羧肽酶A4调控三阴性乳腺癌干性及上皮-间质转换的机制*

李映东 王铁延 欧琴 章书铭 李文仿

(湖北医药学院附属太和医院1.乳腺甲状腺中心;2.病理科,湖北 十堰 442000)

乳腺癌被分为luminal A,luminal B,人表皮生长因子受体2(HER-2)和三阴性乳腺癌(Triple negative breast cancer,TNBC)等不同分子亚型[1]。TNBC以ER、PgR、HER2的缺失为特征,表现出相对的侵袭性表型,治疗抵抗和预后不良特征。TNBC富含癌干细胞(Cancer Stem Cells,CSCs)和上皮-间充质细胞转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)特征,特征是上皮标志物的下调和出现具有间充质表型的高侵袭、迁移能力[2]。羧肽酶A4(CPA4)催化释放羧基端氨基酸,其过表达有与肝癌、肺癌的等癌症发展有关[3]。最近研究表明CPA4与p53表达呈负相关,抑制CPA4可减少具有干细胞特征的乳腺癌细胞数量,可能是TNBC治疗的一个潜在靶点[4]。然而,很少有研究探讨CPA4在TNBC患者的表达及临床病理因素关系。本研究的目的是阐明TNBC中CPA4表达与干性及EMT的关系,为此进行免疫组化评估TNBC中CPA4表达与临床病理标志物,包括干性蛋白醛脱氢酶1(ALDH1)、NANOG,EMT相关蛋白e-钙粘蛋白(E-cadherin)、Vimentin、EGFR等表达关系。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集我院2019年1月-2021年10月手术切除经临床病理诊断确诊的TNBC早期患者168例,同期非TNBC共40例,同期乳腺包块切除后诊断乳腺增生组织20例。其中年龄29～73岁,平均(52.28±4.12)岁,肿瘤<2 cm者53例,肿瘤≥2 cm者115例,年龄≤50岁共107例,年龄>50共61例。纳入标准:①患者经穿刺病理活检确诊为乳腺癌。②患者病理标本检测均显示ER、PgR及HER-2表达阴性。③男性乳腺癌除外。④患者入院前未接受任何形式的手术治疗、放疗或化疗。⑤所有患者确诊时均经肺部及颅脑CT、骨扫描、肝胆B超等排除远处转移。排除标准:①合并存在其他严重器质性病变或脏器功能不足。②合并存在其他恶性肿瘤。③精神疾病患者,无法有效配合研究的开展。肿瘤大小、淋巴结转移、组织学分级情况,是否新辅助化疗等情况根据病理资料及患者病历记载资料。

1.2 设备与试剂 采用免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结(Streptavidin-perosidase,SP)法检测相对蛋白表达。CPA4(货号:RMA-0807)、EGFR抗体(货号:RMA-0804)均购自福州迈新生物技术开发有限公司,E-cadherin(货号:ab1416)抗体购自Abcam公司,ALDH1A1(货号:54135S)、NANOG(货号:4903S)、Vimentin(货号:46173SF)购自Cell Signal公司。SP试剂盒及二氨基联苯胺(Diaminobenzidine,DAB)试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫组化染色方法 采集患者肿瘤组织部位标本,应用10%甲醛溶液进行石蜡包埋处理后连续切片。对切片标本进行脱蜡水化处理和微波修复抗原处理,参照诺丁汉联合组织学分级标准[5],将TNBC分为1、2、3级[6]。

1.3.2 免疫组化染色结果判读 石蜡切片厚4 μL,切片二甲苯脱蜡,枸橼酸钠溶液抗原修复液98 ℃持续15 min修复抗原,兔抗人CPA4单克隆抗体(1∶100)4 ℃过夜,切片用PBS冲洗,与辣根过氧化酶标记的二抗孵育,DAB检测,苏木素染色,最后由两名专业病理学家进行评估。记录染色强度为阴性至强(0～3),阴性(0分),弱阳性(1分),中等阳性(2分),强阳性(3分)。染色阳性面积评分0分(<10%);1分(10%～25%);2分(26%～50%);3分(51%～75%);4分(>76%)。染色面积评分×染色强度评分为最终得分,得分≥4判断阳性,<4判断阴性[7]。NANOG,E-cadherin,Vimentin参考CPA4染色方法判断[7]。ALDH1主要定位于细胞浆,染色细胞总数>10%判断阳性[8]。EGFR肿瘤细胞胞质或胞膜着色即判为阳性(+),否则判为阴性(-)[5]。

1.4 si-CPA4转染 设空白对照组、无效干扰组及si-CPA4组。设计小分子靶向CPA4的核苷酸序列siRNA:5′-GCAGCACGGC AGTCTTTGAGT-3′,序列由上海生工合成,无效干扰RNA为不靶向作用任何mRNA的小分子核苷酸序列(siRNA NC),序列为:5′-UUCUCCGAACGU GUCACGU-3′。CPA4的siRNA按照转染Lipofection 200说明,转染乳腺癌细胞MDA-MB-231。

