LY294002对过敏性鼻炎-哮喘综合征大鼠氧自由基、TRPV1神经元敏感性及TSLP表达的影响*

李丽 许翀 柴若楠

(1.中国人民解放军北部战区总医院过敏反应科,辽宁 沈阳 110016;2.锦州医科大学过敏反应科,辽宁 锦州 121001)

过敏性鼻炎-哮喘综合征( Combined allergic rhinitis and asthma syndrome,CARAS) 是一种变态反应性疾病,近年来发病率逐年增加[1]。磷酸酰肌醇-3激酶(P13K)被证实参与CARAS的产生及发展[2],因此抑制PI3K对CARAS大鼠的治疗至关重要。瞬时感受器电位离子通道蛋白1(Transient Receptor Potential Vanilloid type 1,TRPV1)主要定位在神经纤维中,可受多种因素激活,其中神经炎性介质也可直接或者间接激活TRPV1。目前证实TRPV1参与咳嗽、疼痛、炎症、肿瘤等的产生及发展[3-6]。目前已有多项研究证实TRPV1在过敏性鼻炎中为高表达[7-8],但具体作用机制暂未完全掌握。另外在CARAS中炎性反应被认为是其产生及发展的重要因素之一。胸腺基质淋巴生成素(Thymicstromal lympho poietin,TSLP)是炎性反应的启动因素。相关炎性因子刺激上皮细胞分泌TSLP,通过促进树突细胞成熟诱导炎性因子的释放,最终导致淋巴细胞受到炎性因子浸润,加重哮喘炎性反应[9]。氧化应激是CARAS的病理机制之一,会造成DNA损伤,可激活核转录因子(Nuclear transcription factor-κB,NF-κB)等,活化炎性因子,加重气道炎性反应[10]。但目前关于TRPV1、TSLP在CARAS中作用的相关研究鲜少,具体机制尚不明确。因此,本文旨在研究PI3K抑制剂LY294002对过敏性鼻炎-哮喘综合征大鼠氧自由基、TRPV1神经元敏感性及TSLP表达的影响,现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级SD健康大鼠40只,购自苏州市顾秀实验动物设备公司[生产许可证号:SCXK(苏)-2019-0124],体质量在200～300 g之间,鼠龄在6-8周,适应饲养1周后进行实验。本次实验已通过我院动物伦理委员会审批(批号:20190204)。

1.2 主要实验试剂与仪器 BCA试剂盒(上海酶联生物公司),TSLP试剂盒(厦门仑昌硕生物科技有限公司),TSLP、NF-кB、IкB、TRPV1一抗(南京森贝伽生物公司),苏木精染色液(厦门海标科技有限公司),辣根过氧化物酶二抗(上海李记生物科技有限公司),SOD、MDA试剂盒(上海铭博生物科技有限公司),枸橼酸盐缓冲液(北京诺博莱德科技公司),凝胶成像仪(上海贺琛能源科技有限公司,型号:GelSMART),酶标仪(青岛聚创环保集团有限公司,型号:JC-1087A)。

1.3 LY294002混悬液配置 取2 mg LY294002粉末溶解于200 μL的二甲基亚矾(DMSO)中,0.9% NaCl溶液定容至6 mL,震荡混匀。

1.4 模型建立 根据文献[11]运用卵蛋白致敏和鼻部滴注攻击法建立过敏性鼻炎-哮喘大鼠模型:将卵白蛋白于大鼠腹腔注射2周后在连续鼻部滴注1周,建模。从初次致敏第7 d开始运用卵白蛋白滴鼻,10 μL/1次/d,共7 d。后隔日给予1 g/L卵白蛋白滴鼻,持续对鼻粘膜进行刺激。每隔7 d观察一次鼻部滴蛋白液30 min内搔鼻次数和喷嚏次数。记录大鼠鼻分泌物量、喷嚏次数及鼻痒程度。方法如下:①鼻涕流至前鼻孔为1分;超过前鼻孔为2分;涕流满面为3分。②喷嚏4个以内为1分;5～10个为2分;10个以上为3分。③鼻痒轻度抓鼻为1分;频繁抓为2分;不停抓为3分。总分超过5分为动物造模成功。30只大鼠全部建模成功,均未发生死亡。

1.5 分组及干预 40只大鼠随机分为健康组、模型组、治疗组、对照组,每组各10只。除正常组大鼠外,其余大鼠建立过敏性鼻炎-哮喘综合征模型。治疗组:大鼠静脉注射LY294002(0.5 mg/kg),1次/周,共8周。对照组:大鼠给予布地奈德气雾剂(鲁南贝特制药有限公司)经鼻吸入治疗,2次/d,1～2吸/次,共8周。实验期间动物自由进食、饮水,模型组与正常组注射等量生理盐水。

