青少年鼻咽血管纤维瘤中HSP90表达及临床意义*

王娟 王泽 王雪霖 唐焕文

(中国人民解放军联勤保障部队第970医院五官科,山东 烟台 264000)

青少年鼻咽血管纤维瘤(Juvenile nasopharyngeal angiofibroma,JNA)是一种具有局部侵袭性但组织学上良性的血管肿瘤,几乎只发生于青春期男性,约占所有头颈部肿瘤的0.5%[1]。JNA呈扩张性和破坏性生长,其可以通过孔和裂扩散到邻近的鼻腔、鼻咽、鼻旁窦、眼眶和颅底,常以哑铃状延伸至翼腭间隙、咀嚼肌间隙和颞下窝[2]。JNA常见的症状包括鼻塞(80%)和鼻出血(60%),而更晚期的肿瘤可以导致面部肿胀和视觉或神经障碍。由于JNA的症状与包括鼻炎、鼻窦炎和息肉在内的其他鼻咽疾病类似,因此存在延误诊断的可能[3]。热休克蛋白90(Heat shock protein 90,HSP90)是与癌症进展相关的最活跃的伴侣蛋白之一[4],其在血管生成、细胞增殖、迁移、侵袭和转移中有重要作用[5]。HSP90在多种癌症中过度表达,并与其发生发展密切相关,尤其是前列腺癌等许多激素依赖性肿瘤[6]。研究认为其发病可能与雌激素(Estrogen,ER)不足或雄激素(Androgen,AR)相对过多有关[7]。有研究发现使用ER拮抗剂可以治疗鼻咽血管纤维瘤,如早期使用雌激素可减少JNA术中失血,且大约50%的侵袭性纤维瘤病对抗雌激素治疗有反应[8]。新生血管持续快速形成是肿瘤快速生长的关键因素之一,血管生成因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)是最主要的调控肿瘤血管发生主要因子,其对血管内皮细胞的增殖及血管构建具有重要的特异性的调节作用。微血管密度(Microvascular density,MVD),又称之为微血管计数,是衡量肿瘤血管生成的活跃程度的指标之一。MVD与VEGF表达水平可以协同预测评估良恶性肿瘤生长、转移及复发趋势[9-10]。HSP90与肿瘤发生密切相关,有研究显示HSP90抑制剂可以通过抑制包括Akt/mTOR及HIF-1α/VEGF及激素受体等多个通路来调节肿瘤细胞的生长[11]。目前,在JNA中HSP90与VEGF或激素之间相关性的研究较少,因此,本研究拟通过使用组织微阵列(TMA)分析JNA样本中HSP90的表达水平及其与VEGF与ER的相关性,从而评估HSP90对JNA预后的影响,为患者最佳治疗方式的选择提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 回顾性分析2018年—2022年在我院接受手术治疗的60例组织学诊断为JNA的男性患者。所有患者在治疗前都提供了关于临床信息的知情同意书。从医疗记录中回顾性收集临床数据。来自10例男性患者的正常中鼻甲样本作为对照组;中鼻甲标本取自外伤性视神经病变、垂体腺瘤或脑脊液鼻漏患者,中位年龄为21.2岁(12～26岁)。接受手术的JNA患者的中位年龄为16.8岁(10～39岁)。这些患者接受了开放或内窥镜(包括经鼻内镜手术和内镜辅助手术)手术。使用Radkowski系统进行肿瘤分期评估,并通过CT和/或MRI观察肿瘤的最长直径以确定肿瘤大小。本研究经医院伦理委员会批准(批号:2018-01007)。

1.2 患者随访 平均随访时间为174.5个月(144～206个月)。10例患者失访,18例患者复发。将没有肉眼可见的残留肿瘤定义为完全切除,并通过组织学以及术后CT或MRI进一步证实。患者术后第一年每3个月复查一次,次年每6个月复查一次,然后每年复查一次,直至成年。临床或放射学上(内窥镜检查、CT和/或MRI)在鼻咽区域、鼻腔或鼻窦中发现肿瘤的患者为JNA复发。

1.3 组织微阵列 根据已报道的既定方案生成组织微阵列(TMA)[7]。将1组60个JNA(每个直径为1.5 mm)在载玻片上隔开,并选择来自10例男性患者的正常中鼻甲样本作为正常对照。从每个代表性组织中取出2个核心,并将所有组织核心(直径1.5 mm)放入可以覆盖多达160个核心的TMA块中。

1.4 免疫组织化学分析 采用多克隆抗HSP90(1∶100,Abcam,UK)作为一抗,GTVsion III检测系统(GK500705,Gene Tec,Shanghai,China)作为二抗和彩色底物溶液。此外,本研究还检测了VEGF、CD105和ER-α(1∶500,Abcam,UK)蛋白,并根据先前描述的方法计算了微血管密度(MVD)。对组织切片进行脱蜡和复水,抑制内源性过氧化物酶活性,经过洗涤和抗原修复后,在非免疫血清中封闭切片,再将切片与一抗孵育,然后二抗和彩色底物溶液孵育,最后用苏木精对切片进行复染、洗涤、脱水和封片。以相同方式处理阴性对照,但不添加一抗。

