P300/CBP相关因子在BCa细胞DNA损伤修复与肿瘤干细胞干性维持中的作用*

李挺云 周治彦 周邦奋 王声兴 梁培育

(海南医学院第一附属医院泌尿外科,海南 海口 570102)

膀胱癌(Bladder carcinoma,BCa)是常见的泌尿系统恶性肿瘤之一,其全球发病率不断上升,每年约有43万例新诊断病例[1-2]。尽管目前手术、放化疗等的BCa治疗方法不断优化,但患者的5年生存率仍不理想[3]。Bca发生发展的生物学机制尚未明确,因此,迫切需要深入研究其分子机制,以便探索早期诊断标志物和开发基于靶标治疗的新策略。P300/CBP相关因子(P300/CBP-associated factor,PCAF)是一种具有内在组蛋白乙酰转移酶活性的转录共激活因子,属于GCN5相关的N末端乙酰转移酶超家族成员,通过乙酰化组蛋白和非组蛋白途径参与基因的转录调控,进而影响细胞增殖、分化、凋亡、肿瘤发生及DNA损伤修复等生理病理过程[4-5]。目前,已发现PCAF与多种恶性肿瘤的发生发展存在联系,如肺癌、乳腺癌、神经母细胞瘤及白血病等[6-8]。然而,关于其与膀胱癌细胞DNA损伤修复以及肿瘤干细胞干性维持的作用关系报道鲜少。因此,本研究通过使用顺铂处理构建人膀胱癌细胞系5637 DNA损伤模型,经过病毒转染下调PCAF的表达,以研究其在膀胱癌细胞DNA损伤修复过程中的作用,以及对肿瘤干细胞干性的影响,为膀胱癌相关分子的诊疗研究提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 人膀胱癌细胞系5637购自中国上海中科院细胞库,顺铂(cisplatin,DDP)购自齐鲁制药,胰岛素、人碱性成纤维生长因子(Human alkaline fibroblast growth factor,bFGF)及表皮细胞生长因子(Epidermal growth factor,EGF)购自美国Simga公司,B27购自美国Invitrogen Corp公司,胎牛血清、青霉素、链霉素及RPMI-1640培养基购自美国Gibco公司,MTS试剂盒和彗星实验检测试剂盒购自南京凯基生物技术有限公司,二辛可宁酸(Bicinchoninic acid,BCA)蛋白检测试剂盒、ECL发光液和溴化乙锭购自上海碧云天生物研究所,聚偏氟乙烯(PVDF)膜购自美国Millipore公司,免疫磁珠分选材料购自美国Miltenyi公司,抗体PCAF、γ-H2AX、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、人 67kDa层粘连蛋白受体(Human 67kDa laminin receptor,67LR)、八聚体结合转录因子2(Octamer-binding transcription factor 4,OCT4)、Yes相关蛋白(Yes-associated protein 1,YAP1)、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔及羊抗兔荧光二抗购自英国Abcam公司,Ad-PCAF RNAi及阴性对照Ad-GFP腺病毒由上海吉凯基因有限公司构建(Ad-PCAF RNAi正义链:UCGCCGUGAAGAAAGCGCA,反义链:UGCGCUUUCUUCACGGCGA;Ad-GFP正义链:UUCUCCGAACGUGUCACGU,反义链:ACGUGACACGUUCGGAGAA)。

1.2 细胞培养与病毒感染 人膀胱癌细胞系5637复苏后,添加含有10%胎牛血清、1%青霉素与链霉素的RPMI-1640培养基,置于5%CO2、37 ℃细胞培养箱中培养,待融合度达80%时消化,常规传代培养。实验分组为对照组(细胞正常培养)、Ad-GFP组(以阴性对照Ad-GFP腺病毒转染细胞)、Ad-PCAFi组(以Ad-PCAF RNAi腺病毒转染细胞)。将对数生长期的5637细胞以1×105个/孔的密度接种于六孔板中,置于细胞培养箱过夜培养,弃去培养液,PBS清洗细胞,在细胞孔内加入病毒液,感染复数(Multiplicity of infection,MOI)为50,转染细胞4 h后,弃去含病毒的培养液,换用10%胎牛血清的培养液继续培养。

