酱醪葡萄球菌的筛选及其对高盐稀态酱油发酵的影响

张 伟，王洁丽，林 琛，刘俊良，杨俊文，周 慧，2，周尚庭，蒋雪薇，2*

（1 长沙理工大学食品与生物工程学院 长沙410114 2 湖南省调味品发酵工程技术研究中心 长沙410600 3 加加食品集团股份有限公司 长沙 410600）

酱油是历史悠久且具备东方特色的传统调味品，也是典型规模化生物制造的食品，主要由大豆、小麦经微生物发酵酿造而成，具有咸鲜适口，醇香饱满的特殊风味[1-2]。酱油酿造是以微生物生命活动为基础的复杂生物化学反应过程，其中功能性微生物的相互协同作用决定了酱油的风味与品质[3]。2016 年起，我国规模化酱油企业针对酱油产线开展了大规模的自动化甚至智能化的建设，封闭式、连续化的高盐稀态发酵工艺取代了开放式、间歇化的晒露法和低盐固态工艺[4]。该工艺虽较好地防控了开放式工艺带来的有害微生物污染的风险，但也减少了环境中功能性微生物的自然接种[5]，使酱香风味形成缓慢，整体发酵周期较长，发酵盐分高，严重影响了优质、健康酱油的产出[6-7]。因此，要在上述工艺条件下获得风味上乘的酿造酱油，从酱醪中筛选发酵性能优良的功能性风味菌是提升酱油风味及品质的关键。

优质酱油的主体风味特征表现为酱香浓郁、酯香醇香丰满、滋味鲜美、酸感柔和且适口，其中酸感主要来源于酱油中以乳酸和乙酸为主的有机酸[8-9]，由产酸细菌代谢生成。耐盐葡萄球菌是盐渍发酵食品中常出现的产酸细菌，具有产酸、促进游离氨基酸积累及护色增香等能力[10-11]。在中国传统酸肉发酵中发现的腐生葡萄球菌（S.saprophyticus）和木糖葡萄球菌（S.xylosus）能产生蛋白酶水解肌原蛋白，有助于可溶性蛋白和游离氨基酸的积累[12]。香肠发酵中分离的肉葡萄球菌（S.carnosus）可产生适量的硝盐酸盐还原酶，使香肠拥有更好的色泽[13]。由此可见，葡萄球菌能直接影响发酵肉制品的风味及品质。酱油发酵中也存在葡萄球菌[14]，而其分离筛选、菌种性能及在酱油发酵中的作用却未见报告，亟待深入研究。本文从高盐稀态酱醪中以产酸为指标筛选发酵性能优良的葡萄球菌，并解析其对酱油的理化指标、有机酸及挥发性风味物质的影响，为酱醪葡萄球菌在酱油酿造中的应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

发酵15 d 的高盐稀态酱醪，取自湖南某酱油厂，4 ℃保藏。

溴甲酚紫（分析纯级），上海麦克林生化科技有限公司；草酸、乳酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸、富马酸（均为色谱纯级），国药集团化学试剂有限公司；硫酸锌、亚铁氰化钾（均为分析纯级），国药集团化学试剂有限公司；细菌基因组DNA 提取试剂盒，北京索莱宝科技有限公司；细菌16S rDNA PCR 试剂盒，上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.2 培养基

菌种分离培养基配方如下：牛肉膏10 g，蛋白胨10 g，酵母膏3 g，柠檬酸氢二铵2 g，葡萄糖40 g，乙酸钠5 g，磷酸氢二钾2 g，硫酸镁0.58 g，硫酸锰0.25 g，琼脂粉20 g，氯化钠80 g，溴甲酚紫2 g，吐温-80 1 mL，蒸馏水1 000 mL，pH 6.5～6.8。

MRS 培养基参考文献[15]配制。

1.3 仪器与设备

E200 显微成像系统，尼康映像仪器（中国）有限公司；VERITI 梯度PCR 扩增仪，美国应用生物有限公司；DYY-12 电泳仪，北京市六一仪器厂；Champ Gel 5000 Plus 凝胶成像系统，北京赛智创业科技有限公司；ZWY-2102C 恒温振荡培养箱，上海智城分析仪器制造有限公司；PE28 pH 计，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；Waters 2695型液相色谱仪，美国沃特世有限公司；Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 色谱柱，安捷伦科技（中国）有限公司；436GC/EVOQ TQ/PAL 气质联用仪，美国Bruker Daltonics 公司；DB-5MS 色谱柱，美国Agilent 公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS 固相微萃取针，美国Supelco 公司。