1.5 染色分数 由两名对临床数据不知情的独立研究人员,通过光学显微镜半定量估计免疫染色的强度和阳性细胞的百分比。将HSP90表达>5%的样本作为阳性样本[9]。免疫反应评分如下:0(无染色);1(与阳性细胞百分比无关的弱免疫反应);2(<75% 的细胞有中度免疫反应性或<25%的细胞有强免疫反应性);3(75%的细胞具有中度免疫反应性或25%的细胞具有强免疫反应性)。每个样品对应两个染色缸,对每个染色缸进行评分,最终采用两个染色缸的平均得分。为了进一步分析,将患者分为低(评分0～1)和高(评分2～3)HSP90表达组两组。

1.6 统计学分析 采用SPSS 26.0软件行统计学分析。通过卡方检验分析免疫反应标志物与临床病理学变量的关联。采用Spearman相关检验分析不同标记分子表达水平的相关性。通过Kaplan-Meier方法检查复发时间(TTR),并通过对数秩检验评估TTR的差异。将本研究中达到统计学意义并在以前的研究中具有显着价值的因素输入Cox回归模型进行多变量分析。绘制(ROC)曲线以确定各种参数的预测值。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组织化学分析检测JNA中HSP90的表达模式 JNA的病理特征包括不规则血管和间质成分,其中血管可分为较大的血管、正弦型血管和较小的毛细血管。TMA的免疫组织化学分析显示HSP90位于基质成分中成纤维细胞的细胞质和细胞核中,在正弦型血管和较小的毛细血管中有明显的HSP90表达,在成熟的大血管内皮细胞中仅观察到微弱的HSP90信号。对照组(取自男性患者的10个正常中鼻甲样本)中仅检测到HSP90弱表达,见图1。

图1 HSP90染色的微阵列组织(400×)

2.2 临床病理学特征与HSP90表达的关联 评估了HSP90表达与JNA基本临床特征的相关性后发现HSP90与患者年龄相关(P<0.05),但与任何其他基线临床特征无关:包括肿瘤分期、JNA手术史、手术方法和手术期间出血(P>0.05),见表1。

表1 JNA患者HSP90表达的基本临床特征的Pearson卡方检验分析

2.3 HSP90水平与病理特征的关联 结果表明,MVD、ER-a和VEGF与JNA患者的HSP90表达显着相关(P<0.05),见表2。

表2 JNA患者病理特征与HSP90表达的Spearman相关性检验分析

2.4 JNA复发患者HSP90水平与临床病理特征的相关性 50例患者中,18例复发(5年复发率为36.0%),平均复发时间为20.18个月(2～92个月),基于50例患者复发的临床病理学特征,见表3。与根治性切除后HSP90低表达的患者(20.00%)相比,高HSP90表达的患者复发率(52.00%)升高。晚期肿瘤、MVD较高、出血更明显,且高ER-α水平患者的复发率显着较高(P<0.05)。此外,HSP90和ER-α表达的组合也与疾病复发显著相关(P<0.05)。而其他临床病理学特征如JNA手术史、手术方式等方面与肿瘤复发差异无统计学意义(P>0.05)。这表明,高HSP90和/或ER-α水平高、MVD水平高、晚瘤分期更晚和手术期间出血更明显的患者更有可能表现出侵袭性特征。

表3 JNA患者复发临床病理特征的Pearson卡方检验分析

2.5 JNA患者的高HSP90表达与早期疾病复发相关性 在最后一次随访中,发现18例患者复发(36.0%)。HSP90高表达的JNA患者1年、3年和5年复发率分别为32.1%、52.8%和57.4%,而HSP90低表达的患者分别为7.5%、16.1%和18.2%。最后,通过Cox比例风险模型进行单变量和多变量分析,以评估HSP90和临床病理因素对JNA患者复发时间(TTR)的影响,见表4。在单变量分析中结果显示,HSP90表达显着影响TTR。此外影响TTR的其他因素包括MVD、术中出血、肿瘤分期和年龄。而后本研究又在多变量Cox比例风险分析中进一步评估了单变量分析中筛选出的的重要因素。结果显示HSP90、MVD和肿瘤分期是TTR的独立预后因素。此外在所有临床病理学特征中,HSP90高表达是预测预后的独立因素,见表5。

表4 JNA患者复发时间(TTR)的单变量Cox回归分析

表5 JNA患者复发时间(TTR)的多变量Cox回归分析

3 讨论

JNA复发率相对较高,目前主要的治疗方式仍以内镜切除为主,预防JNA复发,提高患者的预后仍然是外科医生面临的主要挑战。探讨JNA发病的机制及评估影响其复发的因素具有重要意义。