1.3 Western blot 收集各组5637细胞,加入预冷的RIPA裂解液,置于冰上充分裂解,以12 000 r/min离心5 min,弃沉淀留取上清,BCA法测定蛋白浓度,制备10% 聚丙烯酰胺凝胶,等量蛋白上样后通过电泳分离,将分离蛋白转移至PVDF膜上,TBST洗膜,将膜在5%山羊血清中封闭2 h,洗涤后加入一抗,4 ℃孵育过夜。次日,TBST洗膜,加入二抗,室温孵育2 h,洗膜后滴加ECL显影液,以GAPDH为内参,QuantityOne软件统计蛋白条带灰度值,计算蛋白表达水平。

1.4 顺铂诱导细胞DNA损伤 将各组5637细胞以每孔5×103个的密度铺到96孔板上,5%CO2、37 ℃细胞培养箱培养24 h后,分别使用不同剂量(0、20、40、60、80、100 nmol/L)的顺铂刺激细胞4 h,MTS法检测细胞存活情况。按照每孔150 μL培养基添加30 μL MTS试剂的比例添加试剂,放回细胞培养箱继续孵育3 h,取出96孔板拿出,酶标仪检测各孔细胞490 nm处的吸光度值,绘制各组细胞生长曲线。

1.5 免疫荧光染色实验 将各组5637细胞铺到含盖玻片的24孔板上,密度为每孔1×104个,用预冷的4%多聚甲醛固定15 min,其掉固定液,PBS洗涤细胞,使用含0.1% Triton X-100的PBS封闭液室温封闭30 min,洗净封闭液后,滴加一抗,使处于盖玻片的细胞浸入一抗液中,4 ℃过夜孵育。次日,PBS洗涤后,加入山羊抗兔的荧光二抗于盖破片的细胞面,室温避光孵育1 h,PBS洗涤,取4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)滴加于玻片上,处理10 min后,封片,晾干,通过荧光显微镜观察各组细胞内PCAF与γ-H2AX焦点的形成情况。

1.6 彗星实验 收集各组5637细胞,胰酶消化,PBS洗涤后,调整细胞密度为1×105个/mL,配制低熔点琼脂糖(40 ℃)铺在磨砂载玻片上,盖玻片将胶压平待其凝固。取500 μl细胞悬液与1.5 mL低熔点琼脂糖混匀,铺在载玻片上,待其凝固,放在新鲜的裂解液中,室温裂解2 h,电泳液洗涤,4 ℃过夜。次日,经过电泳20 min(电压25 V,电流300 mA),结束后无菌水洗涤,加1 mg/mL溴化乙锭染色,无菌水洗涤,通过荧光显微镜观察细胞,CASP 1.2.3软件分析各组细胞拖尾现象。

1.7 膀胱癌干细胞分离 以CD44作为肿瘤干细胞标记物进行干细胞分离[9-10]。取培养的5637细胞,PBS洗涤,调整细胞密度为1×108个/mL,取300 μL细胞悬液,加入标记CD44抗体的磁珠和Fc受体,4 ℃避光孵育30 min,PBS洗涤,离心后以PBS重悬细胞,润洗分离柱,加入细胞悬液使其完全通过分离柱,移出分离柱后添加PBS润洗,收集洗脱细胞,通过流式细胞仪分选CD44+细胞,阴性对照组添加同型对照抗体,添加无血清培养基(4 mg/mL胰岛素、1∶50的B27、10 ng/mL bFGF、20 ng/mL EGF),扩大培养,用病毒液感染分选的膀胱癌干细胞。

1.8 细胞成球实验 收集各组膀胱癌干细胞,加入含各生长因子(4 mg/mL胰岛素、1∶50的B27、10 ng/mL bFGF、20 ng/mL EGF)的无血清培养基,吹打分散为单细胞悬浮液,以每孔1×103个的密度铺到96孔板上,置于5%CO2、37 ℃细胞培养箱培养,1周后,通过倒置显微镜观察视野下的细胞球形成情况,以大于50 μm作为一个细胞球,随机选择5个视野计数细胞成球个数。

2 结果

2.1 病毒感染效率测定 5637细胞在转染48 h后,通过荧光显微镜观察拍照可见Ad-GFP组和Ad-PCAFi组细胞均有明显的绿色荧光表达,且两组细胞的转染效率均在90%以上,见图1A。Western Blot法检测转染后5637细胞中PCAF蛋白表达水平,Ad-PCAFi组细胞中PCAF蛋白表达上调,较对照组和Ad-GFP组均显著升高(P<0.05),见图1B。以上结果均说明细胞转染成功。