1.5 MTT细胞增殖实验 MDA-MB-231细胞在96孔板上,实验分为空白对照组,无效干扰组及si-CPA4组,转染24 h后每孔6.0×103细胞在37 ℃,5% CO2条件下培养在10%胎牛血清的DMEM中。用无菌3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)20 μL(5mg/ml;Sigma, USA),在37 ℃下放置4 h,然后去除培养基,加入150 μL的二甲亚砜(DMSO),充分混合10 min,测量490 nm处的光谱吸光度。每组在每个时间点设3个重复孔,实验独立重复3次。用490 nm处的吸光度随时间变化绘制了生长曲线。

1.6 细胞克隆形成 乳腺癌细胞系MDA-MB-231培养在6孔板,按最终浓度为100 nM的CPA4组或siRNA NC组及空白对照组,转染24 h后,96孔板每孔接种1000个细胞,连续培养10 d,结晶紫染色,计算克隆数。

1.7 细胞成球实验 实验分为空白对照组、无效干扰组及si-CPA4组,转染24 h后以2000细胞/孔种植24孔板,用含B27(A1895601,Thermo Fisher Scientific),20 ng/mL EGFR (PV4289,Thermo Fisher Scientific),20 ng/mL FGF (PHG 6015,Thermo Fisher Scientific)的DMEM/F12培养10 d,计数细胞成球数目。

1.8 细胞划痕实验 实验分为空白对照组、无效干扰组及CPA4组。将MDA-MB-231细胞无血清培养24 h,在6孔板中每孔铺1×106个细胞。按照转染Lipofection 2000说明,转染乳腺癌细胞MDA-MB-231,48 h后用10 μL无菌枪头划痕,24 h后观察细胞迁移,计算每组细胞迁移距离。

1.9 细胞侵袭实验 将MDA-MB-231细胞无血清培养24 h,实验分为空白对照组、无效干扰组及si-CPA4组。转染乳腺癌细胞,48 h后用Matrigel涂布8 mm孔的Transwell小室,将5×105个细胞铺到细胞小室中,在下面的孔板上加入含有10% FBS的培养基,在24 h后用棉签将没有侵袭的细胞轻轻刮走,4%多聚甲醛固定,结晶紫染色,对染色的细胞进行统计分析。

1.10 蛋白质印迹法检测ALDH1A1、NANOG、E-cadherin、Vimentin蛋白 利用RIPA裂解液获得MDA-MB-231细胞的蛋白,吸取50 μg蛋白进行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳,将其转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜,经5%脱脂牛奶封闭1 h。4 ℃加入CPA4、ALDH1A1、NANOG、E-cadherin、Vimentin蛋白抗体(均为1∶1 000 稀释)孵育,次日加入二抗孵育2 h,显影,以GAPDH为内参,分析蛋白条带灰度值。

1.11 统计学分析 采用SPSS 17软件进行统计学分析,乳腺癌及乳腺增生组织中CPA4表达差异采用四格表χ2检验,CPA4表达与乳腺癌临床病理特征关系采用四格表χ2检验。MDA-MB-231细胞克隆形成,细胞成球及侵袭、迁移实验结果采用t检验,P<0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TNBC中CPA4表达临床特点 CPA4阳性表达表现为在细胞膜中见棕黄色颗粒,168例TNBC患者中CPA4阳性表达率为57.14%(96/168),见图1A、B。非TNBC乳腺癌组织中表达阳性率为37.5%(15/40),而在乳腺增生组织中表达阳性率为20%(4/20),见图1C、D。TNBC组织中CPA4表达明显高于非TNBC,差异有统计学意义(P<0.05),TNBC中CPA4表达明显高于乳腺增生组织,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

图1 TNBC、乳腺增生组织中CPA4的免疫组织化学图(200×)

表1 TNBC、Non-TNBC及乳腺增生组织中CPA4表达[n(×10-2)]

2.2 CPA4表达在TNBC中与患者临床病理特征的关系 168例TNBC中CPA4表达与患者年龄、绝经状态、脉管浸润、肿瘤大小、组织学分级、TNM分期差异均无统计学意义(P>0.05)。CPA4阳性组淋巴结转移率为59.4%,CPA4阴性组淋巴结转移率为38.9%,差异具有统计学意义(P<0.005)。CPA4阳性组Ki-67为84.4%,而CPA4阴性组Ki-67为70.8%,差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 CPA4表达与三阴性乳腺癌临床病理特征关系[n(×10-2)]

2.3 TNBC中CPA4表达与干性及EMT标志的关系 TNBC中干性标志ALDH1表达阳性率16.68%(28/168),NANOG表达阳性率32.14%(54/168),见图2。而EMT相关标志E-cadherin阳性率为50.0%(84/168),Vimentin阳性率为45.83%(77/168),EGFR阳性率为65.48%(110/168),见图3。168例TNBC中CPA4表达与患者ALDH1无关(P>0.05),但与NANOG、E-cadherin、Vimentin、EGFR差异有统计学意义(P<0.05),见表3。

