构建沉默Runx2基因的牙龈癌细胞慢病毒载体*

胡金龙 秦晗 张勇 邓晴

(南京医科大学连云港临床医学院口腔科,江苏 连云港 222002)

口腔鳞状细胞癌约占全身恶性肿瘤的3%[1],而牙龈是口腔鳞状细胞癌的最常发生部位之一,占口腔鳞状细胞癌的10%～25%[2]。目前,基因治疗是广为研究的癌症治疗新方向,其能够在分子水平改变细胞的基因表达,从而使细胞获得新的遗传表型,实现精准、个性化的癌症治疗[3]。成骨细胞特异性转录因子(Runt-related transcription factor 2,Runx2)是转录因子Runx家族中的一员,Runx转录因子家族在不同的组织和细胞谱系中发挥着重要作用,其中Runx2是胚胎期间骨骼发育和其他器官如乳腺和前列腺形态发生过程中的必需转录因子[4]。相关研究表明Runx2在Ⅱ型糖尿病肾病、骨质疏松等疾病中起重要的调控作用[5-6]。Runx2同样参与恶性肿瘤的生物学行为,与乳腺癌、前列腺癌、多发性骨髓瘤等多种恶性肿瘤的进展联系紧密[7-8]。然而Runx2在牙龈癌中的作用鲜有报道,在牙龈癌中的不同时空表达水平及调控机制仍未明确。本实验利用慢病毒载体转染GNM细胞,获得稳定沉默Runx2基因的GNM细胞,为进一步探讨其在牙龈癌中的作用及其分子机制提供实验支持。

1 材料与方法

1.1 实验材料 胎牛血清(澳洲Ausbian公司),基础培养基和DPBS(美国Corning公司),兔抗人Runx2抗体、兔抗及鼠抗IgG抗体(美国CST公司),鼠抗人β-actin抗体(美国SANTA CRUZ公司),胰酶(美国GIBCO公司),Trizol(上海普飞生物技术有限公司),M-MLV(美国promega公司),oligo dT(上海生工生物工程技术服务有限公司),BCA Protein Assay Kit(上海碧云天生物技术有限公司),RIPA 裂解液(上海鼎国生物技术有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 慢病毒转染目的细胞 人上颌牙龈癌颈淋巴结转移癌细胞系GNM细胞(中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心提供)冻存管从液氮罐中取出,解冻后1300 rpm离心3 min,消毒后移至生物安全柜。取出冻存管吸除冻存液上清,加入1 mL完全培养基进行重悬细胞,细胞悬液接种至含有3 mL完全培养基的培养皿中,轻晃匀后将其放至培养箱中培养。每过24 h进行1次培养液更换,细胞汇合度达80%左右再做传代培养。用含HiTransG P的转染液将完全培养基制成(3～5)×104个mL-1细胞悬液,随之接种细胞悬液到培养板,直至细胞达到15%～30%铺板量左右。铺板后无需培养,病毒按MOI=10进行转染。将各孔中转染16 h后的细胞收集起来转移至12孔板中,并补加1 mL完全培养基,轻混匀后放至培养板继续培养。转染后120 h,细胞繁殖良好未出现大量的细胞死亡现象,NC组和CON组具有相似的细胞状态,使用荧光显微镜观察标记基因的表达,荧光率即为病毒的阳性转染率。

1.2.2 实时PCR检测Runx2基因转录水平 收集转染细胞,2000 r/min离心5 min后吸除其中上清液,向沉淀物中加入1 mL Trizol并充分混匀,室温下静置5 min后转移至新EP管;反转录获得cDNA(使用M-MLV试剂盒),将2 μL反转录引物与2.0 μg Total RNA一同混入PCR小管中,再加入RNase-Free H2O至11 μL,混匀后进行离心,70 ℃水浴10 min,立即对其进行冰浴退火。按比例配制反应体系,混匀后进行短暂离心。42 ℃水浴中上述体系反应1 h后,70 ℃水浴10 min令反转录酶失活,最后得到的反转录产物cDNA将置于-20 ℃保存备用。2步法实时PCR并制作扩增曲线和熔解曲线,然后进行数据分析。所需引物由上海吉凯基因医学科技股份有限公司设计合成,见表1。

