NCOA5通过调控上皮间质转化促进卵巢癌细胞的侵袭转移能力*

刘俊 成洁 庄珩之 王圣坦 刘晓行

(海南省人民医院妇科,海南 海口 570311)

卵巢癌是女性生殖系统中常见的恶性肿瘤,其死亡率较高,全球每年约有14万患者死亡[1],且由于缺乏早期临床症状和有效的筛查策略,大约75%的病例确诊时通常分期较晚[2]。目前减瘤手术和铂/紫杉醇联合化疗是卵巢癌的标准疗法,而随着医疗技术的持续发展,卵巢癌的治疗已在一定程度上得到改善,但是大多数患者5年生存率仍低于50%[3]。卵巢癌的发病机制尚未完全明确,核受体共激活因子5 (Nuclear Receptor Coactivator 5,NCOA5)是一种广泛表达的核受体共同调节剂,也是雌激素受体和孤儿核激素受体共激活因子BD73的共同调节剂[4]。NCOA5基因表达异常可导致肿瘤的发生,在乳腺癌中NCOA5表达增加,促进乳腺癌细胞的增殖和侵袭转移能力[5]。NCOA5在宫颈癌组织中表达减少,并与宫颈癌患者不良临床病理参数和预后相关,抑制宫颈癌细胞增殖和转移能力[6]。由此可见,NCOA5在不同肿瘤中发挥的作用可能相反,其参与了几种恶性肿瘤的发生发展。但是它在卵巢癌中的作用仍然未知。因此本文在卵巢癌中研究NCOA5的表达及发挥的生物学功能,以表明NCOA5作为促进卵巢癌恶性进展的重要分子,具有作为抗卵巢癌治疗分子靶点的潜力。

1 材料与方法

1.1 试剂来源 卵巢癌细胞株SKOV-3、A2780、OC3、HO-8910和正常卵巢上皮细胞系IOSE80购自中国科学院细胞库(中国上海);RPMI-1640培养基、胎牛血清和青链霉素双抗购自美国Gibco公司;NCOA5 siRNA购于Santa Cruz生物技术有限公司;基质胶购自美国BD公司;Transwell小室购自美国Corning公司;二辛可宁酸 (BCA)蛋白质测定试剂盒和PVDF膜购自美国Thermo试剂公司;NCOA5、E-cadherin、N-cadherin、vimentin、Slug、GAPDH和HRP偶联的二抗购于英国Abcam公司。

1.2 细胞培养、分组和转染 卵巢癌细胞株SKOV-3、A2780、OC3、HO-8910和正常卵巢上皮细胞系IOSE80快速复苏后均采用RPMI-1640细胞培养基重悬,并加入胎牛血清(10%)和青霉素/链霉素的混合物(1%),放置在含有5% CO2的37 ℃培养箱中培养,细胞长至90%左右时,胰酶消化进行细胞传代。SKOV3及A2780细胞生长较好时,胰酶消化后以每孔2×105个细胞接种于6孔板内,分为si-NC组和si-NCOA5组。按照Lip 2000转染试剂说明书分别将NC siRNA和NCOA5 siRNA转染至对应组的细胞中。转染48 h后,通过western-blot检测沉默效率。

1.3 Boyden实验 将BD基质胶在4 ℃下解冻,采用无血清培养基稀释基质胶(稀释比例为1∶10),取10 μL稀释的基质胶均匀加至Transwell小室的上室聚碳酸酯膜上,放置37 ℃培养箱中30 min备用。胰酶消化si-NC组和si-NCOA5组SKOV3及A2780细胞重悬,采用无血清培养基洗3次并重悬细胞,将细胞密度调整为1.5×106个细胞/mL,接种至铺好的基质胶上,并在Transwell小室的下室中加入100 μL含有10% 胎牛血清的培养基。在培养箱中孵育12 h后,用棉签去除上室中的细胞,将聚碳酸酯膜放置4%多聚甲醛中固定,并采用结晶紫染料染色。在显微镜下随机选择5个不重叠的视野计算侵袭细胞数目。

1.4 Transwell实验 胰酶消化si-NC组和si-NCOA5组SKOV3及A2780细胞重悬,采用无血清培养基洗3次并重悬细胞,将细胞密度调整为1×106个细胞/mL,接种至Transwell小室的上室聚碳酸酯膜上,并在Transwell小室的下室中加入100 μL含有10% 胎牛血清的培养基。在培养箱中孵育6 h后,用棉签去除上室中的细胞,将聚碳酸酯膜放置4%多聚甲醛中固定,并采用结晶紫染料染色。在显微镜下随机选择五个不重叠的视野计算转移细胞数目。

