷氨酰键，随后供体底物的γ-谷氨酰基部分与酶结合，形成γ-谷氨酰基-酶复合物；第2 步反应是脱酰胺化，受体底物接受中间体的γ-谷氨酰基部分，形成最终产物。Okada 等[9]对EcGGT 的晶体观察，表明第2 步反应可能是限制酶促反应速率的关键环节。

根据受体分子的不同可以将GGT 的催化反应分为3 种类型（图2）：1）当受体分子是水时，γ-谷氨酰化合物水解；2）当受体分子是氨基酸或者短肽时，形成新的γ-谷氨酰化合物；3）当受体分子与供体分子为同一物质时，称为自转肽反应。水解反应和转肽反应的最适pH 值不同，因此能通过调整反应体系的pH 值调控反应进行方向。目前已报道的GGT，酸性条件具有较高的水解反应活性，在碱性条件下（pH 8.0～11.0）催化转肽反应活力迅速攀升，同时水解反应被一定程度抑制。

图2 GGT 的催化反应类型（以谷氨酰胺为例）Fig.2 Catalytic reaction type of GGT（Taking glutamine as an example）

图3 GGT 三维结构Fig.3 Three-dimensional structure of GGT

2.2 GGT 的底物选择性

GGT 催化γ-谷氨酰键断裂，特异性强，可以根据不同底物条件合成特定的目的产物。自然界中的蛋白质肽键通常是在α-羧基和α-氨基之间形成的，而γ-谷氨酰肽的肽键是在γ-羧基上形成，这被认为是其具有厚味活性的关键，因为同样序列的α-谷氨酰肽没有呈现出厚味性质[10]。供体和受体底物选择性方面，L 型或D 型的γ-谷氨酰化合物都能作为供体分子参与酶促反应，而多数GGT 仅接受L-氨基酸作为供体底物，而不能以D-谷氨酸作为受体底物，目前仅发现少数的GGT同时能催化L 型和D 型氨基酸作为受体分子反应[11]。相比酸性氨基酸，碱性氨基酸是更适合的受体氨基酸，氨基酸的侧链长短似乎也是影响酶活性的因素[12-13]。

2.3 GGT 转肽反应条件的调控

由于GGT 催化反应的特点，反应体系的水解、转肽、自转肽反应并存不利于底物转化率和产物分离纯化。调控GGT 催化反应的方向，对其实际应用有重要意义。

在一般的酶促反应中，酶和底物量的是催化反应不可缺少的一员，影响着转化率，而GGT 的反应特点决定了其反应特性与此迥异。由于GGT同时具有底物水解和合成2 种反应，水解产物、转肽产物以及自转肽产物共存是GGT 催化反应的共同特征，并且与所使用的受体的性质无关。基于GGT 催化反应的特点，对EcGGT 的反应特点研究中表明，低浓度的酶不影响底物的转化率，而过高浓度的酶可能造成底物转化率的降低。另外，目前关于GGT 催化反应的报道[14]中，转肽反应和自转肽反应的产物主要在前期阶段生成，转肽产物浓度随时间延长而保持相对稳定，自转肽产物导致了复杂的产物体系，降低了底物的转化率。转肽产物的转化率被证实取决于供体与受体底物的浓度比例，而在反应过程中增加供体底物的浓度会促进自转肽反应的进行，而不是转肽反应。如表1 所示，GGT 催化不同反应其最佳的反应条件有着明显的差异。

表1 GGT 的催化的最佳条件Table 1 The optimal conditions for the catalysis of GGT

为了促进GGT 的转肽反应，利用大多数GGT对底物的选择性，使用D-谷氨酰化合物能够显著提高产物合成产量并降低γ-谷氨酰副产物。除此之外，基因工程手段被认为是一种控制GGT 催化反应的重要方式，对某些保守氨基酸的突变，可以使GGT 的转肽反应和水解反应的比值提高，是良好的控制产物合成的方式[6，15]。另外，根据GGT 的结构与功能特点，在BsGGT 中插入“盖-环”结构，水解反应被明显抑制[16]。

3 GGT 结构的功能特性

酶的空间构象是决定酶催化性质的关键。通过比对不同物种的GGT 的关键氨基酸和空间结构可以发现，不同来源的GGT 在活性中心区域的空间构象存在差异，进而对底物的结合和酶促反应产生重要的影响。

3.1 “盖-环”结构

EcGGT、HpGGT 等会携带一个由12～16 个残基组成的短序列，被称为“盖-环” 结构（“Lid-Loop”）[9]，而在BsGGT、BlGGT 和BaGGT 的空间结构上是不具有这种结构。这两类GGT 在催化性质方面呈现不同的特点。