表1 目的基因与内参基因引物

1.2.3 Western Blot检测Runx2蛋白表达水平 收集转染细胞,使用PBS洗涤两次后加入RIPA,在冰上进行裂解10 min,刮下细胞转移到新EP管中,超声使细胞破碎,4 ℃、12000 rpm离心15 min,利用BCA法测定离心后上清液蛋白的浓度。加入新裂解液使每个样品蛋白浓度调至2 μg/μL-1,加入1/5体积的6X lodding buffer并混匀,100 ℃浴煮 10min,短暂离心后保存在-80 ℃备用。SDS-PAGE电泳,使用湿转法免疫印迹。室温下对PVDF膜封闭1 h,加入稀释后一抗Runx2(1∶1000)、β-actin(1∶2000)4 ℃孵育过夜,TBST溶液洗膜,加入稀释后二抗(1∶5000)室温下孵育1.5 h,TBST溶液洗膜,X光显影。利用Image J软件分析图像中蛋白OD比值。

1.3 统计学分析 采用SPSS 26.0软件进行统计学分析,实验组和对照组数据进行t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 慢病毒转染效率 病毒转染120 h后,各组细胞状态相当,细胞未出现大量死亡;荧光显微镜观察标记基因表达,荧光率即为阳性转染率。NC组荧光表达未见;KD1组荧光表达较高;KD2组荧光表达最高;KD3组荧光表达较低,见图1。

图1 慢病毒转染GNM细胞结果

2.2 GNM细胞Runx2 基因转录水平 实时PCR扩增曲线中各管曲线的平行性好,提示各管扩增效应相近,熔解曲线中Runx2基因和GAPDH基因均为单一峰型,峰形基底窄而峰高,提示引物设计良好,特异性强,见图2。PCR结果显示,相较于NC组,KD2组的GNM细胞Runx2基因敲低效率最高,约达到64.4%(P<0.05),见图3。

图2 扩增曲线和溶解曲线

图3 各组Runx2 mRNA表达水平分析

2.3 GNM细胞Runx2蛋白表达水平 Western Blot结果显示,相较于NC组,KD2组的GNM细胞Runx2蛋白表达下调最为明显(P<0.05),见图4、5。

图4 Western Blot结果

图5 各组Runx2 蛋白表达水平分析

3 讨论

RNA干扰技术(RNAi)是应用较广泛的基因沉默方法,其相较DNA敲除技术操作简单且沉默效果可靠,现已有多种基于RNAi的癌症治疗制剂投入临床试验[9-10]。慢病毒属于逆转录病毒科,其可将自身RNA整合到宿主染色体上,慢病毒载体是通过改造慢病毒基因使其失去毒性后形成的一种基因编辑工具,以实现搭载基因在宿主细胞形成稳定表达[11]。慢病毒转染是RNAi常用的基因导入方式,即首先利用质粒在辅助细胞内包装获得慢病毒颗粒,携带dsRNA的慢病毒颗粒感染目的细胞,随之针对靶基因的dsRNA随病毒RNA逆转录形成cDNA并结合到目的细胞的染色体上,形成稳定表达的dsRNA。胞质中核酸内切酶Dicer将再生成的dsRNA切割成小干扰RNA(siRNA),siRNA在RNA解旋酶作用下形成反义链RNA,反义链RNA与靶基因转录的mRNA互补结合使其切割后降解,同时siRNA反义链可激活dsRNA合成形成RNAi循环,从而特异性抑制靶基因表达[12-13]。本实验即利用慢病毒转染技术将重组基因整合到GNM细胞的基因组中,随之细胞内触发的RNA干扰使Runx2基因达到稳定沉默效果。