图2 TNBC中ALDH1、NANOG的免疫组织化学图(200×)

图3 TNBC中E-cadherin、Vimentin的免疫组织化学图(200×)

表3 TNBC中CPA4表达与干性及EMT标志的关系[n(×10-2)]

2.4 siRNA沉默CPA4抑制乳腺癌细胞增殖、克隆形成及干性成球 siRNA沉默乳腺癌细胞MDA-MB-231中CPA4表达,Q-PCR及Western Blot显示si-CPA4明显抑制MDA-MB-231中CPA4的mRNA及蛋白表达,见图4A、B。MTT实验提示细胞增殖受到抑制。克隆形成实验提示CPA4沉默组细胞克隆形成能力降低,细胞成球实验显示CPA4沉默组细胞成球能力降低,见图4D、E。

图4 siRNA沉默CPA4抑制乳腺癌细胞增殖、克隆形成及干性成球

2.5 siRNA沉默CPA4抑制乳腺癌细胞侵袭、迁移、干性及EMT相关蛋白表达 划痕实验提示si-CPA4抑制MDA-MB-231迁移,细胞侵袭实验提示si-CPA4抑制MDA-MB-231侵袭。Western Blot提示si-CPA4抑制干性蛋白ALDH1、NANOG表达,并抑制EMT相关蛋白Vimentin表达,促进E-cadherin表达。见图5。

3 讨论

TNBC有高转移、易复发,预后较差的临床特点,缺乏内分泌治疗及靶向治疗点,临床治疗面临较大困难[9]。本研究发现CPA4在TNBC中表达率为57.14%,但CPA4在非TNBC乳腺癌及乳腺增生组织中的表达显著减少。CPA4与TNBC患者干性蛋白NANOG干性标志物高表达有关,CPA4在TNBC组织中与低E-cadherin表达,但与Vimentin、EGFR高表达有关,表明TNBC中CPA4可能与肿瘤干性进展及EMT相关,是重要的CSCs和EMT调节因子。

肿瘤组织中极少量致瘤性细胞亚群具有无限增殖的潜能,在启动肿瘤形成和维持生长中起决定性作用,是肿瘤形成的起始细胞,也称为肿瘤起始细胞(tumor initiating cells,TICs)[10]。CSCs处于休眠状态,却在肿瘤的发生、进展、转移及复发中发挥关键作用[11]。CPA4促进了肝癌干性蛋白CD133、ALDH1及CD44表达,食管癌中CPA4也可调控ALDH1表达,表明CPA4在恶性肿瘤干性中发挥一定作用[12-13]。TNBC富含干细胞,是其容易复发、转移的重要原因,ALDH1参与了乳腺癌干性进展[14]。本研究发现TNBC中CPA4阳性组有更高的ALDH1表达,可能参与TNBC干性调控。NANOG是癌细胞干细胞样相关蛋白,导致肿瘤生长扩张、自我更新、转移形成和肿瘤复发[15]。本组研究发现TNBC中CPA4表达与NANOG相关,CPA4阳性组有更高的NANOG表达。沉默CPA4抑制TNBC细胞干性成球,抑制干性蛋白ALDH1及NANOG表达,进一步表明CPA4可能参与TNBC干性调控。

上皮-间质转化是细胞可塑性发展、分化、癌细胞迁移和肿瘤转移的关键步骤之一[16]。EMT是上皮细胞获得迁移能力的有效方式,也是占成体恶性肿瘤90%的上皮腺癌浸润和转移的重要途径[17]。EMT型细胞具有浸入基底膜能力和细胞骨架改变便于细胞移动等变化,增加细胞浸润和移动能力、增加抗凋亡信号,成为循环肿瘤细胞(Circulating tumor cells,CTCs),获得转移和浸润能力[18]。肿瘤细胞经历EMT获得浸润特性,易于浸入细胞基质,有利于肿瘤进展和转移[19]。本研究表明CPA4与低E-cadherin、高Vimentin表达有关,沉默CPA4抑制MDA-MB-231的Vimentin表达,表明CPA4参与TNBC的EMT调控。最近,EGFR通路参与TNBC侵袭、转移及干性进展中逐步受到重视,可能作为TNBC新的有效的辅助治疗靶点[20]。本组研究表明CPA4与TNBC中EGFR相关,可能协同促进TNBC恶性进展。

另外,本研究表明沉默CPA4的显著抑制MDA-MB-231细胞增殖,抑制克隆形成。以往的数据也表明CPA4通过调控AKT/c-MYC通路,激活STAT3及ERK中发挥一定作用,参与调控非小细胞肺癌等肿瘤增殖[21-22]。

4 结论

本研究表明CPA4在TNBC干性进展及EMT转换过程中可能发挥一定作用,在TNBC增殖、转移、干性进展等方面具有一定价值,需要进一步阐明TNBC中CPA4分子机制。