1.4 方法

1.4.1 酱醪葡萄球菌的分离 取发酵15 d 的高盐稀态酱醪，用生理盐水进行梯度稀释制成菌悬液，吸取0.1 mL 菌悬液涂布于菌种分离培养基上，37 ℃培养2～5 d，挑选菌落周围变黄色的菌落进行革兰氏染色和镜检，挑出革兰氏染色阳性的球菌，在高盐MRS 培养基（160 g/L NaCl）上多次分离纯化，获得纯种菌株。

1.4.2 酱醪葡萄球菌的筛选 将分离纯化后耐盐生长良好的菌株接种至含160 g/L NaCl 的MRS液体培养基中，37 ℃静置培养60 h，取5 mL 发酵液离心取上清测定pH 值，初步筛选出发酵液pH<4.5 的菌株。取初筛菌株的发酵液2 mL，利用0.22 μm 水系膜进行过滤，液相色谱分析其乳酸含量，筛选出产乳酸含量大于2 g/L 的菌株用于后续试验。液相色谱条件：流动相为0.1%磷酸水溶液-甲醇（19 ∶1，体积比），流速0.6 mL/min，进样量10 L，检测器为紫外检测器，检测波长为210 nm，柱温30 ℃。

1.4.3 酱醪葡萄球菌的鉴定

1.4.3.1 16S rDNA 序列分析 采用细菌基因组DNA 提取试剂盒提取耐盐葡萄球菌的模板DNA，并进行PCR；PCR 体系如下：葡萄球菌DNA 模板2 μL，细菌通用引物1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）和27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）各2 μL，Taq 聚合酶1 μL，dNTP 4 μL，MgCl2溶液3 μL，10×PCR Buffer 5 μL，ddH2O补齐至50 μL。PCR 条件：95 ℃预变性5 min；95℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循环30 次；72 ℃最终延伸10 min，4 ℃保存。PCR 扩增产物以1%的琼脂糖凝胶检测。测序由生工生物工程（上海）股份有限公司长沙分公司完成。测序结果在NCBI 库进行同源性比对，并通过MEGA X软件构建系统发育树。

1.4.3.2 生理生化特性 将筛选得到的菌株参照《常见细菌系统鉴定手册》[16]进行糖发酵以及精氨酸双水解酶试验。

1.4.4 菌种高盐稀态发酵 将成品曲与230 g/L的盐水按料液比1∶2 混合制成盐质量浓度为160 g/L 的高盐稀态发酵酱醪，28 ℃下进行为期60 d的发酵。将筛得的菌株制成107CFU/mL 的菌悬液，于发酵第15 天添加至高盐稀态发酵酱醪中，添加量为5%，以不添菌的酱醪为对照组。发酵结束后，利用300 目滤布压榨酱醪获得酱油。

1.4.5 酱油还原糖、氨态氮及总酸的测定 还原糖含量测定参照GB 5009.7-2016《食品安全国家标准 食品中的还原糖测定》[17]；总酸、氨态氮含量测定参照GB 5009.235-2016《食品中氨基酸态氮的测定》[18]。

1.4.6 酱油有机酸的测定 取2 mL 发酵液，5 mL 硫酸锌溶液（30 g/L），5 mL 亚铁氰化钾溶液（106g/L）混合定容至100 mL，静置30 min 后离心，取上清液用0.22 μm 水系膜过滤，液相色谱分析其6 种有机酸含量，液相色谱条件同1.4.2 节。

1.4.7 酱油挥发性风味物质测定 参考张伟等[19]的GC-MS 方法进行挥发性风味物质的定性和定量检测。

1.4.8 酱油感官评分 参考张伟等[19]关于酿造酱油感官评价的方法对发酵后的酱油进行感官评分。

1.5 数据处理

利用SPSS 26 软件进行方差分析和显著性分析（P<0.05）；利用Excel 2019 及Origin 2021 软件进行数据分析及可视化。

2 结果与分析

2.1 酱醪葡萄球菌的筛选

酱醪葡萄球菌是高盐稀态酱醪中可代谢糖类生成有机酸的一类产酸细菌，其代谢生成的有机酸可赋予酱油酸感，抑制酱醪发酵污染菌的生长，还可作为酱油酯类物质的前体物[20]，影响着酱油的风味和品质。获得葡萄球菌的纯培养菌株是其应用于高盐发酵食品的基础。对发酵前期的高盐稀态酱醪采样分离酱醪葡萄球菌，获得了34 株形态与葡萄球菌属相似的菌株，将其命名为JL04～JL37。利用高盐MRS 培养基（160 g/L NaCl）多次传代培养，获得了14 株耐盐生长稳定的菌株。