图1 5637细胞转染效率

2.2 P300/CBP相关因子影响膀胱癌细胞对顺铂的敏感性 5637细胞转染后再经不同浓度顺铂(0、20、40、60、80、100 nmol/L)处理,通过MTS检测细胞活性发现,各浓度下的Ad-PCAFi组细胞活性均显著低于对照组和Ad-GFP组的细胞活性(P<0.05),见图2。说明下调PCAF提高了5637细胞对顺铂的敏感性。结合实验结果,后续选择100 nmol/L顺铂进行研究。

图2 MTS检测各组5637细胞活性

2.3 P300/CBP相关因子影响膀胱癌细胞γ-H2AX焦点形成 通过免疫荧光染色观察各组5637细胞中PCAF和γ-H2AX焦点,可见PCAF和γ-H2AX在细胞核内共定位,对照组和Ad-GFP组细胞内染色较浅,γ-H2AX焦点形成少,而Ad-PCAFi组细胞内染色深,γ-H2AX焦点形成明显增加,见图3。

图3 免疫荧光染色检测各组5637细胞中PCAF和γ-H2AX焦点形成(比例尺:10 μm)

2.4 P300/CBP相关因子影响膀胱癌细胞DNA损伤 彗星图像结果中DNA损伤越多,产生的碎片就越多,彗星尾矩越长。本研究结果显示出对照组和Ad-GFP组的5637细胞呈圆形亮斑,两组细胞拖尾现象均不明显;Ad-PCAFi组细胞呈彗星状,细胞拖尾较长,经统计显示拖尾细胞数目比例和尾距较对照组和Ad-GFP组均显著增加(P<0.05)。见图4。

图4 彗星实验检测各组5637细胞DNA损伤(比例尺:50 μm)

2.5 P300/CBP相关因子影响膀胱癌干细胞干性维持 流式细胞术检测分选前后膀胱癌干细胞的比例,分选前CD44+标记的细胞比例为23%,经过分选后达到93%,CD44+细胞亚群比例明显增多,说明分选获得了较高纯度的膀胱癌干细胞,见图5A;Western Blot法检测分选前后膀胱癌干细胞标记物67LR、OCT4及YAP1蛋白表达情况,检测结果显示分选后细胞内67LR、OCT4及YAP1蛋白水平均明显升高,见图5B。通过细胞成球实验检测膀胱癌干细胞成球情况,可见对照组和Ad-GFP组肿瘤干细胞形成的球体体积大,成球个数多;相较于对照组和Ad-GFP组,Ad-PCAFi组肿瘤干细胞的球体体积变小,成球个数也显著减少(P<0.05),见图6。

图5 膀胱癌干细胞鉴定

图6 细胞成球实验检测各组膀胱癌干细胞成球能力(比例尺:100 μm)

3 讨论

BCa的典型特点是容易复发,因此术后需要及时复查,适当灌注化疗,以降低复发的概率。BCa分为非肌肉浸润性膀胱癌(Non muscle-invasive bladder cancer,NMIBC)和肌肉浸润性膀胱癌(Muscle-invasive bladder cancer,MIBC)两种,NMIBC是最常见的BCa类型,通常可通过开放性的膀胱部分切除术或经尿道膀胱肿瘤电切除进行治疗。尽管多种治疗方法已得到改善,但具有广泛浸润和转移的MIBC的预后仍然很差,治愈率不理想,对于T3期肌肉浸润性膀胱癌,患者的5年生存率仅为40%左右,BCa 细胞通过经历一系列选择性步骤,包括转化、迁移、侵袭、血管化、循环系统内运输,能够在不同器官中的定植[3,11]。BCa仍是临床上的一大难题,探索其潜在治疗靶点和生物标志物对于探索BCa的有效诊疗策略来说十分关键。

