检测新生儿溶血标本NSE校正公式的建立*

常珊碧 张保荣 沈洁 蒋曼丽 王跃帮

(宿迁市第一人民医院医学检验科,江苏 宿迁 223800)

新生儿缺氧缺血性脑病(Hypoxic ischemic encephalopathy,HIE)是指围生期各种原因导致的脑组织部分或完全缺氧、脑血流供应降低导致的新生儿大脑损伤。研究显示,尽管围生期诊疗技术明显提高,HIE仍是全球新生儿发病和死亡的重要原因之一[1-2]。神经元特异性烯醇化酶(Neuron-specific enolase,NSE)是HIE的敏感标志物,是一种酸性蛋白酶,也是糖酵解作用的关键胞内酶,炎症损伤细胞和肿瘤细胞由于增值周期加快,糖酵解作用增强,导致NSE大量释放入血液,使血清中此酶含量增高[3-6]。NSE特异性存在于神经元、神经组织来源的肿瘤组织以及神经内分泌细胞中[7-8],血清中NSE的浓度对新生儿缺氧缺血性脑病、嗜铬细胞瘤、神经母细胞瘤以及小细胞肺和急性淋巴细胞白血病等疾病的鉴别诊断、疗效评估和预后等方面具有重要意义[9-11]。在血小板和红细胞中有γ亚基的NSE同工酶,因此当标本溶血时,NSE同工酶释放到胞外与血清NSE出现部分交叉免疫反应,使检测结果偏高,影响报告的真实性和可靠性[12-13]。临床上新生儿采血极其困难,血清标本经常有不同程度的溶血,故本研究通过建立新生儿溶血校正公式,以探讨其诊断新生儿疾病的可行性。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2021年1—5月本院新生儿科出生的新生儿血清样本50例,其中男性28例、女性22例,时间<24 h。同时回顾性分析2021年1—5月出生的237例新生儿黄疸指数(Icterus)以及溶血指数(Haemolysis),患儿家属均同意并签署同意书,本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 仪器与试剂 佑科752N紫外可见分光光度计购自上海佑科仪器仪表有限公司;ROCHE E602全自动化学发光免疫分析仪及NSE配套原装试剂(批号:52370301)购自瑞士罗氏公司;Sysmex XN-9000全自动血液分析仪及配套试剂、SLS溶血剂(批号:A1004)购自日本Sysmex公司,T5D低温水平离心机购自上海卢湘仪公司;氰化高铁血红蛋白(cyanmethemoglobin , HiCN)标准液和文齐氏液均购自上海信帆生物科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 标准曲线的建立 采用佑科752N紫外可见分光光度计分别测定 50、100、150、200、250 g/L Hb标准液在540 nm处的吸光度值(用A表示),以吸光度为横坐标,Hb浓度为纵坐标,制作标准曲线。将5份新鲜的全血样本加到干燥洁净的试管内,轻轻摇匀后,用Eppendorf微量移液器吸取20 μL混合全血加到含有5 mL文齐氏液的试管中中,轻轻摇匀,5 min后测定OD值,通过标准可得到血红蛋白浓度。用0.9%生理盐水将混合全血分别稀释成Hb浓度为的20、10、5、2.5、1.25、0.625 g/L的样本。分别吸取100 μL上述样本加入到含有2.5 mL文齐氏液的试管中并摇匀,5 min测定540 nm处的吸光度值(A),以吸光度值为横坐标, Hb浓度为纵坐标,绘制血清Hb标准曲线。

1.3.2 血清NSE结果检测 选取当日检测的新生儿全血新鲜样本,3500 rpm离心10 min ,分离血清,用移液器吸取下层红细胞300 μL于冷冻管内,将冷冻管在-80 ℃冰箱内,放置20 min,取出室温平衡30 min至完全溶解,重复上述步骤5次。选取当日检测的含有分离胶的血样,用Eppendorf移液器吸取血清200 μL加入到干净的试管内,加入5 μL上述红细胞,充分混匀后3500 rpm离心10 min,分离血清,用于检测NSE浓度。

1.3.3 血清Hb浓度测定 用Eppendorf移液器分别吸取上述血清100 μL和文齐氏液2.5 mL至一洁净的试管内,轻轻摇匀,5 min 内测定540 nm处的吸光度(A)值,根据血清 Hb标准曲线计算出Hb浓度。

1.3.4 NSE检测方法的相关性 按照美国临床实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)的文件EP9-A2要求,对采用HiCN法和XN-9000全自动血液分析仪(仪器法)建立的校正公式,评价两者之间的相关性。

2 结果

2.1 一般结果 <24 h出生的新生儿血清TB浓度为(137.00±56.84) μmol/L,25.3%(60/237)血液样本均存在不同程度的溶血,溶血程度+/++/+++/++++分别占6.75/8.02/8.44/2.11%,其中血清中Hb>2 g/L占 9.28% (22/237)。