葡萄球菌能利用可发酵糖生成乳酸、乙酸、琥珀酸等有机酸[21]。有机酸解离出氢离子，致使发酵液pH 值降低，可以通过测定发酵液pH 值初步判断葡萄球菌的产酸能力。从图1a 可以看出，14 株菌发酵60 h 后发酵液pH 值降低至4.5 以下的菌株有7 株，其中pH 值最低的菌株为JL04，其发酵液pH<4.0；pH 在4.0～4.5 的菌株有6 株，分别为JL05、JL10、JL11、JL15、JL16、JL17。酱油发酵对氧的需求不高，产酸细菌在酱醪局部厌氧环境中易积累酸感柔和的乳酸，能使酱油口感更加爽朗、绵长，对酱油的风味有增益作用，因此，以乳酸积累能力为指标，对上述7 株菌进行复筛，获得3 株乳酸积累大于2 g/L 的菌株JL04、JL15、JL17 进入后续鉴定，其乳酸含量分别为2.04，2.02 g/L 和2.42 g/L（图1b）。

图1 酱醪葡萄球菌的筛选结果Fig.1 Screening results of Staphylococcus in moromi

2.2 菌种鉴定

3 株菌镜检为革兰氏阳性球菌，其菌体形态主要呈现葡萄串状聚集（图2a）。16S rDNA 序列系统发育树（图2b）显示3 株菌均属于葡萄球菌属。同时为了更加准确地判断3 株酱醪葡萄球菌的种属，以葡萄球菌属模式种金黄色葡萄球菌（S.aureus）为对照，选择特异性的生理生化试验进行补充鉴定，结果见表1。从表1 可以看出，JL04 只能利用果糖、半乳糖和甘露醇；JL15 和JL17 均可利用蔗糖、果糖、乳糖、半乳糖、海藻糖和甘露醇，但JL15 对半乳糖的利用较弱。参考《伯杰细菌鉴定手册》中葡萄球菌属的生理生化特性[22]，结合NCBI 比对结果最终鉴定JL04 为香料葡萄球菌（S.comdimenti）、JL15 为鱼发酵葡萄球菌（S.piscifermentans）、JL17 为肉葡萄球菌（S.carnosus）。

表1 3 株菌的生理生化特性Table 1 Biochemical properties of the three strains

图2 3 株菌的鉴定结果Fig.2 Identification results of the three strains

2.3 3 株酱醪葡萄球菌对酱油发酵的影响

2.3.1 3 株酱醪葡萄球菌对酱油理化指标的影响

酱油发酵过程中还原糖、氨态氮和总酸含量的变化反映了酱油基础风味的变化，是酿造酱油重要的质量指标[23]。酱油发酵前期米曲霉产生的淀粉酶活力较高，促使淀粉质原料快速水解，此时还原糖的积累速率大于酱醪微生物的消耗速率，使得酱油中还原糖的含量呈现先升高的趋势，较高的还原糖含量有利于酱醪微生物的生长和代谢，庄婉菁等[24]研究表明酱油酿造过程中还原糖含量在10～20 d 之间达到峰值，故选择在发酵15 d 的高盐稀态酱醪中分别添加3 株葡萄球菌进行为期60 d 的短周期发酵，考察3 株葡萄球菌在酱油发酵中的作用，以不加菌发酵的酱油为对照组，测定酱油发酵过程中理化指标，结果见图3。

图3 发酵过程中酱醪理化指标的变化Fig.3 Changes of physicochemical indicators during the moromi fermentation