1.5 Western-blot实验 胰酶消化si-NC组和si-NCOA5组SKOV3及A2780细胞,PBS洗3次后,加入含有蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物的蛋白裂解液,经高速离心获得蛋白裂解液。根据二辛可宁酸 (BCA) 蛋白检测试剂盒检测和计算蛋白质浓度。吸取50 μg等量的蛋白质加入十二烷基硫酸钠 (SDS) 聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳,并将凝胶转移到聚偏二氟乙烯膜 (PVDF) 上。采用封闭液封闭PVDF膜上的非特异蛋白,TBST洗3次后,将PVDF膜与NCOA5、E-cadherin、N-cadherin、vimentin、Slug、GAPDH一抗稀释液(稀释浓度均为1∶5000)于4 ℃中孵育过夜。TBST洗3次后,将PVDF膜与兔、鼠二抗(稀释浓度均为1∶8000)孵育。采用ECL试剂盒检测蛋白条带。

2 结果

2.1 NCOA5在卵巢癌细胞系中表达上调 Western blot检测NCOA5在卵巢癌细胞株SKOV-3、A2780、OC3、HO-8910中的表达分别为0.89±0.08、0.91±0.10、0.19±0.03、0.21±0.04,显著高于在正常卵巢上皮细胞系IOSE80中的表达(0.08±0.03)(F=103.79,P<0.001)。其中在SKOV-3和A2780细胞中的表达相对较高(P<0.05),见图1。

图1 Western blot检测NCOA5蛋白在卵巢癌细胞中的表达

2.2 NCOA5 siRNA转染卵巢癌细胞效果 Western-blot结果显示,NCOA5蛋白在si-NC组和si-NCOA5组SKOV3细胞中的表达分别为0.31±0.04和0.11±0.02,与si-NC组相比,si-NCOA5组卵巢癌细胞中NCOA5的表达显著降低(t=7.746,P=0.001),见图2A。在si-NC组和si-NCOA5组A2780细胞中的表达分别为0.40±0.08和0.10±0.03,与si-NC组相比,si-NCOA5组卵巢癌细胞中NCOA5的表达显著降低(t=6.082,P=0.002),见图2B。

图2 Western-blot检测显示与si-NC组相比,si-NCOA5组细胞中NCOA5的表达显著降低

2.3 NCOA5 siRNA对细胞侵袭能力的影响 Boyden实验检测显示,si-NC组和si-NCOA5组SKOV3穿膜细胞数目分别为67.33±6.11和41.67±4.98,与si-NC组相比,si-NCOA5组卵巢癌细胞侵袭能力显著降低(t=7.974,P<0.001),见图3A。si-NC组和si-NCOA5组A2780穿膜细胞数目分别为72.67±7.32和22.67±5.98,与si-NC组相比,si-NCOA5组卵巢癌细胞侵袭能力显著降低(t=9.162,P<0.001),见图3B。

图3 Boyden实验检测显示与si-NC组相比,si-NCOA5组SKOV3细胞侵袭能力显著降低

2.4 NCOA5 siRNA对细胞转移能力的影响 Transwell实验检测显示,si-NC组和si-NCOA5组SKOV3穿膜细胞数目分别为73.67±9.04和40.67±5.78,与si-NC组相比,si-NCOA5组卵巢癌细胞转移能力显著降低(t=15.752,P<0.001),见图4A。si-NC组和si-NCOA5组A2780穿膜细胞数目分别为88.93±8.96和33.64±7.43,与si-NC组相比,si-NCOA5组卵巢癌细胞转移能力显著降低(t=8.227,P<0.001),见图4B。

图4 Transwell检测显示与si-NC组相比,si-NCOA5组SKOV3细胞转移能力显著降低

2.5 NCOA5 siRNA对细胞EMT的影响 Western-blot检测结果显示,与si-NC组相比,si-NCOA5组卵巢癌细胞SKOV3中EMT相关蛋白E-cadherin表达增加,N-cadherin、vimentin和Slug蛋白表达减少(均P<0.05),见图5A。与si-NC组相比,si-NCOA5组卵巢癌细胞A2780中EMT相关蛋白E-cadherin表达增加,N-cadherin、vimentin和Slug蛋白表达减少(均P<0.05),见图5B。