目前JNA的发病机制尚有争议,有研究提出JNA患者体内性激素不平衡学说。后续发现应用雌激素治疗两例JNA患者后肿块缩小,基于此有研究提出JNA发病可能与患者体内性激素水平失去平衡有关,即患者体内雌激素(ER)、孕激素(PR)不足,促进促性腺激素释放,进而导致JNA组织增生[12]。

JNA复发与VEGF高表达有关。JNA具有良性肿瘤的形态学特征和恶性肿瘤的生物学特征,研究JNA生长的调节因素对于全面了其发病机制与提高患者预后具有重要的价值。肿瘤中血管增殖活跃程度与其生物学行为密切相关,如肿瘤的生长、浸润、转移均与血管生成密切相关,肿瘤内VEGF与MVD水平是重要的反应良恶性肿瘤增殖状况的指标。与其他具有广泛作用的成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factor,FGF)、血小板衍生生长因子(Platelet derived growth factor,PDGF)等不同的是,VEGF是唯一对血管形成具有特异性促进增殖作用的因子。因此有必要进一步评估JNA与VEGF的临床相关性。过往研究显示JNA本质为真性血管瘤,其组织内血管处于过度增殖状态,而VEGF在JNA中有较高表达,对有较强的促血管生成作用[13]。此外在JNA中TGF-β、HIF-1α表达异常增高、进而调控VEGF表达增高,促进瘤体血管生成。

HSP90与肿瘤促生成因子VEGF及激素如ER之间具有复杂的交叉调控网络。HSP90分子伴侣是一个普遍存在的蛋白质家族,其通过调节大型多蛋白复合物和配体蛋白的折叠和/或组装来参与多种细胞功能,直接或间接地调节包括适应压力、细胞增殖、运动、信号转导和血管生成在内的多种细胞过程[14]。HSP90下游大概约200多种靶蛋白,其中大部分与肿瘤发生、发展以及转移密切相关,是肿瘤号通路的一个关键靶点[15]。有研究显示HSP90-ERK-VEGF信号通路在肠癌所致血管内皮细胞迁移和管状生成中发挥重要作用[16]。也有研究显示抑制HSP90活性是治疗胰腺癌的有效方式,抑制HSP90可中断对吉西他滨和5-FU耐药的胰腺癌细胞中包括VEGF信号通路在内的多个关键致癌信号级联反应,进而有效的抑制癌细胞抗凋亡和增殖[17]。此外最近的研究表明,HSP90与多种肿瘤的发生和发展密切相关,其中包括许多激素依赖性肿瘤[18]。从机制上来讲HSP90可以通过与ER、PR和糖皮质激素等游离类固醇激素受体结合来维持激素的稳定和失活状态进一步调控肿瘤的发生发展。此外还有研究显示激素受体和VEGF之间的相互作用可能参与JNA的发生和发展[19]。

本研究评估了HSP90的表达并评估了其与JNA临床病理学变量之间的关联,发现JNA中HSP90的高表达与原发肿瘤切除后的高复发率相关。这与之前的研究结果一致,即HSP90的高表达是多种癌症预后不良的标志物[20]。此外本研究还发现HSP90的表达与MVD和VEGF等肿瘤血管生成相关因子显著正相关。这些结果预示着HSP90可能是阻断JNA术后复发的有效分子靶点之一。

目前已知的HSP90抑制剂主要有格尔德霉素及其衍生物、根赤壳菌素、新生霉素以及以嘌呤结构为基础的化合物4大类[21-24]。这些抑制剂可以通过抑制HSP90功能来破坏分子伴侣复合物结构,推动下游蛋白酶体降解,进一步增加肿瘤细胞对治疗的敏感性并优化药物功效。此外更多的HSP90抑制剂正在进行药物试验中,考虑到JNA的恶性肿瘤的生物学特征,进一步评估HSP90抑制剂在JNA治疗中的价值对于防治JNA及改善JNA患者预后是有必要的。本研究尚存在一些局限性,由于JNA是一种侵犯颅底孔、神经和血管的肿瘤,临床实践中存在难以准确评估边缘状态的困难。目前尚缺乏HPS90在JNA中的分子机制研究。因此,多中心、前瞻性研究及进一步深入的机制研究是必须的,这有助于进一步阐明HSP90在JNA复发中的功能及意义,从而为临床防治JNA及改善预后提供有益参考价值。

4 结论

本研究表明HSP90高表达与JNA复发相关,HSP90可能通过稳定雌激素受体及血管生成因子来发挥促JNA复发作用。此外本研究从临床角度强调了应用HSP90抑制剂是预防JNA术后复发、改善JNA患者预后的潜在的有效方法之一。