由图3 可知，发酵0～15 d，由于还未添加葡萄球菌，4 个酱油样品的还原糖、总酸及氨态氮含量与对照组含量相近，变化趋势一致。在发酵第15天分别添加了3 株葡萄球菌后，15～30 d 内添加了3 株葡萄球菌发酵的酱油还原糖降低速率明显大于对照组，可见添加葡萄球菌发酵加速了酱油中还原糖的利用，同时其总酸积累速率也均大于对照组，说明葡萄球菌的添加有利于促进酱油中还原糖向有机酸转化；此外，酱油的氨态氮积累速率也明显高于对照组，这是由于葡萄球菌能分泌少量的蛋白酶可促进蛋白质原料水解，进而促进了酱油中氨态氮的积累，此时间段内添加JL17 发酵的酱油氨态氮积累速率最快，相比另外2 株葡萄球菌在促进酱油氨态氮积累上更具优势。发酵30～60 d 内，有机酸的持续积累使得酱醪pH 值逐渐降低，抑制了米曲霉产生的蛋白酶和淀粉酶的酶活性，使得还原糖的消耗速率大于产生速率，还原糖含量减少呈下降趋势，且总酸和氨态氮的积累速率也逐渐变缓。发酵60 d 结束时，添加了菌株JL04、JL15、JL17 发酵的酱油中还原糖含量虽与对照组无显著差异，但总酸和氨态氮的含量均高于对照组，其总酸含量分别为15.61，15.10，15.42 g/L，相比对照组提升了8.40%，4.86%，7.08%；氨态氮含量分别为9.12，9.02 g/L 及9.31 g/L，较对照组提升了1.90%，0.78%，4.02%，可见添加3 株葡萄球菌的添加发酵有助于提升酱油总酸及氨态氮的含量，进而有助于增进酱油酸感和鲜味。

2.3.2 3 株酱醪葡萄球菌对酱油主要有机酸的影响 酱油中主体有机酸的构成为乳酸和乙酸，还存在少量的琥珀酸、富马酸、柠檬酸等，除了赋予酱油爽口的酸感，还是酱油中乳酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸高级醇酯、乳酸高级醇酯等酯类物质的前体物，是酱油独特滋味与香气形成的重要组成成分，因此其含量是影响酱油风味及品质的重要因素[25]。为考察葡萄球菌对酱油重要有机酸的影响，利用高效液相色谱对酱油中的L-苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸和富马酸6 种常见的有机酸进行分析[26]，其结果见图4。由图4 可知，添加JL04、JL15、JL17 发酵的酱油中6 种有机酸的总含量分别为9.78，8.83 g/L 及8.96 g/L，相比对照组分别提升了37.53%，24.06%及25.90%。添加3 株菌发酵主要影响了酱油中乳酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸的含量。添加JL04 和JL15 发酵能显著提升酱油中乳酸、乙酸、琥珀酸含量。添加JL04 发酵的酱油中乳酸、乙酸和琥珀酸的含量分别比对照组提高了32.64%，44.70%和202.99%，而JL15 对乳酸、乙酸、琥珀酸的提升弱于JL04，相比对照组分别提高了22.28%，6.91%及191.04%。与JL04 和JL15相比，JL17 虽不能促进酱油中琥珀酸的积累，但能促进酱油中柠檬酸的积累，其添加发酵的酱油中柠檬酸含量较对组组提升了39.17%。综合而言，3株葡萄球菌均有促进酱油中有机酸积累的作用。

图4 酱油6 种有机酸含量热图Fig.4 Heat map of six organic acid content in soy sauce

2.3.3 3 株酱醪葡萄球菌对酱油挥发性风味物质的影响 为了解析酱醪葡萄球菌对酿造酱油香气的影响，利用GC-MS 分析3 组添菌发酵60 d 的酱油中挥发性风味物质的种类及含量，以未添菌酱油为对照组，结果见表2。所有酱油中共检测出53 种挥发性风味物质，3 株菌对酱油挥发性风味物质的种类和含量均有一定的提升作用，以酯类和醇类物质提升最为显著。

酯类物质是酱油中关键的主体香气物质。从表2 可以看出，添加JL04、JL15 及JL17 发酵的酱油中检出的酯类物质分别为15，16 种及14 种，较对照组分别增加了3，4 种及2 种，其酯类物质含量比对照组提升了116.09%，95.60%及111.03%，表明3 株菌的添加能促进酯类物质的生成，增加了酱油酯类风味物质的含量及丰富度。高盐稀态酱油中酯类风味物质的合成主要是微生物利用酱醪中的有机酸和醇类物质酯化作用的结果[27]，3株菌在高盐稀态发酵中良好的有机酸积累能力是促进酯类风味物质形成的重要因素。3 株菌代谢的有机酸主要为乙酸和乳酸，乳酸和乙酸含量的提升使得酱油中乙酸酯类和乳酸酯类物质均有明显提升，其中乙酸酯类物质为乙酸乙酯（水果香）和乙酸苯乙酯（花香）。乙酸乙酯的含量相比对照组分别增加了169.60%，64.12%及160.17%，而乙酸苯乙酯在对照组中未检出，可见葡萄球菌的加入促进了乙酸和苯乙醇的酯化，进而促进了乙酸苯乙酯的生成；检出的乳酸酯类物质为甜奶油香的乳酸乙酯和乳酸异丙酯，相比对照组均有一定的提升。可见添加葡萄球菌发酵的酱油中小分子酯类物质含量明显增加，有利于提升酱油的酯香，促进酱油形成花果香为特征的前香和主体香。此外，从添加3 株菌发酵的酱油中还检出了十一酸乙酯、十五酸乙酯等高级脂肪酸乙酯，这些物质并未在对照组中检出，表明葡萄球菌可能存在促进高级脂肪酸生成的能力，进而促进高级脂肪酸酯的形成。