“盖-环”结构有控制底物、产物进出活性中心的作用。哺乳动物和大肠杆菌等具有“盖环”结构的GGT 对底物分子有筛选作用，表现为限制分子质量较大的γ-谷氨酰化合物进入酶活性中心[25-26]。如：EcGGT 的“盖-环”结构（Pro438-Gly449）中的的芳香族残基酪氨酸（Try444）与保守残基Asn411形成氢键，限制水分子分子进入活性中心，并且具有调节底物进入活性中心的功能[9]。HpGGT 盖环的Tyr433 与Asn400 之间同样存在类似的氢键[27]。因此，“盖-环”结构被认为能抑制水分子参与的水解反应。相反，枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等GGT 能够结合长链的谷氨酰胺化合物[28]，尤其是利于聚合谷氨酰胺化合物的水解。Calvio 等[29]、Massone 等[16]的研究进一步佐证上述观点，将EcGGT 上对应的“盖-环”的基因序列通过基因工程技术插入到BsGGT 上，突变体GGT 获得 “盖环”结构后，优先催化小分子质量的底物分子，同时提升GGT 酶转肽活性。

此外，在“盖-环”中心位置的有一个重要的保守芳香残基保护酶结构，这种芳香族氨基酸在EcGGT-中是酪氨酸（Tyr444），而在哺乳动物中相对应的芳香族残基则是苯丙氨酸[9，27，30]，这种差异也被认为决定GGT 的活性大小[31]。

3.2 自催化加工结构

GGT 是N 末端亲核水解酶家族的一员，这种酶家族的特点是转录翻译产生的前体蛋白不具有酶活性，需要激活N 端的Ser 或者是Thr 进行自催化裂解后才能具有酶活性。这种机制被称为自催化成熟机制[32]。成熟的GGT 的大小亚基都是经过前体蛋白自催化处理后产生的二聚体。GGT 自催化加工涉及一个保守残基-苏氨酸，自催化处理后，新产生的C-末端和N-末端分别形成大的和小的亚基；这个保守的苏氨酸作为小的亚基中的第一个氨基酸残基，同时这个保守的残基还是酶促反应的关键活性位点[6]。成熟的GGT 和前体蛋白的整体结构相比，虽没有显著的变化，但是在活性位点附近有显著的变化，从而解除了对限制底物结合空间位阻，而赋予了GGT 酶活性。多个报道证明GGT 分子的自催化加工需要多个氨基酸残基共同参与，小亚基的上的保守残基苏氨酸对GGT 的自催化加工是重要的，但不是必须的[33-36]。

3.3 GGT 的底物结合位点

酶分子在一级结构的基础上经过盘绕折叠成特定的空间结构才能具有特定的催化功能，而酶的空间构象对底物结合的亲和能力影响着酶催化能力。在GGT 的催化反应中，底物分子根据提供的基团不同，GGT 底物结合区域可以划分为2 种：供体结合部位和受体结合部位。

供体结合位点和供体分子中的γ-谷氨酰氨基部分结合，而不同的受体分子的结合位点仍未完全表征清楚。Okada 等[9]利用蛋白质结晶技术捕获了EcGGT 与谷胱甘肽结合的酶中间体结构以及和谷氨酸结合的复合物结构，揭示了谷胱甘肽的γ-谷氨酰基部分的α-羧基和α-氨基位于酶催化口袋的底部，通过氢键和盐桥保持在关键的空间位置。GGT 中参与供体分子的结合氨基酸主要分布在小亚基中，大亚基中仅有一个保守的Arg参与。研究表明[6]BlGGT、EcGGT 和BsGGT 中参与供体结合的氨基酸组成仅有1～2 个氨基酸的区别，例如BlGGT 的Glu423、Glu442 和EcGGT 的N411、Q430[7-8]。对大亚基上的参与底物结合的保守残基Arg，在BlGGT 中，带正电荷的残基赖氨酸取代参与底物结合的Arg109 提高了转肽活性，而在同样的替换EcGGT 和BsGGT 中导致了酶活力的下降[37-39]。Gly-Gly 是多数GGT 良好的受体底物，PnGGT 的结构研究指出其结构口袋的芳香族氨基酸可能限制了Gly-Gly 作为γ-谷氨酰受体的活性[40]。Takao[40]证实了Trp385、Phe417 和Trp525的芳香族侧链参与了受体底物的识别，根据这些残基的生化特性，设计水解活性降低，转肽酶活性显著升高的突变酶。GGT 和底物结合催化机制的具体影响仍然需要进一步的研究阐明，以便筛选不同种类的酶和改造出更优质的酶。

4 GGT 的稳定性研究

大多数酶在催化反应中需要温和的条件反应以进行正常的催化活性。酶蛋白在催化反应中抵抗各种因素的影响（高酸、高温、高盐等）是保证其生物活力的关键。研究GGT 酶的稳定性对其基础理论研究有重要意义，对提高其反应和贮存稳定性，扩大酶的使用范围对实际应用是必不可少的。目前报道的微生物产生的GGT 最适合pH 值多为碱性范围（8.0～10.0），通常在pH＜5.0 的几乎检测不到酶活性，最适温度范围约为37～60 ℃，且对pH 值的稳定性高于对温度的稳定性。当温度超过60 ℃时，即使是短时间孵育（10 min），GGT 也会丧失90%的活性[5，13，41]。对于GGT 稳定性不足，突变改造是有效的提升方式。如彭清等[42]将不同的氨基酸取代BsGGT 的280 位Tyr，改善了pH 值耐受性问题。Hu 等[43]将BlGGT 结构和一种淀粉酶融合，虽提高了GGT 的热稳定性，但活性有所降低。耐盐性是GGT 的另一个突出特性，这使得其在酱油等加工行业中有重要的应用前景。目前已发现的多种GGT 在高浓度NaCl 存在和无NaCl 存在时都有活性，表明GGT 是耐盐的但不嗜盐，并在1～5 mol/L NaCl 溶液中表现出极高的稳定性[5，37，44-45]。