图5 western-blot检测显示与si-NC组相比,si-NCOA5组SKOV3细胞中EMT相关蛋白E-cadherin表达增加,N-cadherin、vimentin和Slug蛋白表达减少

3 讨论

卵巢癌严重威胁女性患者生命健康,其发病机制也尚未完全明确。研究显示基因表达改变在卵巢癌的发生发展中发挥重要作用[7],因此研究在卵巢癌恶性进展中发挥关键作用的分子对寻求抗卵巢癌治疗的分子靶向药物以改善患者预后至关重要。NCOA5是一种核受体核心调节剂,与α和β雌激素受体相互作用,可以调节雌激素受体α介导的转录活性[8]。此外,NCOA5与肿瘤抑制剂TAT相互作用蛋白相互作用,以调节癌基因C-MYC的转录,以促使肿瘤的发生[9]。已有研究显示NCOA5 在乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌和甲状腺乳头状癌等常见肿瘤中表达异常,其中NCOA5在结直肠癌和肝细胞肝癌中高表达,与肿瘤患者预后较差相关,并促进肿瘤细胞增殖和侵袭转移能力,以发挥癌基因的作用[10-11]。在宫颈癌和甲状腺乳头状癌中NCOA5 表达降低,低表达NCOA5的宫颈癌和甲状腺乳头状癌患者预后较差,抑制宫颈癌细胞增殖、侵袭和转移作用,以发挥抑癌作用[6,12]。表明NCOA5 在肿瘤的恶性进展中充当“双面”角色,但是NCOA5在卵巢癌中的研究鲜有报道。

本研究在卵巢癌细胞系中检测发现NCOA5中表达升高,提示NCOA5在卵巢癌中发挥促癌作用,与NCOA5在乳腺癌和结直肠癌组织水平的表达具有一致性。但是本研究未在卵巢癌组织水平检测NCOA5的表达情况,将在后续进行卵巢癌组织样本的收集并进行研究。在乳腺癌、结直肠癌和肝细胞肝癌等肿瘤中,相关研究显示NCOA5与肿瘤细胞增殖和侵袭、转移能力相关[5,10,13]。本研究在卵巢癌细胞系SKOV-3和A2780中干扰NCOA5的表达,生物学功能显示抑制NCOA5的表达后,卵巢癌细胞的侵袭和转移能力降低。表明NCOA5促进卵巢癌的恶性进展,可能是宫颈癌恶性进展的关键基因,但是NCOA5发挥的作用机制仍需探讨。

过往研究显示,NCOA5可以通过调控Notch3、PI3K/AKT、p21(WAF1/CIP1)等信号通路参与肿瘤的进展[6,9,14]。其中在乳腺癌和肝细胞肝癌中干扰NCOA5的表达,通过抑制上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)抑制肿瘤细胞的侵袭和转移[5,13]。而EMT被认为是肿瘤从发生到转移的主要驱动力,并且在诱导肿瘤恶性进展和耐药性方面发挥关键作用[15-16]。EMT包含粘附连接和底物极性的丧失以及获得间充质特征,如纺锤形细胞形态和肌动蛋白应激纤维的重组、增强细胞运动和侵袭能力等过程[17]。在分子水平上,EMT的主要标志是E-cadherin表达降低,这导致细胞连接减弱,随后细胞之间脱离,以至单细胞迁移增加[18]。E-cadherin的缺失经常与N-cadherin表达增加相结合,这被认为有助于基质导向的细胞粘附谱,从而导致运动、侵入性和转移性细胞表型[19]。同时在EMT过程中,上皮细胞失去了极性转化为间充质细胞,并伴随着vimentin[20]和Slug蛋白表达增加[21],本研究检测发现干扰NCOA5的表达后,E-cadherin蛋白的表达增加,N-cadherin、vimentin和Slug蛋白的表达减少。表明干扰NCOA5的表达是通过减弱EMT抑制卵巢癌的侵袭和转移能力。

4 结论

NCOA5在卵巢癌细胞系中高表达,并有促进卵巢癌细胞侵袭和转移能力,其作用机制可能是通过调控EMT发挥作用,NCOA5具有成为卵巢癌治疗分子靶点的潜力。