添加3 株葡萄球菌的发酵酱油中检出的醇类物质种类分别为12，11 种和10 种，含量分别为2 126.84，2 011.91，1 988.20 μg/L，相比对照组在种类（10 种）和总含量（2 064.58 μg/L）上并无明显差异，而不同的醇类物质间存在显著差异。检出的醇类物质主要为乙醇和苯乙醇，其含量相比对照组有明显的减少，且与乙酸乙酯和乙酸苯乙酯的生成呈负相关关系，说明添加葡萄球菌发酵促进了乙酸与乙醇及苯乙醇的酯化。此外，异丁醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基丁醇、2，3-丁二醇、3-甲硫基丙醇相比对照组有明显增加，这些醇类具备果香、麦芽香等香气特性，弥补了乙醇和苯乙醇含量减少而损失的香气。添加3 株菌发酵的酱油虽在酮类物质种类上均无明显差异，但添加JL04 发酵的酱油酮类物质含量较对照组提升了5.18 倍，其主体的酮类物质为烟熏香的4-羟基-3-甲氧基苯乙酮（香草酮）和油脂香的3-庚酮。4 种发酵酱油中检出的挥发性酸类物质较少，含量最高的挥发性酸为乙酸，相比对照组虽有一定程度地提升，但检出的含量为微克每升级别，这是由于检测方式造成的差异，乙酸含量应以上述液相色谱定量为准。醛类、酚类及杂环类物质在添菌酱油中检出的种类和含量与对照无明显差异，表明3 株葡萄球菌对这几类挥发性物质的影响较小。

2.3.4 感官评分 为了进一步明确3 株葡萄球菌对酱油风味及品质的影响，对其添加发酵后的酱油进行感官评分，结果见图5。添加3 株菌发酵的酱油在香气和滋味较对照组均有明显提升，添加JL04 发酵的作用最明显，其发酵的酱油香气和滋味评分相比对照组分别提升了19.19%和26.92%，酱油的感官特征为酯香浓郁、酸鲜适口、口感清爽。4 组酱油在颜色和体态方面没有明显差异。感官评价的结果表明3 株葡萄球菌对酱油的香气、滋味及整体风味有着明显的增益效果。

图5 添加3 株葡萄球菌发酵酱油的感官评分Fig.5 Sensory evaluation of soy sauce added with the three Staphylococcus

3 结论

本研究从高盐稀态酱醪中筛选获得了3 株产酸性能优良葡萄球菌JL04（S.comdimenti）、JL15（S.piscifermentans）、JL17（S.carnosus）。将3 株葡萄球菌添加至高盐稀态酱醪中进行发酵研究，与未添加葡萄球菌对照组进行对比分析，发现添加葡萄球菌发酵可明显提高高盐稀态发酵酱油的氨态氮、总酸，对酱油的鲜味及酸感有良好的贡献；酱油中常见的6 种有机酸定量分析结果显示添加JL04、JL15、JL17 发酵的酱油中其总含量分别为9.78，8.83 g/L 及8.96 g/L，相比对照组分别提高了37.53%，24.06%及25.90%；含量增加的有机酸主要是乳酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸，其与酱油中乙醇、苯乙醇等醇类物质成酯，进而促进了酱油酯类风味物质的形成，其含量相比对照组分别提高了116.09%，95.60%及111.03%，其中乙酸酯类、乳酸酯类及琥珀酸酯类的提升较为明显，与相应的有机酸含量增加呈正相关；此外，感官评分的结果也显示3 株葡萄球菌对酱油的香气、滋味有明显的增益作用。综上，酱醪中筛选的3 株葡萄球菌可以通过增加酱油发酵中有机酸的积累而增加酯类等挥发性风味物质，具有作为风味菌在酱油酿造中应用的良好潜力。