慢病毒转染结果受多种因素影响,包括培养时间、转染试剂、细胞特性、病毒细胞比例等。实验前利用预实验首先确定病毒转染的适宜条件,阴性对照病毒选用CON-313,按转染试剂分为A组:在常规培养基中转染病毒;B组:在添加HitransG A(简称A液)的常规培养基中转染病毒;C组:在添加HitransG P(简称P液)的常规培养基中转染病毒;Control组:常规培养基中观察细胞是否正常生长。而后按照感染复数分4组进行病毒转染:MOI=1; MOI=10; MOI=50; MOI=100,预实验结果显示对GNM细胞而言,在含P液的常规培养基中,病毒按 MOI=10 更易转染,转染率可达80%且细胞增殖良好。根据预实验结果用慢病毒转染GNM细胞,将病毒按序号分为:NC组(CON313)、KD1组LV-Runx2-RNAi(80978-1)、KD2组LV-Runx2-RNAi(80979-1)和KD3组LV-Runx2-RNAi(80980-1)。病毒转染后16 h换液,120 h后荧光显微镜观察到各组细胞状态良好,其中NC组荧光表达未见;KD1组荧光表达较高;KD2组荧光表达最高;KD3组荧光表达较低,KD2组相较其他组病毒的转染效率更高。RT-PCR分析显示KD2组Runx2基因沉默效果最佳,沉默效率可达64.4%。Western Blot结果显示KD2组GNM细胞Runx2蛋白表达下调显著,较其他实验组具有明显差异。实验筛选出特异性沉默GNM细胞Runx2基因的慢病毒组,并初步确定作用时间及各种实验参数适宜值等。

Runx家族都包含一个Runt的DNA结合域,使Runx蛋白与DNA结合以实现转录调控。Runx2通常被称为成骨的主开关,是机体骨代谢过程中的桥梁[14]。Runx2是促进成骨细胞和软骨细胞成熟的关键调控因子,Runx2基因突变时会导致颅锁骨发育不良、颅缝早闭等遗传性骨病的发生[15-17]。Runx2主要表达两种亚型,其中Ⅱ型Runx2主要在骨谱系中表达,而癌细胞中表达的是由近端P2启动子转录的Ⅰ型Runx2[18]。Runx2 的异常表达与肿瘤细胞的干细胞潜能相关,Guo等[19]研究发现Runx2在胃癌的早期阶段高表达,Runx2的表达上调Yes相关蛋白1(Yes-associated protein 1,YAP1)激发胃癌肿瘤细胞的致瘤潜力。此外有研究称多发性骨髓瘤中Runx2正向调节肿瘤细胞凋亡的抑制基因生存素(survivin)表达,并增强多发性骨髓瘤细胞的增殖[20]。Runx2的异常表达还会作用于肿瘤的侵袭及转移过程[21-23]。Gowda等[24]发现miR-302b通过靶向Runx2抑制乳腺癌的肿瘤进展,其与乳腺癌淋巴结转移和TNM分期显著相关。骨转移肿瘤细胞常显示成骨细胞样细胞表型,如肿瘤细胞通过Runx2依赖性信号传导表达甲状旁腺激素相关蛋白(parathyroid hormone related protein,PTHrp)、NF-κB受体活化因子配体(nuclear factor-κB receptor activating factor ligand,RANKL),激活破骨细胞NF-κB信号通路使肿瘤周围骨质破坏,促进骨转移肿瘤生长[25-26]。同时肿瘤细胞能通过Runx2表达Dickkopf相关蛋白1(DKK1)抑制成骨细胞Wnt通路阻断肿瘤周围环境的骨质修复,以促进肿瘤的溶骨性骨转移[27]。以上研究提示Runx2在肿瘤的恶性生物学行为中具有重要的转录调控作用,然而牙龈癌中Runx2的调控机制尚未明确,因此探讨Runx2在牙龈癌中的潜在作用机制具有显著的临床意义。

4 结论

本实验成功构建沉默Runx2基因的GNM细胞慢病毒载体,此慢病毒载体是进一步研究Runx2基因沉默后GNM细胞功能和信号转导改变的重要实验工具。Runx2在牙龈癌细胞模型和动物模型中的时空表达变化及调控机制将是课题组接下来深入研究的重点内容,借此以期发掘出牙龈癌发生发展中的关键机制,从而为牙龈癌的靶向治疗提供理论参考。