2.2 Hb标准曲线的建立 全血样本Hb浓度的标准曲线为Hb全=328.73×A540nm+1.67(r2=0.996),血清样本Hb浓度的标准曲线为Hb血清=35.56×A540nm+0.14 (r2=0.998)。见图1。

图1 血红蛋白标准曲线

2.3 Hb与NSE的相关性 分别检测50份新生儿样本,测定其血清中NSE浓度,添加反复冻融红细胞后,离心分离血清后继续检测其浓度,通过计算两者血清NSE浓度变化与Hb浓度变化的比值,得出的NSE/Hb为(35.62±2.17) μg/g即血红蛋白每增加1 g/L,NSE增加(35.62±2.17)ng/mL。以NSE血清为Y轴, Hb为X轴, NSE血清结果与Hb变化高度相关,其回归方程分别为YΔNSE=32.90×Hb全血浓度+1.58(r2=0.991,P<0.001),YΔNSE=30.97×HbHICN+1.11(r2=0.981,P<0.001),见图2。且两者方法 NSE之间高度相关 (r2=0.933,P<0.01)。见图3。

图2 血清NSE与血红蛋白浓度变化相关性

图3 血红蛋白仪器法和HICN法 NSE相关性

2.4 两种校正公式与溶血前血清NSE比较 采用单因素方差分析对溶血前与矫正后3组数据进行分析,差异无统计学意义(F=0.136 ,P=0.873),见表1。50份样本加入反复冻融的红细胞后,NSE检测结果(71.65±21.77)ng/mL,全部超过临床参考区间,NSE校正=NSE溶血-ΔNSE,经上述两种公式校正后,超过临床参考区间的样本分别为8份(16%)和7份(14%)。

表1 NSE校正公式相关性分析

2.5 校正公式的建立 根据ΔHb血清与ΔNSE的相关性,得出校正公式分别为:NSE校正=NSE测定-32.90×Hb全血浓度-1.58;NSE校正=ΔNSE测定-30.97×HbHICN-1.11。

3 讨论

NSE在新生儿缺氧缺血性脑病、神经母细胞瘤、嗜铬细胞瘤及小细胞肺癌等疾病中均有表达,在小细胞肺癌诊断和鉴别诊断中应用广泛,具有较高敏感性和特异性[14-18]。同时NSE对脑细胞及血管损伤程度判断有重要临床价值,是脑损伤的特异性标志物[19-20]。溶血性标本中的血红蛋白(Hb)浓度各不相同,血红蛋白浓度越高对NSE的检测结果影响越大,样本在室温放置时间的过久以及储存温度变化会导致样本溶血从而使血清中NSE水平增高[21],王强等[22]研究发现血清中血红蛋白每增加1 g/L,NSE检测结果平均增加(23.70±3.62)ng/mL。

本实验通过血清中加入不同浓度的Hb全血样本,模拟溶血环境,通过检测溶血后的NSE浓度,以评价不同浓度的Hb对NSE结果的影响。实验结果显示正常血清NSE浓度为(8.21±2.47)ng/mL,随着溶血程度的增加,血清中Hb浓度也逐渐增高,导致血清中NSE的浓度也越来越高,ΔNSE值也越来越大。当标本发生轻微时Hb浓度为0.625 g/L,NSE的结果可增加16.54 ng/mL。当标本严重溶血时,如Hb浓度为10 g/L,NSE值增加的量高达325.49 ng/mL,明显高于溶血前。经SPSS统计软件分析,每克Hb含NSE的量呈正态分布(P=0.2634),每释放1 g/L浓度的血红蛋白,NSE浓度增加35.62±2.17(ng/mL),这与Mastroianni等[23]的研究结果一致。ΔNSE与ΔHb的直线回归方程显示, NSE与 Hb呈良好相关性(r2=0.998,r2=0.996,且P<0.001)。本实验结果显示,新生儿血清NSE检测结果在未校正的情况下,大约有80%的新生儿结果可能被误判,误导新生儿治疗。50份新生儿血清经两种方法校正后,超过正常参考区间的样本比例分别 16% 和14%,两者与溶血前检测结果差异无统计学意义(F=0.136,P=0.873),仪器法和HICN法高度相关(r2=0.933,P<0.001),本实验得出的两种NSE校正公式相关程度较高,但仪器法应用更加简单方便。由于本实验应用人工方法模拟溶血环境,得出的结果与血清中实际结果可能不一致。因此,对于新生儿样本,无论应用哪一种校正公式,均需要在报告中标注提示临床医生,此结果仅作为参考,不是实测结果。

4 结论

新生儿样本NSE检测应当避免溶血,由于新生儿血管纤细,采血技术要求较高,容易导致新生儿样本溶血,因此应用NSE校正公式能够帮助临床辅助诊断相关疾病,具有一定临床价值。