1.6 检测指标

1.6.1 ELISA检测TSLP表达 治疗8周后,取5 mg左右肺组织,离心5 min,1500 r/min,取上清。运用ELISA检测TSLP表达,实验步骤按照试剂盒说明进行。

1.6.2 免疫组织化学法检测TSLP在肺组织中蛋白含量 治疗8周后,取各组大鼠5 mg肺组织石蜡切片,脱蜡、脱水后PBS清洗,将肺组织切片浸染于3%过氧化氢溶液,约10 min;0.01 mol/L PBS冲洗3次,加热至沸腾后自然冷却,PBS冲洗,封闭0.5 h,一抗滴加TSLP抗体(1∶100稀释),4 ℃孵育过夜;PBS(0.01 mol/L)冲洗3次,1次/5 min,在室温下滴加稀释度为1∶200的生物素化山羊抗兔IgG,孵育0.5 h,PBS(0.01 mol/L)冲洗3次,1次/5 min,室温SABC试剂浸染1 h;PBS(0.01 mol/L)冲洗2次,1次/5 min,DAB显色,蒸馏水终止,乙醇脱水,二甲苯浸染10 min(2次),中性树胶封片,显微镜下观察,用Image Pro Plus 6.0软件进行图片分析。

1.6.3 检测各组大鼠氧自由基相关指标表达 治疗8周后,取各组大鼠5 mg肺组织剪碎,裂解液裂解,匀浆机匀浆制成10%悬液,离心5 min,1250 r/min,后取血清。格按照说明书进行,黄嘌呤氧化酶法检测SOD,TBA法检测MDA。

1.6.4 HE 染色观察小鼠肺组织病理形态学变化 治疗8周后,取各组大鼠10 mg肺组织,4%多聚甲醛溶液中固定,-70 ℃冰箱中冻存。将石蜡切片置于60 ℃的保温箱中1 h,经二甲苯及70%～100%等浓度的酒精反复脱蜡5次至水,蒸馏水清洗,苏木素染色10 min,蒸馏水冲洗,待切片褪色适中后,蒸馏水漂洗1 h,伊红复染后用90%和100%乙醇脱水2次,1 min/次,将切片彻底脱水,再侵入二甲苯溶液中10 min进行透明,把树胶滴在肺组织切片上,盖玻片封固,200 倍光学显微镜下观察肺组织的病理变化。

1.6.5 免疫荧光检测TRPV1表达 治疗8周后,取各组大鼠10 mg肺组织石赌切片脱蜡,乙醇脱水后PBS冲洗,封闭1 h,PBS(0.01 mol/L)冲洗2次,1次/5 min,然后按照1∶100稀释比例加入TRPV1一抗抗体,4 ℃孵育过夜,倒去TRPV1抗体,0.01 mol/L PBS冲洗2次,1次/5 min,加入荧光标记二抗,室温孵育1h,PBS虫死,DAPI染色,室温孵育染色5 min,PBS冲洗,加入抗荧光泮灭封片液,盖玻片封片后共聚焦显微镜下观察。TRPV1绿色荧光,细胞核DAPI为蓝色荧光;用Image Pro Plus 6.0软件进行图片分析。

1.6.6 免疫印迹检测NF-кB、IкB蛋白表达 10 mg肺组织剪碎后研磨,裂解液裂解后匀浆机匀浆,离心5 min,1500 r/min,取上清。BCA法测定总蛋白,调整蛋白浓度后电泳仪电泳,后将蛋白样品转至PVDF膜上,脱脂奶粉封闭1 h,加入NF-кB、IкB一抗4 ℃孵育过夜, PBS清洗后,加入羊抗兔二抗室温孵育 2 h,PBS清洗,ECL法显色,凝胶成像仪观察,以 Image J 分析各组蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 各组大鼠血清及肺组织中TSLP表达 与健康组相比,模型组大鼠血清中TSLP及肺组织蛋白含量的表达升高(P<0.05),与模型组相比,治疗组与对照组大鼠血清中TSLP及肺组织蛋白含量的表达降低(P<0.05),治疗组与对照组大鼠血清及肺组织中TSLP表达对比无差异(P>0.05),见表1、图1。

图1 免疫组织化学法检测各组中TSLP蛋白含量(200×)

2.2 各组大鼠氧自由基相关指标表达 与健康组相比,模型组大鼠肺组织中氧自由基相关指标SOD表达降低、MSA表达升高(P<0.05);与模型组相比,治疗组与对照组SOD表达升高、MDA表达降低(P<0.05);SOD、MDA在治疗组与对照组中的表达无差异(P>0.05),见表2、图2。

表2 各组大鼠SOD、MDA表达对比

图2 各组大鼠SOD、MDA表达对比

2.3 各组大鼠肺组织病理形态 与健康组相比,模型组大鼠肺组织中支气管及管壁产生大量炎性细胞,支气管黏膜水肿、增厚,管腔狭窄,黏液分泌增多;与模型组比较,治疗组与对照组肺组织病理明显有所改善,见图3。

图3 HE染色观察各组大鼠肺组织病理形态(200×)

2.4 各组大鼠肺组织TRPV1表达 与健康组相比,模型组大鼠肺组织中TRPV1蛋白含量明显增加(P<0.05),与模型组相比,治疗组与对照组TRPV1蛋白含量明显降低(P<0.05),见图4A、B。