5 改造GGT 的研究

天然酶稳定性差、易失活、酶活力差等是限制酶应用的主要原因。随着酶工程技术的发展，进行定向进化、定点突变或者其它稳定化技术处理，脆弱的天然酶能成为符合工业生产要求的、更加稳定的变异酶，使得生物催化技术极大地拓宽了应用价值。目前对GGT 的酶学性质提升研究主要有克隆表达、定点突变、和固定化酶几方面。

近年来，诸多学者通过对基因工程技术，将GGT 的基因进行异源表达，以期获得高酶活性、稳定性的GGT。Lee 等[13]将解淀粉芽孢杆菌SMB469中的GGT 酶分别在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中表达，得到的重组GGT 酶活力分别提高了2 倍和22.5 倍。Yang 等[46]将短小芽孢杆菌ML413 的GGT重组到枯草芽孢杆菌168 中，提高了GGT 的产量和活性。Cho 等[44]把解淀粉芽孢杆菌S0904 的GGT 序列导入大肠杆菌中并表达，重组酶产量提高了56.6 倍。

定点突变是通过对蛋白质中的氨基酸定点突变改变密码子偏性以提高表达水平，改变蛋白质活性、稳定性，改变酶的特异性等。Lin 等[6]把地衣芽孢杆菌GGTAsn450 替换为Ala 和Asp，均提高了转肽活性，最高可达3.6 倍。Bindal 等[37]将地衣芽孢杆菌GGT 的109 位氨基酸Arg 突变为Lys，发现Lys 的取代后GGT 具有更高的转肽活性和催化效率。Li 等[47]将解淀粉芽孢杆菌GGT 结合口袋中Ser437 替换为Gly，改造后的酶茶氨酸产率从58%上升到83%。

固定化酶既能稳定酶结构，保持酶的活力；还便于酶和产物的分离。周治等[48]以镍螯合环氧载体作为载体将GGT 进行共价固定化，固定化的酶对温度和pH 值的稳定性有明显提高。韦敏等[49]针对GGT 的pH 值耐受性差问题，以硅烷化改性的介孔氧化钛晶须为载体对重组枯草芽胞杆菌GGT进行固定化，提高了酶的pH 值耐受性和热稳定性。Lin 等[50]把地衣芽孢杆菌的GGT 固定在氧化石墨烯纳米片上，固定化后可重复使用9 次，生物催化合成γ-L-谷氨酰苯丙氨酸和γ-L-谷氨酰亮氨酸的产率均在31%以上。Bruni 等[51]利用辛基乙氧基-琼脂糖固定了γ-谷氨酰转肽酶，开发一种用于合成γ-谷氨酰氨基酸的强效生物催化剂，在γ-谷氨酰甲硫氨酸合成反应中，反应6 d 后仍保持95%以上的活性，而反应6 个循环（18 d）后仍保持85%的活性。

6 总结与展望

γ-谷氨酰转肽酶是原核生物和真核生物中普遍存在的一种酶，具有很高的序列相似性和进化保守性，这有利于通过合成生物学手段实现物种间的基因交换与蛋白质工程设计。GGT 独特的水解和转肽的催化反应，根据其最适的pH 值不同，通过调节反应液的pH 值，可以选择性的利用这两种催化反应中的一种，因此在食品工业中引起广泛的重视，例如利用转肽活性合成γ-谷氨酰肽或利用水解活性在酱油发酵中产生谷氨酸。对于GGT 结构与功能的研究已得到深入的了解，结合酶工程等手段改造GGT 分子是提高其应用价值的是重要的手段。

虽然近年来GGT 的研究取得了显著的进展，但是与其它能够规模化生产的酶相比进展缓慢。GGT 生产成本相对较高、活性、稳定性等是阻碍其工业化应用的主要缺点之一。深入探索生物多样性，以鉴定高产菌株是未来最有希望的替代方案之一。基因重组技术和定点突变已被证明是蛋白质工程中不可估量的工具，应把更多的重点放在探索酶的生产技术上，提高GGT 的性能，以适应不同的工业需求。GGT 的结构分析，包括活性必须基团的鉴定和相互作用的阐明，将有助于建立不同来源的γ-谷氨酰转肽酶的结构与功能关系，尤其是GGT 涉及受体的结合残基仍然未完全明确。总的来说，现有研究水平尚停留在实验室研究阶段，为此需要通过筛选高酶活性、稳定性的酶来源，以及结合酶工程改造等策略，提高GGT 的γ-谷氨酰肽合成能力。