以往研究表明,PCAF通过组蛋白或组蛋白的乙酰化调节多种基因和蛋白质的活性,参与许多肿瘤细胞生物学行为过程。Jia等[12]发现 PCAF 在肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)组织中表达下调,在HCC细胞中过表达PCAF可促进细胞自噬并诱导肿瘤细胞发生死亡。Du等[13]研究表明结直肠癌组织中PCAF高表达的患者生存率较低,5-氟尿嘧啶能够通过促进PCAF的降解来增强其在结直肠癌细胞中的细胞毒性。 Wang等[14]研究发现PCAF在5个胃癌细胞系SGC-7901、MKN45、MGC-803、BGC-823和KATO III中均高表达,HAT抑制剂C646通过使p300和CBP失活来抑制组蛋白H3的乙酰化,从而产生抗肿瘤作用。由此可见,PCAF在不同肿瘤类型中可能存在的异常低表达或高表达现象,并发挥促肿瘤发生和抗肿瘤的特性。尿路上皮癌作为最常见的膀胱癌类型,已知p300和CBP在尿路上皮癌中经常发生突变,PCAF在尿路上皮癌细胞系中表达上调[15],由此推测PCAF可能与膀胱癌的发生相关。本研究通病毒转染膀胱癌5637细胞以抑制PCAF表达,来探究其对顺铂诱导细胞DNA损伤修复及该肿瘤干细胞干性的影响。

在每次细胞分裂过程中要进行DNA复制,使染色体均匀地分布在子细胞上,而未能保持DNA完整性可能导致细胞过早衰老或者死亡。细胞中的DNA会不断遭受由内源性和外源性过程引起的损伤,其中内源性来源主要包括自发脱氨、活性氧、S-腺苷甲硫氨酸、醛和活性酶等,外源性来源主要包括紫外线辐射、γ-辐射、烟草烟雾致癌物、酒精和致DNA损伤化学剂[16-17]。肿瘤细胞的 DNA 损伤反应是抗癌治疗的主要目标,许多化学治疗剂都是通过破坏DNA或阻止DNA损伤修复来发挥作用的[18]。因此,揭示参与DNA修复的各种基因与蛋白,以靶向抑制肿瘤细胞DNA损伤修复过程,对于推动肿瘤临床治疗具有重要意义。γ-H2AX为组蛋白 H2A 家族的成员H2AX的磷酸化形式,是DNA损伤反应的核心参与者,可作为DNA双链断裂修复的生物标志物,其焦点形成可反应DNA双链断裂情况以判断细胞DNA损伤修复功能[19]。本研究结果显示,下调PCAF表达提高了5637细胞对顺铂的敏感性,加剧了细胞DNA损伤,同时细胞内γ-H2AX焦点形成增加,由此说明,下调PCAF表达能够抑制5637细胞DNA损伤修复,从而促进该肿瘤细胞发生凋亡。

近年来,具有干细胞样特性的未分化细胞群的肿瘤干细胞被视为膀胱癌高复发的罪魁祸首,也是膀胱癌临床特征和生物学行为复杂的原因之一。肿瘤干细胞对常规治疗如化学疗法、放射疗法和免疫疗法等具有抗性,其诱导对肿瘤群体的选择压力,导致抗性细胞的选择性生长[20-21]。因此,靶向膀胱癌中肿瘤干细胞可能是该疾病治疗的关键步骤。然而,影响膀胱癌肿瘤干细胞化学抗性和干性维持的分子机制仍未完全明确。本研究在下调膀胱癌干细胞中PCAF表达后发现,细胞的成球能力受到了明显抑制,说明PCAF可能参与了膀胱癌干细胞的干性维持。进入21世纪以来,包括膀胱癌在内的多种恶性肿瘤预后极差,而肿瘤干细胞为抗癌治疗提供了新的视角。确定特异性膀胱癌干细胞标志物,分离和鉴定具有自我更新和分化能力的不同类别膀胱癌干细胞的作用,这将为更好地了解与研究膀胱癌分类、预后、治疗以及改善临床结果提供有用信息。

4 结论

本研究揭示了PCAF在顺铂诱导的膀胱癌细胞DNA损伤修复及肿瘤干细胞干性维持中的作用,即下调PCAF可阻止膀胱癌细胞DNA损伤修复过程,增强肿瘤细胞对顺铂的敏感性,并且对肿瘤细胞干性具有抑制作用。但是,具有一种或多种特异性标志物的肿瘤干细胞并不等于整个肿瘤块,因此,实体瘤内干细胞的研究和临床应用都需要考虑细胞与细胞、细胞与基质之间的相互作用,这个过程是十分复杂的,需要强有力的科学探索,以期在肿瘤治疗中发挥更好的作用效果。