图4 各组大鼠肺组织TRPV1表达

2.5 各组大鼠肺组织NF-кB、IкB蛋白表达 与健康组相比,模型组大鼠肺组织中NF-кB蛋白表达升高、IкB蛋白表达降低(P<0.05);与模型组相比,治疗组与对照组NF-кB表达降低、IкB表达升高(P<0.05);NF-кB、IкB在治疗组与对照组中的表达无差异(P>0.05),见表3、图5。

表3 各组大鼠NF-кB、IкB蛋白表达对比

图5 免疫印迹检测各组大鼠NF-кB、IкB蛋白表达对比

3 讨论

CARAS会使气道通气阻力增加,其在发病过程中会释放大量炎性介质,此时机体会产生大量的氧自由基。氧自由基会造成机体细胞及组织等损伤,增加自由基的产生,从而导致SOD等拮抗物消耗增加,引发脂质过氧化反应使得MDA增加,形成恶性循环损伤气道,从而加重炎性反应,致使气道炎症发生[12]。因此,清除过多的氧自由基和氧化反应产物对CARAS的治疗至关重要。研究发现,活性氧能够激活PI3K/AKT信号通路,促进转录因子,如NF-кB的激活[13]。NF-кB激活后诱导白介素-4等促炎细胞因子的表达,导致气道纤维化,平滑肌细胞增殖等进一步加重哮喘。本实验结果显示,与健康大鼠相比,模型大鼠体内SOD表达降低、MDA升高,在经过PI3K抑制剂LY294002干预后SOD表达升高、MDA降低,且为了验证实验的准确性,本文运用治疗过敏性鼻炎-哮喘综合征较为成熟的药物布地奈德进行对比,发现治疗组与对照组SOD、MDA表达对比无意义,提示LY294002具有维持氧自由基生成与清除的动态平衡,可能是治疗CARAS的作用机制。

TRPV1可对多种有害刺激做出反应[14]。TRPV1可增加咳嗽的敏感性,与咳嗽反应强度呈正相关。当呼吸道受到感染后前列腺素E2合成增加并与其受体结合,通过相关蛋白转导,活化TRPV1通道。氧化应激反应时刺激TRPV1的主要因素。被活性氧消化还原的谷胱甘肽可增加蛋白激酶C的活化,活化的该指标可磷酸化TRPV1,TRPV1活化后导致神经末梢释放神介质如SP增加,SP增加会刺激气道引起咳嗽[15]。丁惠娟等[16]研究提示,在坐骨神经慢性结扎损伤模型中,PI3K/Akt通过上调TRPV1的表达,参与CCI致神经病理性疼痛的形成。Liu等[17]在对脑损伤大鼠的实验研究中提出,通过刺激通过TRPV1表达后可激活PI3K/Akt信号通路,从而诱导脑损伤,抑制TRPV1表达后,PI3K/Akt激活受到抑制,有助于缓解脑损伤严重情况。上述研究均提示,PI3K/Akt通路与TRPV1可相互调节,具有一定的相关性。本实验结果显示,与健康大鼠相比,模型大鼠TRPVV1表达显著增加,在经过给予PI3K抑制剂LY294002后,TRPV1表达显著下降,提示LY294002可抑制TRPV1表达,从而降低过敏性鼻炎-哮喘综合征大鼠气道神经源性炎症,最终达到治疗该病的效果。

过敏性炎症中多种因素均可刺激TSLP表达,其中NF-кB通路是调控TSLP表达的重要机制[18]。研究提示,TNF-α通过刺激NF-кB通路,从而诱导气道上皮细胞分泌TSLP;IкB升高或NF-кB信号抑制剂干预,则减少上皮细胞表达TSLP[19]。另有研究证实,人基因启动子位点含有NF-кB的结合位点是TSLP蛋白表达所必需的[20]。此外,NF-кB通路通过调控相关促炎因子等的表达促进气道上皮细胞中TSLP的表达,最终引起呼吸道炎症产生。在敲除TSLP和过表达TSLP的动物模型上,过表达TSLP肺组织炎性反应增加并伴有气道高反应产生,而在TSLP敲除小鼠肺组织中没有产生明显的过敏性哮喘相关症状。以上结论均提示,NF-кB通路可刺激TSLP表达升高,从而引起肺组织炎症产生,诱发气道高反应性产生。研究还发现,P13K是多种信号通路的关键分子,影响炎性细胞的募集、激活及凋亡等[21]。本实验结果显示,与健康大鼠相比,模型组TSLP、NF-кB升高,IкB降低,在经过PI3K抑制剂LY294002干预后,TSLP、NF-кB降低,IкB升高。刘双等[22]研究提示,AKT通过刺激IкB磷酸化,从而激活NF-кB使其磷酸化,发挥转录调控的作用,从而调控炎症因子的合成和释放。结合上述结论,本研究认为,LY294002通过抑制PI3K水平,降低了NF-кB的活性,并抑制IкB的降解,从而抑制了TSLP的表达,防止气道高反应性的产生,阻滞疾病恶性发展。

4 结论

综上所述,通过抑制TRPV1、TSLP、MDA并促进SOD表达,降低了CARAS大鼠气道神经源性炎症、防止气道高反应性的产生并改善了氧化应激损伤及病理水平,从而发挥治疗作用。